222 Acta Phys. 鄄 Chim. Sin., 2010 Vol.26 传统中药补骨脂为豆科植物 Psocaleacorylicolia L. 的果实, 具有补肾壮骨升达脾胃纳气止泻的功效. 其中呋喃香豆素类化合物补骨脂素 (psoralen) 和异补骨脂素 (isopsoralen)

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1 January 物理化学学报 (Wuli Huaxue Xuebao) Acta Phys. 鄄 Chim. Sin., 2010, 26(1): [Article] 补骨脂素和异补骨脂素键合人血清白蛋白的比较何文英 1,* 姚晓军 2 胡之德 2 陈光英 3 ( 1 海南师范大学化学化工学院, 海口 ; 2 兰州大学化学化工学院, 兰州 ; 3 海南省热带药用植物化学重点实验室, 海口 ) 摘要 : 将互为同分异构体的两种植物药活性组分补骨脂素和异补骨脂素作为研究对象, 利用荧光光谱紫外光谱圆二色谱及傅立叶变换红外光谱详细比较研究了这两种香豆素类化合物与人血清白蛋白 (HSA) 的键合作用. 不同光谱的结果定性定量地显示了 HSA 二级结构变化的程度. 依据荧光滴定实验及 Van 忆 thoff 公式求出了反应的热力学参数 ( 驻 H 和驻 S) 的值. 根据修正后的 Stern 鄄 Volmer 和 Scatchard 方程和荧光光谱数据分别求得不同温度 (296, 303, 310 及 318 K) 下药物与蛋白相互作用的结合常数及结合位点数 ; 且根据 F 觟 rster 偶极鄄偶极能量转移理论, 求得药物与 HSA 间的键合距离 ; 利用竞争实验确定了药物在 HSA 上的键合位点为 site II. 从分子水平上揭示了这两种化合物与 HSA 相互作用的机制. 关键词 : 光谱法 ; 补骨脂素 ; 异补骨脂素 ; 人血清白蛋白 ; 键合中图分类号 : O641 Comparison between Psoralen and Isopsoralen Bindingto Human SerumAlbumin HE Wen 鄄 Ying 1,* YAOXiao 鄄 Jun 2 HUZhi 鄄 De 2 CHENGuang 鄄 Ying 3 ( 1 College ofchemistry and ChemicalEngineering, Hainan NormalUniversity, Haikou , P. R. China; 2 College ofchemistry and ChemicalEngineering, LanzhouUniversity, Lanzhou , P. R. China; 3 HainanProvincalKey Laboratory oftropicalpharmaceuticalherb Chemistry, Haikou , P. R. China) Abstract: Twoactivecomponents(psoralenandisopsoralen)ofChineseherbshavingsimilarstructureswerestudied. Acombinationofintrinsicfluorescencespectroscopy,ultraviolet(UV)spectroscopy,circulardichroism(CD),andFourier transform 鄄 infrared (FT 鄄 IR) spectroscopy were used to characterize the binding between the two coumarins and human serumalbumin(hsa).theresultsfromdifferentspectraindicatedqualitativeandquantitativechangesofthesecondary structureofhsa.thethermodynamicfunctions, enthalpies( 驻 H)andentropies( 驻 S), werecalculated from fluorescence titration experiments using Vant 忆 shoff equation. The binding constants and number of binding sites for the drug interactions of both drugswith HSA were evaluated using the relevant fluorescence data at differenttemperatures(296, 303, 310, and 318 K) and applying modified Stern 鄄 Volmer and Scatchard equations. F 觟 rster theory of dipole 鄄 dipole energy transfer was used to determine the distance between the protein residue and the bound drugs. The competitive experiments suggested that psoralen and isopsoralen bound strongly to HSA and the primary binding site for both drugswas located atsite IIofHSA. KeyWords: Spectroscopy; Psoralen; Isopsoralen; Human serumalbumin; Binding Received: July 15,2009; Revised:October9,2009;PublishedonWeb: November17, 鄢 Correspondingauthor. hwylsl 鄄 0706@163.com; Tel: +86 鄄 898 鄄 The projectwassupportedby the National Natural ScienceFoundationofChina( )andNaturalScienceFoundationofHainanProvince, China (209006). 国家自然科学基金 ( ) 和海南省自然科学基金 (209006) 资助项目鬁 Editorial office ofacta Physico 鄄 ChimicaSinica

2 222 Acta Phys. 鄄 Chim. Sin., 2010 Vol.26 传统中药补骨脂为豆科植物 Psocaleacorylicolia L. 的果实, 具有补肾壮骨升达脾胃纳气止泻的功效. 其中呋喃香豆素类化合物补骨脂素 (psoralen) 和异补骨脂素 (isopsoralen) 为主要有效成分, 补骨脂素 (7H 鄄 furo[3,2][1]benzopran 鄄 7 鄄 one, ficusin, 图 1) 又称补骨脂内酯, 补骨烯. 异补骨脂素 (2H 鄄 furo[2,3 鄄 h] 鄄 1 鄄 benzopran 鄄 2 鄄 one, 图 1) 又称异补骨脂内酯, 白芷素. 它们具有抗肿瘤抗菌促进皮肤色素增生治疗增生性病变杀灭白血菌细胞抗衰老和止血等药理作 [1-3] 用. 蛋白质是生命科学的重要研究对象, 也是药物的一种非常重要的运输载体, 研究药物与蛋白质的相互作用已成为生命科学化学和临床医学研究领 [4] 域的重要课题之一. 国外对药物与蛋白质结合反应 [5] 研究较早, 国内化学工作者在这方面的研究有十余 [6,7] 年的历史, 但大多主要研究的是西药与蛋白质的相互作用, 而对中药活性组分与蛋白质的相互作用研究较少. 近年来, 研究者从不同角度对小分子与蛋白质之间的相互作用进行了广泛的研究, 主要的实验手段如紫外鄄可见吸收光谱荧光光谱法圆二色谱法激光拉曼光谱法傅立叶变换红外光谱核磁共振法质谱电化学分析法平衡透析法液相色谱 [8] 法微量热毛细管电泳及粘度等方法, 得到了许多关于 HSA 与药物分子作用的信息, 包括结合常数结合位点数结合位置作用力类型以及蛋白质分子在相互作用中结构的变化等有用的信息. 但研究补骨脂素和异补骨脂素与 HSA 相互作用的报道尚未见到. 结构上, 补骨脂素与异补骨脂素为同分异构体, 进行比较性的研究, 对全面阐明小分子化合物与 HSA 的结合规律和机理, 了解植物药的药用机理, 提高植物药用药的科学性合理性, 认识药物配伍禁忌等都有积极作用. 本文利用多种光谱法首次研究补骨脂素与异补骨脂素与 HSA 的相互作用, 确定包括键合常数键合距离及结合位点数等键合参数 ; 从不同的光谱信息定性和定量表征药物影响 HSA 二级结构的程度, 从分子水平上了解药物图 1 补骨脂素和异补骨脂素的结构式 Fig.1 Structures ofpsoralen and isopsoralen 与模型 HSA 的键合反应及作用机理. 1 实验部分 1.1 试剂和仪器 HSA(99%) 和三羟基甲基氨基甲烷 (99.99%) 均购自 Sigma 鄄 Aldrich( 美国 ) 生物技术制品公司.HSA 用 ph 7.40 三羟基甲基氨基甲烷鄄盐酸 (Tris 鄄 HCl) 缓冲溶液配制, 其储备液 (1.5 伊 10-5 mol L -1 )4 益保存于暗处. 补骨脂素 (99.9%) 与异补骨脂素 (99.9%) 购自中国药品生物制品检定所 ( 北京 ), 储备液 (1.0 伊 10-3 mol L -1 ) 用无水乙醇 (99.7%) 配制.Tris 鄄 HCl 缓冲溶液 (ph 7.40) 用 0.20 mol L -1 的 Tris 和 0.10 mol L -1 盐酸配制.pHs 鄄 10A 型酸度计 ( 萧山市科学仪器厂 ) 用于缓冲溶液 ph 值的测定 ; 超级恒温槽 ( 日本岛津 ) 用于控制实验所需温度. 实验用水为二次蒸馏水 ; 其它试剂均为分析纯. 所用仪器为 :RF 鄄 5301PC 型荧光光度计 ( 日本岛津 ); Cintra 鄄 10 e 紫外光谱仪 ( 澳大利亚,GBC); Jasco 鄄 20C 自动记录光谱仪 ( 日本 ); Nexus 670 傅立叶变换红外光谱仪 ( 美国 Nicolet 公司 ), 衰减全反射附件 (ATR), DTGS 检测器,OMNIC52 数据处理软件. 1.2 实验方法荧光光谱测定 : 移取 1.0 ml 1.0 mol L -1 的 NaCl 溶液一定量的 HSA 溶液和补骨脂素与异补骨脂素溶液于 10mL 比色管中, 以 ph7.40 的 Tris 鄄 HCl 缓冲溶液定容. 以 280nm 为激发波长 ( 姿 ex), 扫描 nm 范围的荧光光谱 (1 cm 石英池, 狭缝宽 5nm). 荧光滴定实验 : 移取 0.3 ml 1.0 mol L -1 的 NaCl 溶液和一定体积的 HSA 储备液 (1.5 伊 10-5 mol L -1 ) 适量的 Tris 鄄 HCl 缓冲溶液 (ph 7.40) 于 1cm 石英池中 ( 三者体积总和为 3.0 ml), 以微量注射器逐次加入不同体积的药物储备液 (1.0 伊 10-3 mol L -1, 累积体积 <100 滋 L), 反应时间为 4min. 对不同的药物鄄 HSA 体系选择不同的激发波长 / 发射波长 ( 姿 ex/ 姿 em), 测定不同温度下体系的荧光强度, 所得实验数据用于结合常数等的计算. 为求得小分子配体与大分子相互作用时不同结合类型的结合常数与结合位点数, 最常用的有两种方法, 一是利用 Scatchard 方程 [9] : r/d f =nk-rk (1) 式中 r 为每个 HSA 分子键合的药物的个数, D f 为游离药物的浓度, n 为结合位点数, K 为结合常数. 以 r/d f 对 r 作图, 可得到 n 和 K.

3 No.1 何文英等 : 补骨脂素和异补骨脂素键合人血清白蛋白的比较 223 [10] 方法二是利用修正的 Stern 鄄 Volmer 方程 : F 0 / 驻 F=1/(fK 忆 [Q])+1/f (2) 式中 F 与 F 0 分别代表有和无猝灭剂时的荧光强度, 驻 F=F 0 -F, K 忆为修正后的 Stern 鄄 Volmer 猝灭常数, [Q] 为猝灭剂 ( 药物 ) 的浓度, f 为校正因子. 同步荧光测定 : 以 230 nm 为激发波长,290 nm 为发射波长 ( 驻姿 =60 nm), 测定加入药物后体系的同步荧光. 药物浓度由 0 增至滋 mol L -1. 标记竞争实验 : 采用荧光滴定法, 固定 HSA 的浓度, 向药物鄄 HSA 体系分别加入一定量的竞争试剂 : 位点 I 的标记试剂为苯基保泰松 (phenylbutazone, PB), 位点 II 的标记试剂为氯灭酸 (fluofenamic acid, FA), 位点 III 的标记试剂为地高辛 (digitoxin,dig), 在激发波长为 280 nm, 发射波长为 337 nm 处测定其荧光强度, 所得数据用来计算键合常数. 紫外吸收光谱用 Cintra 鄄 10 e 紫外可见光谱仪 ( 北京 ) 记录. 移取 1.0 ml 1.0 mol L -1 NaCl 溶液一定量的 HSA 溶液和药物溶液于 10 ml 比色管中, 以 Tris 鄄 HCl 缓冲溶液 (ph 7.40) 定容, 扫描得到紫外吸收光谱 (1 cm 石英池 ). 红外光谱的采集及谱图处理 :4cm -1 分辨率下, 扫描 2048 次收集水汽光谱, 使用 OMNIC52 数据处理软件自动进行水汽校正 ; 室温敞开状态收集背景, 然后将样品均匀地铺满 ATR 的 ZnSe 晶片, 同样分辨率下, 扫描 60 次收集样品光谱. 光谱处理结果, 以谱图在 cm -1 呈一条平滑直线为差减终 [11] 点判据. 圆二色性光谱 (CD) 测定 : 在 10 ml 比色管中依次加入 1.0 ml 1.0 mol L -1 NaCl 溶液一定体积的 HSA 溶液和药物溶液, 以 Tris 鄄 HCl 缓冲溶液 (ph 7.40) 定容. 使用 2mm 石英池, 于室温下测定 nm 波长范围内 HSA 与药物混合前后的 CD 光谱.HSA 的琢鄄螺旋结构含量琢鄄 helice 可利用以下公式计算 [12] : 琢鄄 helice=[(-[ 兹 ] )/( )] 伊 100%(3) 式中 [ 兹 ] 208 为波长在 208 nm 处的摩尔椭圆率,33000 与 4000 为两个常数. 2 结果与讨论 2.1 药物鄄 HSA 体系同步荧光光谱与紫外光谱由于 HSA 中存在色氨酸 (Trp) 酪氨酸 (Tyr) 和苯丙氨酸 (Phe) 三种氨基酸能够产生荧光, 且它们的荧光强度比通常为 100:9:0.5, 因此大多数情况下 Trp 的荧光猝灭常用来表征药物与 HSA 的结合关系及 HSA 形态的变化 [13]. 而色氨酸残基的同步荧光光谱 ( 见图 2a) 通常作为定性判断 HSA 构象变化的依据 [14,15]. 图 2 为药物鄄 HSA 体系的同步荧光光谱图 ( 驻姿 =60 nm), 从图中可看出, 对补骨脂素鄄 HSA 体系, 随着药物浓度的增大, 补骨脂素猝灭了 HSA 的色氨酸残基的荧光, 其最大荧光发射峰从 338 nm 蓝移到 331 nm 左右, 同时发生能量转移, 使得补骨脂素的荧光光谱强度增大 ( 对应图 2A 中 410 nm 附近的一组峰 ), 说明色氨酸残基增加了位于疏水性介质的部分 ; 对异补骨脂素 HSA 体系, 随着药物浓度的增大, 异补骨脂素猝灭了 HSA 的色氨酸残基的荧光, 但是不同于补骨脂素的是, 其最大荧光发射峰于 338 nm 处并未发生明显位移. 以上结果均说明补骨脂素或异补骨脂素的存在使得 HSA 的构象发生了图 2 补骨脂素鄄 HSA 体系 (A) 和异补骨脂素鄄 HSA 体系 (B) 同步荧光光谱图 Fig.2 Synchronous fluorescencespectraofpsoralen 鄄 HSAsystem(A)and isopsoralen 鄄 HSAsystem(B) a-f,[psoralen]or[isopsoralen]/( 滋 mol L -1 )): 0,3.33,6.67,13.33,23.33,30.00,[HSA]=3.0 滋 mol L -1 ;g: [psoralen]or[isopsoralen]=6.67 滋 mol L -1 ; Trisbuffer,pH7.40, T=296 K, 驻姿 =60nm ( 姿 ex=230 nm, 姿 em=290nm)

4 224 Acta Phys. 鄄 Chim. Sin., 2010 Vol.26 图 3 补骨脂素鄄 HSA 体系 (A) 和异补骨脂素鄄 HSA 体系 (B) 的紫外吸收光谱图 Fig.3 UV 鄄 absorption spectraofpsoralen 鄄 HSAsystem(A)and isopsoralen 鄄 HSAsystem (B) b-l,[drug]/( 滋 mol L -1 ):0,3.33,6.67,10, 13.33, 16.67, 20,23.33, 26.67, 30,33.33, [HSA]=3.0 滋 mol L -1 ; a: [drug]=6.67 滋 mol L -1 ;ph7.40, T=296K 一些变化. HSA 的吸收峰 ( 大约 210 nm) 代表琢鄄螺旋结构 [16] 的含量. 图 3 为加入两种药物分子前后 HSA 的紫外吸收光谱. 如图 3A 所示,HSA 在 208 nm 处有一强吸收峰, 加入补骨脂素后 HSA 的吸收增加, 在约 245 nm 处吸收渐渐增大, 并在 nm 之间表现较典型的双峰现象 ; 而补骨脂素的紫外吸收光谱从 287 红移至 295nm. 图 3B 显示相似的现象, 即异补骨脂素的加入也导致 HSA 的吸收增加, 但没有明显的双峰现象, 在约 245 和 292 nm 处药物的吸收强度渐渐增大 ; 当药物的浓度更高时, 异补骨脂素的紫外吸收光谱从 282 红移至 301 nm. 比较图 3 可看出 :HSA 中加入补骨脂素后在 nm 范围内出现双峰而加入异补骨脂素则没有, 可能是由于药物本身的吸收差异引起的. 总之这两种现象清楚地显示出两种药物均与 HSA 产生相互作用并影响 HSA 的琢鄄螺旋结构, 2.2 药物鄄 HSA 体系圆二色谱与红外光谱圆二色谱与红外光谱法是两种考察蛋白质二级结构非常有利的手段. 图 4 为药物鄄 HSA 体系的圆二色谱图. 由图 4 可以看出 HSA 在 208 及 217 nm [8] 处有负的 Cotton 效应, 此为典型的琢 + 茁螺旋结构. 而药物的加入使 HSA 在 208 nm 处的负 Cotton 效应减小, 且 208 与 217 nm 处的负 Cotton 效应的比值减小, 而位置未发生变化, 由公式 (3) 计算结果表明加入两种药物后使得 HSA 的琢鄄螺旋结构含量发生了变化 ( 表 1). 但是这两个体系所表现出的 CD 图的形状却没有太大的变化, 可认为体系中的 HSA 二级结构还是以琢鄄螺旋结构为主. 由于蛋白质红外光谱的酰胺 I 带主要来源于其 Fig.4 图 4 补骨脂素鄄 HSA 体系 (A) 和异补骨脂素鄄 HSA 体系 (B) 的圆二色谱图 CDspectraoftheHSA 鄄 psoralen system(a)and HSA 鄄 isopsoralen system(b) [ 兹 ]: molarellipticity; [HSA]=3.0 滋 mol L -1 ;(A)[psoralen]/[HSA]: (a)0 颐 1, (b)1 颐 1,(c)2 颐 1, (B)[isopsoralen]/[HSA]:(a)0 颐 1, (b)1 颐 1;pH7.40, T=296 K

5 No.1 何文英等 : 补骨脂素和异补骨脂素键合人血清白蛋白的比较 225 表 1 HSA 以及它的复合物体系在 Tris 缓冲液 (ph7.40) 和 296K 下不同摩尔浓度组成时的二级结构 Table1 Secondarystructuredetermination for thefreehsa and itscoordination compoundsintris buffer (ph7.40)atdifferentmolarconcentration ratiosand T=296K Different concentration ratio Amide Icomponent 茁鄄 turn (%) a 琢鄄 helice (%) b 茁鄄 sheet (%) c 琢鄄 helice (%) d HSA [psoralen] 颐 [HSA]=1 颐 [psoralen] 颐 [HSA]=2 颐 [psoralen] 颐 [HSA]=4 颐 [isopsoralen] 颐 [HSA]=1 颐 [isopsoralen] 颐 [HSA]=2 颐 [isopsoralen] 颐 [HSA]=4 颐 a in cm -1 (IR); b in cm -1 (IR); c in cm -1 (IR); d from CDresults 氨基酸残基的 C 襒 O 伸缩振动吸收, 各种不同的二级结构与羰基和氨基之间形成的氢键有关, 酰胺 I 带为琢鄄螺旋茁鄄折叠无规卷曲和转角等不同结构振 [17] 动峰的加合带. 图 5 为加入不同浓度的药物前后 HSA 的红外谱差谱图. 可看出, 补骨脂素或异补骨脂素与 HSA 的相互作用使 HSA 的酰胺 I 带 ( cm -1 ) 和酰胺 II 带 ( cm -1 ) 处的峰发生了不同程度的移动 ; 而且与不加药物时 HSA 的谱图形状相比, 峰形状也有不同的改变. 表明药物分子均与 HSA 分子发生了相互作用, 并使 HSA 的二级结构发生了变化, 这可能是由于 :(1) 药物分子与 HSA 分子中的 C 襒 O 和 C N 或 N H 基团发生了相互作用 ;(2) 药物分子与 HSA 分子的多肽链之间形成了氢键. 将得到的红外差谱用二阶导数去卷积技术进行处理, 定量地分析 HSA 分子中二级结构的各个组 [18] 分. 可得到不同药物鄄 HSA 体系的二阶导数谱去卷积谱和曲线拟合结果 ( 均未列出 ), 也可计算出这两种药物对 HSA 二级结构的影响变化值. 从实验得到的数据及图谱可看出, 这两种药物对 HSA 的键合作用, 表现在谱图上的信息是红外光谱谱图的形状与峰位置发生了改变 ; 表现在定量测定的结果上是相比不加药物的 HSA 中, 琢鄄螺旋含量都有所降低, 这不仅对补骨脂素鄄 HSA 还是异补骨脂素鄄 HSA 体系都有相同的趋势, 而且与用圆二色谱测量得到的结果趋势相一致. 2.3 补骨脂素和异补骨脂素对 HSA 的荧光猝灭机理通过检测加入药物前后 HSA 的内源荧光强度, 可得知药物与 HSA 相互作用的情况以及 HSA 形态的变化. 图 6 为 HSA 药物及不同浓度的药物与 HSA 混合后的荧光光谱, 可看出, 对补骨脂素鄄 HSA 或异补骨脂素鄄 HSA 体系, 当未加入药物时, 激发波长 ( 姿 ex) 为 280 nm 时,HSA 的最大发射波长 ( 姿 em) 均为 337 nm, 此时 HSA 的荧光主要来自色氨酸残基. 图 6A 表明, 随着补骨脂素浓度的增大, 出现了明显的图 5 补骨脂素鄄 HSA 体系 (A) 和异补骨脂素鄄 HSA 体系 (B) 的红外差谱图 Fig.5 DifferentFT 鄄 IRspectraofpsoralen 鄄 HSA(A)and isopsoralen 鄄 HSA(B) (a)ft 鄄 IRspectrum ofhsa,(b-d)ft 鄄 IRdifferencespectraofHSAobtainedby subtractingthespectrum ofthe drug 鄄 free form from that ofthedrug 鄄 bound formintheregion of cm -1 ;(b)[drug]/[hsa]=1 颐 1, (c)[drug]/[hsa]=2 颐 1, (d)[drug]/[hsa]=4 颐 1; [HSA]=30.0 滋 mol L -1, ph=7.40, T=296 K

6 226 Acta Phys. 鄄 Chim. Sin., 2010 Vol.26 图 6 补骨脂素鄄 HSA 体系 (A) 和异补骨脂素鄄 HSA 体系 (B) 的荧光光谱图 Fig.6 Fluorescencespectraofpsoralen 鄄 HSAsystem(A)and isopsoralen 鄄 HSAsystem(B) a-j, [HSA]=3.0 滋 mol L -1,[psoralen]or[isopsoralen]/( 滋 mol L -1 ):0,3.33,6.67,10.00,13.33, 16.67, 20.00,23.33,26.67,30.00; k: [psoralen]or[isopsoralen]=6.7 滋 mol L -1 ; T=296K; ph7.40; 姿 ex=280nm, 姿 em=337 nm 荧光双峰现象 ; 补骨脂素的存在使 HSA 的荧光强度降低, 且体系中 HSA 的最大发射峰从 337 nm 蓝移到 331 nm 左右, 这表示在加入药物补骨脂素后, HSA 的微环境发生了变化, 使其变得更加疏水. 而对于补骨脂素来说,HSA 的存在使它的荧光强度增大, 最大发射峰从 452 nm 红移到 447 nm 处, 同时在 399 nm 处出现一个等发射点, 这是补骨脂素与 [19] HSA 形成配合物的有力证据, 也表明在等发射点处存在游离药物与键合药物之间的平衡态. 图 6B 为异补骨脂素鄄 HSA 体系的荧光光谱图, 在药物浓度加大时, 猝灭了 HSA 的荧光强度, 也有明显的荧光双峰现象, 且体系中 HSA 的最大发射峰从 337 nm 轻微红移到 340 nm, 而异补骨脂素的最大发射波长处 (452 nm) 的荧光强度增大, 在 405 nm 处出现一个等发射点, 这表示在加入药物异补骨脂素后, 异补骨脂素与 HSA 的相互作用使 HSA 的发色团的微环境发生了变化, 使其疏水性减小. 以上结果均表明补骨脂素或异补骨脂素都与 HSA 间发生相互作用, 生成不发荧光的基态配合物, 从而猝灭了 HSA 内色氨酸残基的荧光, 并同时发生了能量转移. 荧光分子与猝灭剂之间的猝灭效率都遵循着 [20] Stern 鄄 Volmer 方程 : F 0 /F=1+K q 子 0[Q]=1+K SV [Q] (4) 式中, K q 是双分子猝灭常数, 子 0 是没有猝灭剂时激发态荧光体的荧光寿命, K SV 是 Stern 鄄 Volmer 猝灭常数. 为了证明补骨脂素或异补骨脂素对 HSA 的猝灭机理, 在不同温度下作补骨脂素或异补骨脂素对 HSA 荧光猝灭的 Stern 鄄 Volmer 图 ( 未列出 ). 由图及计算结果得知, 在选定的浓度范围内, 随着温度升高, 猝灭曲线的斜率降低, 即随温度升高猝灭常数呈降低趋势, 表明补骨脂素或异补骨脂素对 HSA 的荧 [8] 光猝灭机理均为静态猝灭. 猝灭常数 K SV 值列于表 2 中, 用于计算热力学参数. 2.4 键合常数键合位点数及键合距离的计算分别在与 318 K 四个温度下, 固定 HSA 的浓度而改变药物浓度进行荧光滴定, 根 Table2 表 2 补骨脂素鄄 HSA 和异补骨脂素鄄 HSA 体系的不同键合值和热力学参数比较悦 omparison ofthedifferentbindingvalues and thermodynamicparameters for psoralen 鄄 HSAand isopsoralen 鄄 HSAsystems System T/K 10-4 K SV /(L mol -1 ) 10-5 K/(L mol -1 ) 10-5 K 忆 /(L mol -1 ) n r 忆 /nm 驻 G/(kJ mol -1 ) 驻 S/(J mol -1 K -1 ) 驻 H/(kJ mol -1 ) psoralen 鄄 HSA isopsoralen 鄄 HSA K SV:Stern 鄄 Volmerquenchingconstant; K: obtainedwithmodifiedstern 鄄 Volmermethod; K 忆 :obtainedwith Scatchardmethod; n: bindingsite number; r 忆 :bindingdistance

7 No.1 何文英等 : 补骨脂素和异补骨脂素键合人血清白蛋白的比较 227 图 7 补骨脂素鄄 HSA 体系 (A) 和异补骨脂素鄄 HSA 体系 (B) 的 Scatchard 图 Fig.7 Scatchard plots forthepsoralen 鄄 HAS system(a)and isopsoralen 鄄 HSA system(b) r: thenumberofbound drugperprotein, D f:the concentration ofunbounddrug; [HSA]=3.0 滋 mol L -1,pH=7.40, 姿 ex=280nm, 姿 em=337 nm,trisbuffer 据方程 (1) 及 (2) 线性拟合计算结合常数与结合位点数. 可得到药物鄄 HSA 的 Scatchard 图 ( 图 7) 及修正的 Stern 鄄 Volmer 图 ( 未列出 ), 这些 Scatchard 图及修正的 Stern 鄄 Volmer 图都显示出良好的线性关系, 表明只有一个结合位点, 这与表 2 中所求得的键合位点数一致, 同时由 Scatchard 曲线拟合计算得到的药物与 HSA 的键合常数与由修正的 Stern 鄄 Volmer 方程所得的结果基本一致 ( 见表 2), 这表明测定数据的误差很小. 上述结果均说明药物与 HSA 的结合常数都较大 ( 数量级 ), 即药物与 HSA 有强的结合 ; 而且温度对结合常数的影响较小,HSA 在体内能起到储存和运输药物的作用, 使药物通过血液循环达到作用部位, 起到治疗的效果. 对结合距离的计算, 依据 F 觟 rster 偶极鄄偶极非辐射能量转移理论 :(1) 供能体发射荧光 ;(2) 供能体的荧光发射光谱与受能体的吸收光谱有足够的重叠 ;(3) 供能体与受能体足够接近, 最大距离不超过 7 nm. 若满足这几个条件, 就可以求出药物在蛋白质上的结合位置与蛋白质分子中产生荧光的基团之间 [21] 的距离. 当荧光体与药物分子的光谱特性符合非辐射能量转移条件时, 它们之间就能发生能量转移, 反映在荧光光谱上是荧光体的荧光被部分猝灭, 猝灭的程度取决于荧光体 ( 能量给予体 ) 与猝灭体 ( 能量接受体 ) 间的距离. 图 8 为补骨脂素或异补骨脂素与 HSA 的重叠光谱图. 色氨酸的量子产率为 0.118, 折射指数取水和有机物的平均值 1.336, 取向因子取给体和受体各向随机分布的平均值 K 2 =2/3 [22], 将以上 [22] 各量代入相关公式中, 计算得出 HSA 中色氨酸残基与已结合的补骨脂素和异补骨脂素间的距离 r 忆分别为 2.89 和 3.65nm( 见表 2), 符合能量转移理论, 说明在这两种药物与 HSA 之间均发生了能量转移. 2.5 键合模式的确定 Fig.8 图 8 HSA 的荧光光谱 (a) 与补骨脂素 (A) 和异补骨脂素 (B) 的吸收光谱 (b) 的重叠图 Overlappingbetween thefluorescenceemission spectrumofhsa(a)and absorption UVspectrum(b)of psoralen (A)and isopsorlen(b) [drug]=1.5 滋 mol L -1 ;[drug]/[hsa]=1 颐 1; T=296K

8 228 Acta Phys. 鄄 Chim. Sin., 2010 Vol.26 药物小分子和蛋白质等生物大分子常常借助于疏水作用力静电力氢键和范德华力等非共价键结合形成超分子复合物. 不同药物与 HSA 结合的作用力类型不同, 根据 Van 忆 thoff 定律及公式 (lnk SV =- 驻 H/ RT+ 驻 S/R, R 为气体常数 ) 可求出反应的热力学参数, 进而大致确定其作用力类型, 当温度变化不太大时, 反应的焓变可看作一个常数, 由 lnk 对 1/T 作图 ( 未列 [23] 出 ), 可求得药物与 HSA 相互作用的热力学常数. [24] Timasheff 等根据热力学常数的符号与大小确定了作用力的类型, 从水结构的角度来考虑, 驻 S> 0 通常认为为疏水相互作用, 而且, 水溶液中离子间的静电作用一般是以驻 S>0 与驻 H<0 为标志的, 对于范德华力正好相反, 驻 H 以及驻 S 却均为负值. 负焓在静电作用中可能起一定作用, 但在真正的静电作用中焓变非常小几乎等于零. 表 2 中结果表明, 在补骨脂素或异补骨脂素与 HSA 的相互作用中, 驻 S 为正值, 而且自由能变化主要来源于驻 S 而不是驻 H, 表明键合过程为熵驱动过程, 同时驻 S>0 表明存在疏水作用. 另将紫外吸收光谱法测得的数据, 用有关的公 [25,26] 式进行处理, 可得到药物鄄 HSA 体系的电荷密度啄值, 在实验选定的药物浓度范围 ( 滋 mol L -1 ) 内, 随着药物浓度的增大, 体系的电荷密度啄渐渐增大 ( 补骨脂素鄄 HSA 体系变化范围为 , 异补骨脂素鄄 HSA 体系变化范围为 ), 进一步证明了静电作用也是稳定药物鄄 HSA 体系的一种作用力. 综合上述可得, 补骨脂素或异补骨脂素与 HSA 的结合过程同时存在两种作用力, 主要是疏水作用, 但不能排除静电作用的存在. 2.6 药物在 HSA 上结合位置的确定通过设计竞争实验的方法, 来确定这两种药物在 HSA 上的结合位置. 由于某些药物结合蛋白有特定的位点, 这些药物可以作为其他药物结合位置的探针, 通过探针药物存在时其他药物的结合常数等的变化来判断其结合位置. HSA 能与许多内源或外源物质发生键合作用, 结合常数的范围一般是 mol -1 L [27].HSA 的三维晶体结构显示, 其空间结构由三个结构域组成 : domain I domain II domain III, 每个结构域又含有 A B 两个亚结构域, 以槽口相对的方式形成圆筒状结构, 几乎所有疏水性氨基酸残基都包埋在圆筒内部, 构成疏水腔. 而 HSA 的主要键合区域就位于亚结构域 IIA 和 IIIA 的疏水腔中, 这两个亚结构域 IIA 和 IIIA 显示了相似的化学性质. 序列分析表明 : HSA 分子只含有一个 214 鄄色氨酸残基 (Trp214, 位于 domainii), 大多数药物在 HSA 上的结合部位为亚结构域 IIA 和 IIIA, 即 site I 和 site II. 有研究发现 [28,29], 人血清白蛋白至少有三个特异的高亲和药物结合位点, 分别称为 site I-III. 许多药物对人血清白蛋白的结合具有特异性如苯基保泰松 (PB) 结合于 site I, 氯灭酸 (FA) 结合于 site II, 地高辛 (Dig) 结合于 site III, 这些药物可以用作位置探针. 为此, 本实验选择 PB FA 和 Dig 分别作为 site I site II site III 位的标记药物加入到药物鄄 HSA 体系, 研究竞争试剂与这些药物的竞争结合情况. 在上述三种标记药物存在下, 用修正的 Stern 鄄 Volmer 公式 (2) 处理数据, 原有体系的结合常数发生了变化 (296K), 对补骨脂素鄄 HSA 体系 : K=1.405 伊 10 5 mol -1 L; PB: K=1.173 伊 10 5 mol -1 L; FA: K=0.723 伊 10 5 mol -1 L; Dig: K=1.181 伊 10 5 mol -1 L; 对异补骨脂素鄄 HSA: K=5.979 伊 10 4 mol -1 L; PB: K=4.045 伊 10 4 mol -1 L;FA: K=3.107 伊 10 4 mol -1 L; Dig: K=4.533 伊 10 4 mol -1 L, 可看出, 变化幅度最大的均为 FA 标记物, 这说明 FA 与补骨脂素或异补骨素竞争同一个位点, 或者可以说 HSA 结构域的 IIIA, 即 site II 位. 此外, 从竞争实验得到了良好线性关系 ( 线性相关系数 R 均大于 0.99), 这说明无论对竞争药物还是对补骨脂素或异补骨脂素, 与 HSA 的结合位点数是一个, 再次证实了用 Scatchard 公式 (1) 计算结合位点数 n=1 的结论. 3 结论利用多种光谱法详细研究了两种香豆素类化合物补骨脂素和异补骨脂素与 HSA 的相互作用. 比较荧光光谱法不同的研究结果表明, 这两种药物均对 HSA 的荧光有猝灭作用, 表现为静态猝灭机理 ; 利用荧光滴定实验获得了反应的结合常数结合位点数和热力学参数, mol -1 L 数量级的结合常数显示了两种药物与 HSA 之间有较强的结合, 且补骨脂素或异补骨脂素与 HSA 的结合位点数是 1; 热力学参数表明药物与 HSA 结合的作用力类型主要是疏水作用兼静电作用. 利用 F 觟 rster 能量转移理论计算出药物与 HSA 色氨酸残基之间的距离 r 忆值. 同步荧光光谱与紫外光谱定性地判定了药物影响 HSA 的二级结构 ; 红外光谱及圆二色谱的结果定量地证实了不同药物对 HSA 二级结构含量的影响程度. 通过竞争实验, 确定这两种药物在 HSA 上的结

9 No.1 何文英等 : 补骨脂素和异补骨脂素键合人血清白蛋白的比较 229 合位置均为 siteii 位. References 1 Liu, R. M.; Li, A. F.; Sun, A. L.; Kong, L. Y. J.Chromato. A, 2004, 1057: Dino,J.C.; Ross,S.R. Tetrahedron, 2002, 58: Tarek, M.E.G.; Eman,M.E.G. Spectrochim.ActaA,2003, 59: Chan,W. C.W.; Shuming,N. Science, 1998, 281: Lin,Y. L.; Lin, S.R.; Wu,T.T.; Chang,L.S. Biochem.Biophys. Res.Commun., 2004, 319: Zhang,H.X.; Yan,C.N.; Huang,X.;Liu,Y.; Mei,P. Chemistry& Bioengineering, 2005, 9:4 [ 张华新, 颜承农, 黄星, 刘义, 梅平. 化学与生物工程, 2005, 9:4] 7 Xue,J.;Rao, M.X.; Li,L. Journal of Gannan NormalUniversity, 2002, 3:46 [ 薛, 饶美香, 李蕾. 赣南师范学院学报, 2002, 3:46] 8 Yang,P.; Gao,F.Principlesofbioinorganicchemistry.Beijing: Science Press, 2002: [ 杨频, 高飞. 生物无机化学原理. 北京 : 科学出版社,2002: ] 9 Scatchard, G. Ann.NYAcad.Sci.,1949, 51: Eftink,M.R.;Ghiron,C.A. Anal.Biochem., 1981, 114: Dong, A. C.; Huang, P.; Caughey, W. S.Biochemistry, 1990, 29: Khan, A. M.; Muzammil, S.; Musarrat, J. Int.J.Biol.Macromol., 2002, 30: Tao,W. S.; Li, W.; Jiang,Y.M.Thebasicofproteinmolecules. 2nd ed.beijing: HigherEducationPress,1995: [ 陶慰孙, 李惟, 姜涌明. 蛋白质分子基础. 第二版. 北京 : 高等教育出版社,1995: ] 14 Miller, J. M. Proc.Anal.Div.Chem.Soc., 1979, 16: He, W.Y.; Li,Y.; Si,H.Z.; Dong,Y.M.;Sheng,F.L.; Yao,X. J.; Hu,Z.D. J.Photochem.Photobio.A 鄄 Chem., 2006, 182: Wolfbeis,O. S.; Leiner, M.; Hochmuth,P.; Geiger, H.;Bunsenges, B. Phys.Chem., 1984, 88: Witold, K. S.; Henry, H. M.; Dennis, C. Biochemistry, 1993, 32: Surewicz,K.W.;Mantsch,H.H. Biochim.Biophys.Acta, 1988, 952: Wei, X.F.; Liu, H.Z. ChineseJournalofAnalytical Chemistry, 2000,28: 699 [ 魏晓芳, 刘会洲. 分析化学, 2000, 28: 699] 20 Chen, G.Z. Fluorescenceanalysis.Beijing: Science Press,1990: [ 陈国珍. 荧光分析法. 北京 : 科学出版社,1990: ] 21 Stryer, L. Annu. Rev. Biochem., 1978, 47: Cyril, L.; Earl,J. K.; Sperry,W.M. Biochemistshandbook. London: E&FNEponLed.Press,1961:83 23 Ross, P. D.; Subramanian, S. Biochemistry, 1981,20: Timasheff, S.N. Thermodynamicofproteininteractions. In: Peeters, H.Ed. Proteinsofbiological fluids.oxford: Pergamon Press,1972: Zhang, X.Y.Theoryofchemical analysis.beijing: SciencePress, 1991: [ 张锡瑜. 化学分析原理. 北京 : 科学出版社, 1991: ] 26 WuhanUniversity.Analytical chemistry. Beijing:PeoplePress, 1978: [ 武汉大学. 分析化学. 北京 : 人民出版社,1978: ] 27 Peters, T. All about albumin.newyork: AcademicPress,1996; and referencestherein 28 Sudlow,G.; Birkett, D.J.; Wade,D.N. Mol. Pharmacol., 1976, 12: Sjoholm,I.; Ekman,B.; Kober,A.; Ljungstedt 鄄 Pahlman, I.; Seiving, B.; Sjodin, T. Mol. Pharmacol., 1979, 16: 767

No.2 李晓燕 : 用荧光和共振光散射光谱研究甲硝唑与牛血清白蛋白的相互作用 263 Fig.1 图 1 的同时, 用共振光散射光谱讨论 MET 与蛋白质的结合机理, 发现两种光谱得到的不同温度下 MET 对蛋白质的猝灭常数 K SV 静态猝灭结合常数 K LB 表观结合常数 K A 均在相同的

No.2 李晓燕 : 用荧光和共振光散射光谱研究甲硝唑与牛血清白蛋白的相互作用 263 Fig.1 图 1 的同时, 用共振光散射光谱讨论 MET 与蛋白质的结合机理, 发现两种光谱得到的不同温度下 MET 对蛋白质的猝灭常数 K SV 静态猝灭结合常数 K LB 表观结合常数 K A 均在相同的 262 物理化学学报 (Wuli Huaxue Xuebao) Acta Phys. 鄄 Chim.Sin., 2007, 23(2):262-267 February [Note] www.whxb.pku.edu.cn 用荧光和共振光散射光谱研究甲硝唑与牛血清白蛋白的相互作用李晓燕 * ( 乐山师范学院化学与生命科学系, 四川乐山 614004) 摘要 : 用荧光光谱和共振光散射光谱对甲硝唑与牛血清白蛋白的作用进行了对比研究,

222 Acta Phys. 鄄 Chim. Sin., 2010 Vol.26 传统中药补骨脂为豆科植物 Psocaleacorylicolia L. 的果实, 具有补肾壮骨 升达脾胃 纳气止泻的功效. 其中呋喃香豆素类化合物补骨脂素 (psoralen) 和异补骨脂素 (isopsoralen)

222 Acta Phys. 鄄 Chim. Sin., 2010 Vol.26 传统中药补骨脂为豆科植物 Psocaleacorylicolia L. 的果实, 具有补肾壮骨升达脾胃纳气止泻的功效. 其中呋喃香豆素类化合物补骨脂素 (psoralen) 和异补骨脂素 (isopsoralen)