期齐心等噬菌体 ' 穿孔素 ) 的克隆表达及其活性分析定时间以寡聚体形式聚集于细胞膜上形成稳定的跨膜通道造成细胞膜损伤从而释放细胞内的溶菌酶水解细胞壁中的肽聚糖层引起细菌裂解导致子代噬菌体从宿主菌内释放与噬菌体相比穿孔素溶菌酶系统不受噬菌体宿主谱的限制对细菌具有广谱的裂

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元何
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1 畜牧兽医学报噬菌体 1 穿孔素 &% 的克隆表达及其活性分析齐心陈培培邹玲刘文华任慧英张灿青岛农业大学动物医学院青岛摘要为了研究噬菌体 ' 穿孔素 ) 的特征及其对细菌的抑制作用根据噬菌体 ' 的基因序列设计引物 &6 扩增穿孔素基因并对其序列进行比对和分析构建 ) 原核重组表达质粒 &) 在大肠杆菌 ' 中诱导表达摸索最佳表达条件亲和层析法纯化蛋白质并对其抑菌活性进行测定结果表明噬菌体 ' 的 ) 蛋白含有一个跨膜区属于 ))/ 家族在 ' 表达的重组 ) 蛋白以可溶性形式存在表达菌 ' 浊度测定试验结果表明 ) 蛋白的表达在 ) 内能够显著抑制表达菌 ' 的增殖活菌数减少菌体出现凝集现象研究结果提示噬菌体 ' 的 ) 蛋白具有抑菌活性这将为进一步研究穿孔素的抑菌机制奠定基础关键词穿孔素序列分析克隆表达活性分析中图分类号文献标志码文章编号 :&%%);1%% '%&)1&% >&%;1 1 )*6 * %& %%&' '/)*)3) )' ) ' 3 &6 * 63&)*' )/)3*/)*3 ))3 /)*)) )))'33))/ /)*3'/*3')) ) ) *)3) ' )*3)))*/)* )))')3)))**)*) 3)) -)* 当前禽源致病性大肠杆菌在世界范围内对养禽业造成严重危害同时菌株多重耐药情况普遍存在导致抗生素的使用失效因此开发抗生素替代品很有必要噬菌体是一种专性侵染细菌的病毒在自然环境中广泛存在有望作为抗生素替代品用于临床细菌病的防治噬菌体根据其是否裂解细菌分为温和型噬菌体和烈性噬菌体烈性噬菌体主要通过穿孔素溶菌酶系统裂解细菌穿孔素是噬菌体在感染宿主菌后期合成的小分子量疏水性跨膜蛋白能够在特收稿日期基金项目国家自然科学基金山东省自然科学基金 %6 & 作者简介齐心女河北南宫人硕士生主要从事微生物与免疫研究通信作者张灿副教授任慧英教授

2 期齐心等噬菌体 ' 穿孔素 ) 的克隆表达及其活性分析定时间以寡聚体形式聚集于细胞膜上形成稳定的跨膜通道造成细胞膜损伤从而释放细胞内的溶菌酶水解细胞壁中的肽聚糖层引起细菌裂解导致子代噬菌体从宿主菌内释放与噬菌体相比穿孔素溶菌酶系统不受噬菌体宿主谱的限制对细菌具有广谱的裂解活性具有潜在的开发价值除此之外穿孔素还能够控制噬菌体裂解宿主菌的时间不同噬菌体来源的穿孔素同源性很低结构多样成孔模式不同其含有氨基酸数量差别很大至今已鉴定的穿孔素分属个家族这些穿孔素均含有个跨膜区根据其结构至少可以分为五种类型以和 / 噬菌体的穿孔素为代表已经报道的穿孔素大多含有个跨膜区而 / 噬菌体的穿孔素仅含有一个跨膜区属于型穿孔素笔者实验室前期分离到一株大肠杆菌噬菌体 ' 属于肌尾噬菌体科 / 类噬菌体为了检测噬菌体 ' 穿孔素 ) 蛋白的种类及其抑菌活性本试验在原核系统表达 ) 蛋白分析其序列特征并测定其抑菌活性以期为新型抗菌制剂的开发提供理论基础材料与方法材料质粒与菌株噬菌体 ' 为笔者实验室分离保存 ' 登录号克隆载体 / 购自 /6 公司表达载体 &/ 和大肠杆菌 ' 均为本实验室保存引物与主要试剂限制性内切酶购自 /6 公司 &6 产物回收试剂盒和 / 连接酶购自 /6 公司质粒提取试剂盒胶回收试剂盒以及蛋白纯化柱购自康为世纪有限公司引物由上海生工公司合成引物序列为 &&&///&& //6 //&&//& //&&&// 引物序列中下划线分别表示限制性酶切位点和方法 ) 蛋白序列分析在 &' 数据库中对 ) 氨基酸序列进行同源性比对利用在线分析工具 / )3* / 对 ) 蛋白进行跨膜区预测根据同源性比对结果及跨膜区的数量判定 ) 蛋白的类型与数据库 ) 比对确定 ) 蛋白所属的家族基因的克隆及重组表达质粒的构建以噬菌体 ' 的基因组为模板 &6 扩增基因基因的 &6 产物及 &/ 载体分别进行和酶切回收 / 酶连接构建重组表达质粒 &) 进行 &6 及双酶切鉴定测序将测序正确的表达质粒转化大肠杆菌 ' 感受态细胞获得表达 ) 蛋白的工程菌 &)' 重组蛋白 ) 的表达及条件优化挑取单菌落接入含有氨苄青霉素的 ' 液体培养基中 H 振荡培养过夜备用取新鲜菌液接入含有 * 氨苄青霉素的 ' 培养基中分别设置不同诱导浓度的 / 不同诱导时间 ) 以及不同的诱导温度 H 检测并分析各诱导剂浓度诱导时间和诱导温度对重组蛋白质表达量的影响确定最佳诱导表达条件重组蛋白 ) 的及 3 鉴定离心收集在最佳条件下诱导表达的菌体 ' 重悬后在冰浴条件下超声破碎细胞裂解条件超声间歇超声后的菌液于 H 条件下离心分离上清和沉淀进行电泳分析重组蛋白质的表达形态将超声裂解后的菌液上清用标签蛋白纯化试剂盒纯化纯化后的蛋白质进行 3 鉴定鼠抗标签的单抗为一抗稀释和 6 标记羊抗鼠为二抗稀释 ' 显色 ) 蛋白表达对大肠杆菌 ' 生长性能的影响将生长至对数期的工程菌 &) ' 加入的 / 同时设大肠杆菌 ' 和未加 / 诱导剂的 &)' 对照于 H 条件下振荡培养每隔各取菌液到孔板上每组设个重复测定各孔悬液的 ; 值检测 ) 蛋白的表达对大肠杆菌 ' 生长性能的影响于 ) 时分别取样进行革兰染色显微镜观察菌体形态同时每隔 ) 各组取菌液倍比稀释后铺平板 H 条件下过夜培养进行细菌计数检测各组在不同时间段菌液中活菌的含量

基因的克隆及重组表达质粒的构建以噬菌体 S1 为模板 HT 扩增 ) 基因测序结果表明获得正确的基因片段' 将 ) 基因连接到 S G[ 载体构建重组表达质粒 S A HT 及双酶切 F& 和 3J 鉴定结果见 - 图 '由图可知在大约 )QS 处出现目的条带与预期片段大小相同' F 重组蛋白 - 的表达及条件优化在 % 中 ahgc 诱导表达

3 */) 畜牧兽医学报 ) 卷同类型的穿孔素其跨膜区螺旋的数量不一' 用结果 F - 蛋白序列分析对噬菌体 S1 的 ) 基因)氨基酸序列进行同源性分析发现与 G) 类噬菌体 ad:& 的相似性最高与 G) 噬菌体穿孔素的相似性为 )X 结果见图 %'穿孔素 A - 是一个小分子量的跨膜蛋白不 GDJDD 软件对噬菌体 S1 的 A -蛋白跨膜区进行预测结果表明其端 % 位于胞外区端 )/%1 位于胞内区最后 %& 个氨基酸残基均带正电荷存在一个螺旋构成的跨膜区 / ) H ; 数据库比对结果表明噬菌体 S1 的 A - 蛋白属于 H G H[%%&*%家族' 图 - 氨基酸序列同源性分析 R> - > 1 A 3 3 F A% : 基因的克隆及重组表达质粒的构建以噬菌体 S1 为模板 HT 扩增 ) 基因测序结果表明获得正确的基因片段' 将 ) 基因连接到 S G[ 载体构建重组表达质粒 S A HT 及双酶切 F& 和 3J 鉴定结果见 - 图 '由图可知在大约 )QS 处出现目的条带与预期片段大小相同' F 重组蛋白 - 的表达及条件优化在 % 中 ahgc 诱导表达重组蛋白 A -摸索最佳的aHGC 诱导浓度诱导时间以及诱导温度结果见图 *'由图 * 可知在 % ;; k% ahgc 诱导下 A - 蛋白的表达量在 )A 时达到最高'设不同浓度的aHGC 诱导重组蛋白质表达 )A 发现 A - 蛋白的表达量随 ahgc 浓度的升高而增加 %;; k% ahgc 诱导浓度蛋白质表达量最高'分别在不同的温度条件下用 % ;; k% ahgc 诱导蛋白质表达 )A当诱导温度为 * & r 时蛋白质表达量最高'因此 * & r 条件下 % ;; k% ahgc 诱导 )A 重组蛋白 A - 表达量最高' F %重组蛋白的/)/ SH: 及 _ C 鉴定对 A - 蛋白进行大量表达超声后离心分离 %'S - 双酶切鉴定 F& 和 3J &D'核酸相对分子质量标准& 'S -HT 鉴定 %'3BQ -S B S - F& R; F { 3J &D'3&&&3 ; ^ &'HTS B S 图重组质粒 IX S- 的 HXG 及双酶切鉴定 HXG1C W I 1 >S 3> A C I > IX S- 上清和沉淀 K3K HC: 电泳检测重组蛋白质的存在形式'结果显示 A -蛋白在上清和沉淀中均有表达'亲和层析法纯化上清中表达的蛋白质 K3K

中表达的最佳诱导条件 /)/ SH: C 1 - I YI B; % : UV 3 HC: 电泳及 ] -Q 鉴定结果见图 )'由图 ) 可知大约在 1' ^B 处出现目的条带与预期蛋间点的浊度测定)菌落计数检测 A -蛋白的抑菌活性并通过革兰染色观察其生长状态的变化' 加白质大小一致' 入aHGC 诱导后 A -%% 菌

4 % 期齐心等噬菌体 S1 穿孔素 A - 的克隆)表达及其活性分析 */ %) /) %*'S -%% 未诱导对照& '依次为 %;; k%ahgc 诱导 )) ) ) %&A 的 S -%% 菌液& k% ) %&'依次为 &' )) &' ) &' ) %;; ahgc 诱导 )A 的 S %%) %'依次为 *&) *1 r 条件下诱导的 -%% 菌液& -%% 菌液&D'蛋白质相对分子质量标准 S %/%*'S -%%Q -B & 'GA S - -B V A% ;; k% ahgc ; ) & -%&A S U %&'GA S - -B V A - - ahgc &' )&' &' - R %;; k% S U )A& %%%'GA S -ZS *&-*1 r &D'H -; ^ R 图 /)/ SH: 检测 - 蛋白在大肠杆菌 UV 中表达的最佳诱导条件 /)/ SH: C 1 - I YI B; % : UV 3 HC: 电泳及 ] -Q 鉴定结果见图 )'由图 ) 可知大约在 1' ^B 处出现目的条带与预期蛋间点的浊度测定)菌落计数检测 A -蛋白的抑菌活性并通过革兰染色观察其生长状态的变化' 加白质大小一致' 入aHGC 诱导后 A -%% 菌液浊度逐渐 S 下降 )A 左右达到最低随后逐渐上升与 % 及未诱导的 S A -%% 对照组比较直到 A 菌液浓度仍有明显差异 E%&' &图 ' 活菌计数结果显示aHGC 诱导 A - 蛋白表达后表达菌 S A -%% 活菌数明显低于对照组随着时间的延长细菌数量缓慢增加 1A 后仍有一个数量级的差异说明 A -蛋白的表达对细菌的生长有抑制作用图 ' -%% 进 A - 蛋白诱导表达后的 S 行革兰染色显微镜下观察细菌形态结果见图 1' %'S -%% 菌液裂解上清& 'S -%% 菌液裂解沉淀&D'蛋白质相对分子质量标准& *'S -%% 未诱导对照& )'纯化的 A - 蛋白& 'A -蛋白 ] -Q 鉴定 %'GABS - S -%%&'GAS S - S -%%&D'H - ; ^ &*'S -%% Q -B -&)'HB A -S -&' ahgc 诱导 A - 蛋白表达后 A -%% 出 S 现明显的凝集现象而未诱导的对照组菌体散在均 ] -Q A -S 图 %- 蛋白的纯化及 _ C 鉴定 _ C % H1 - I 讨论匀分布说明 A -蛋白的表达能够影响细菌的生长状态' 噬菌体及其产物作为抗生素替代品近年来备受关注对耐药菌的防治具有潜在的应用价值 **' 但是由于大多数噬菌体特异性强宿主谱窄在临床上的应用受到限制 *%*' 穿孔素是一种小分子量的蛋 F '- 蛋白抑菌活性测定 ahgc 诱导大肠杆菌 S -%% 中 A 白质作为噬菌体裂解系统的成分能够在细胞膜上 - 蛋白的表达通过对表达菌 % 不同时形成非特异性的通道促使胞内溶菌酶释放进而导

蛋白的拓扑结构发现其恰恰与 G) 和 G 噬菌体的 A - 蛋白的相反端位于胞外端位于胞内' 该预测结果尚需进一步试验验证确定 S1 的 A 蛋白的拓扑结构'同源性分析显示 S1 的 A -蛋白与 G) 噬菌体的相似性为 )X 与 G 噬菌体几乎无同源性'而同源性高的aD:&) `K%& 噬菌体的

5 */ 畜牧兽医学报 ) 卷图 '- S- &UV 生长性能测定蛋白表达后 IX ' E -- IX S- &UVE - YI - I 菌的防治' 目前噬菌体的穿孔素裂解机制已有大量报道而 G) 类噬菌体来源的穿孔素报道较少 *%)' 本研究对大肠杆菌噬菌体 S1 的 A - 蛋白进行了序列分析发现该蛋白质分子仅有一个跨膜区属于 H A G H[%%&*%' 在 H ; 数据库中与之同一家族的还有 G) 和 G 噬菌体的 A - 蛋白' 该家族成员仅有一个跨膜区端位于胞内其端位于胞外 *%%'GDJDD 软件预测 S1 的A 图 T- 蛋白表达后 IX S- &UV 活菌数测定 T ; C IX S- &UVE - Y S 3 - I I 蛋白的拓扑结构发现其恰恰与 G) 和 G 噬菌体的 A - 蛋白的相反端位于胞外端位于胞内' 该预测结果尚需进一步试验验证确定 S1 的 A 蛋白的拓扑结构'同源性分析显示 S1 的 A -蛋白与 G) 噬菌体的相似性为 )X 与 G 噬菌体几乎无同源性'而同源性高的aD:&) `K%& 噬菌体的穿孔素未见具体的报道' 为了研究该蛋白的抑菌活性在前期试验中我们尝试使用 S:G 载体进行蛋白质的表达但是 'S -%%ahgc 诱导组&'S -%% 未诱导对照组 'S -%% -B V AaHGC&'S -% 表达量极低'随后我们以 S G[ 为载体实现了 A - 蛋白的表达尽管重组 A -蛋白携带较大的蛋白标签但是活性测定结果显示表达的 A -蛋 %Q -B V AaHGC 图 &UV 形态观察蛋白表达后 IX S \ & F B C ; X S U V E A I A I \ YI - I 减少细菌生长出现凝集现象说明 A - 蛋白能够致细菌裂解'这种作用机制不受噬菌体宿主谱的限影响细菌的生长状态这与之前报道一致 *%1%'A 制应用范围更广有望开发成抗菌制剂应用于耐药白能够有效抑制 % 的生长使活菌数量在表达菌细胞膜上形成通道使细胞膜不完整进而 - 蛋白表达后对表达菌 % 进行了浊度

6 期齐心等噬菌体 ' 穿孔素 ) 的克隆表达及其活性分析测定发现菌液的 ; 值在诱导 ) 降到最低随后菌液浓度缓慢上升已有报道均证实穿孔素能够引起菌液浊度显著下降但是测定时间均控制在 ) 以内未提及 ) 后细菌的生长情况 & * 等报道了噬菌体来源的 ) 蛋白具有细胞毒性能够影响肿瘤细胞膜的完整性抑制蛋白的合成体外试验和动物试验证实肿瘤细胞死亡率达 : 在本试验中 / 诱导 ) 后菌液浓度开始缓慢增加推测与不同的穿孔素来源以及不同的作用细胞有关对哺乳动物传代细胞的作用尚需进一步验证作为噬菌体裂解系统穿孔素与溶菌酶联合应用能起到有效的裂解细菌作用 -') 等开发该系统用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的防治发现穿孔素单独使用也能够裂解多株金黄色葡萄球菌与革兰阴性菌比较革兰阳性菌的细胞壁没有外膜仅由肽聚糖层构成更有利于穿孔素的作用其具体作用机制尚不明确另外穿孔素还可以作为传递系统将外源的药物核酸蛋白质导入菌内起到杀菌的作用本试验对大肠杆菌噬菌体 ' 来源的穿孔素进行了表达以及活性测定发现其具有明显的抑菌活性这为进一步研究穿孔素的抑菌机制及后续穿孔素的开发应用提供了理论基础结论噬菌体 ' 的 ) 蛋白在原核系统中实现了可溶性表达活性测定发现其具有明显的抑菌活性参考文献 /%' --->) **3 )* &)-% &6&1;; '))* *)*%1 '66/ / /61& '3) 1) -;1 6)))) * ) 6 6- ' 3 *)*** )3)3 6 //61&'6& /))3) 3 3 -)) *)3 ) 1 * 6-'6 /) 3)* &/B; ;%66 33) )) )1' -;1 6'1* 3))1' /6 / /61& -;1 6 ))/ )3 %& 1 /) '3 *) ' ) & '6;6;6&%- ))3 )*)3 ) % ) / 6&' / -& ;11%/; /6// )/)3 - ;16-;16 / &/B; ;%66

7 畜牧兽医学报卷 *)) 3) 3)) &*) 3) ;> - ) ) ) %%% 3) 6 ;;C&3)* ))3) 1 & 66' ) ) ) * ) * ) /;- /& 6 / **) )% ' ) -'- ->&33 )) %%3)% ) 6--& * *3 3) ) 编辑白永平

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌