郝克红等芳香烃受体,! 内源性配体 1* 对胎盘滋养层细胞的增殖抑制作用及其机制 #& % #/%# $#& #% % &$#%#/,!$ &% %%'/ $ % % # &$ $% /$%$%$&%**&$#%#/,! $ '$ %%,! 1* #%& "#$#, ":,!.,&$ %%# #

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凰弥云
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1 复旦学报医学版芳香烃受体内源性配体 68 对胎盘滋养层细胞的增殖抑制作用及其机制郝克红王凯陈晓段涛复旦大学上海医学院研究生院上海同济大学附属上海第一妇婴保健院转化医学中心产科上海摘要目的研究芳香烃受体 $$# $ #$ & #$,! 的内源性配体 ;2 吲哚 ; 羰基噻唑羧酸甲酯 1* 对胎盘滋养层细胞增殖的影响及其机制方法用免疫组织化学及 3 %$# 检测,! 在早期绒毛和晚期胎盘组织中的表达利用人胎盘滋养层细胞系和,! 作为细胞模型研究 1* 对胎盘滋养层细胞增殖的影响结果,! 主要分布于人胎盘合体滋养层细胞的胞质中并且晚期胎盘组织中,! 蛋白的表达水平高于早期绒毛组织 *,! 蛋白质在中表达较高而在,! 中几乎检测不到 1* 可诱导细胞中,! 下游靶基因细胞色素,":,!., 的表达该诱导作用具有剂量和时间依赖性同时 1* 使细胞滞留于细胞周期的期进而抑制细胞的增殖结论 1* 通过激活,! 信号通路抑制胎盘滋养层细胞的增殖该抑制作用主要通过调节细胞周期的改变来实现关键词 ;2 吲哚 ; 羰基噻唑羧酸甲酯 1* 芳香烃受体,! 胎盘滋养层细胞细胞增殖细胞周期中图分类号! 文献标志码,+ %% 6" $ # # $68 &# "! "!&!$ $!!!#!# 2, 5#' 3,. 5 "2. # 0,. *# $' "' $""# $%&' ""$" "0!,' # &$! " 6%&' # '% *# % '/ % % #/ ;2#; $ # (# $ #%$1*#' #%$$# $ #$ & #$,! ' # &$# / $ ##/&$#& #%% # 3&$# &$ %%# /$%$%$$ &%%'# % #% $ 3 %$ #* % & #$# $ #%,! % #% # % '/ %#/1* # $&$# / $ # #! #,! % &$ % "#$$ %&#'#$ ###

2 郝克红等芳香烃受体,! 内源性配体 1* 对胎盘滋养层细胞的增殖抑制作用及其机制 #& % #/%# $#& #% % &$#%#/,!$ &% %%'/ $ % % # &$ $% /$%$%$&%**&$#%#/,! $ '$ %%,! 1* #%& "#$#, ":,!.,&$ %%# #,!1 &#$1* %'/ &$# / $ # $$ % ' & %! ##1* $#& #%&$# / $ #$#'##/,!%&$$# $$ % '& % " ( # ;2#; $ #(# $ # %$ 1* $ $# $ #$ & #$,!&$#& #%% &$# / $ # 芳香烃受体 $$# $ #$ & #$,! 是一种配体激活的转录因子它在细胞质中与其内外源性配体结合后激活并移位到细胞核内与芳香烃受体核转运蛋白形成异二聚体复合物此异二聚体可结合于相应的 0., 序列即芳香烃受体反应元件引发下游目的基因的转录及表达产生一系列生物学效应诸多研究关注,! 在代谢环境污染物及致畸致癌物质方面的作用近年来在,! 对生殖的作用日益受到重视研究表明,! 功能缺失的母鼠受精卵不能正常着床即使少数成功着床其妊娠成功率同胎生仔数及存活率均明显降低且仔鼠断奶后死亡率高胎盘在维持正常妊娠的过程中起着至关重要的作用兔和鼠的胎盘组织中均检测到,! 蛋白丰富表达人体多种器官和组织中均存在,! 的表达而胎盘中表达水平最高且胎盘组织重要的生物转化酶 ":,": - 等为,! 下游靶基因可以推测,! 参与调节胎盘功能在维持妊娠中发挥重要作用,! 的配体包括色氨酸代谢物花生四烯酸代谢物亚铁血红素代谢物等内源性配体二英多环芳烃多氯联苯等经典的外源性配体 ;2 吲哚 ; 羰基噻唑羧酸甲酯 1* 是近年来发现的由猪肺中提取的一种,! 内源性配体其效能为二英的且无细胞毒性被广泛应用于对,! 的功能研究中,! 激活可抑制肺癌肝癌乳腺癌的生长最近的研究也证实 1* 抑制卵巢癌细胞的增殖与迁移对于,! 是否影响胎盘滋养层细胞的行为学特性目前未有报道本研究假设内源性配体通过激活,! 抑制胎盘滋养层细胞的增殖首先检测,! 蛋白在胎盘组织中的表达其次利用人胎盘滋养层细胞系作为细胞模型研究 1* 是否通过激活,! 信号通路调节胎盘滋养层细胞的增殖材料和方法组织和细胞胎盘组织标本均取自同济大学附属上海市第一妇婴保健院周例来源于门诊手术室非医学原因进行人工流产手术时周例正常单胎妊娠分娩排除妊娠并发症组织取出后立即置于 6 预冷的 - 溶液中送至实验室后将组织块用 - 液洗去血液剔除蜕膜胎膜较大的血管及钙化组织部分装入冻存管置于液氮中存放备用部分甲醛固定石蜡包埋本实验中人胎盘滋养细胞层系和,! 均购自中科院细胞库细胞培养按照,*"" 提供的方法用培养基 4 胎牛血清 4 青链霉素,! 用 0 培养基 0 4 胎牛血清 4 青链霉素培养于 64 " 的细胞培养箱内主要试剂 0 和培养基胎牛血清美国 # 公司二甲基亚砜 0 美国 ' 公司逆转录和 "! 试剂盒日本 *5! 公司 "! 引物生物工程上海股份有限公司 ") 试剂和 -, 蛋白定量试剂盒美国 *$ # 公司蛋白裂解液碧云天生物技术研究所 1* 英国 *# $%-#% 公司结晶紫美国, $ % # 公司 *$(# 美国 1 $#' 公司甘油醛磷酸脱氢酶, 02 抗体上海康成生物工程有限公司,! 抗体美国 (#-# 公司免疫组化染色新鲜组织用 4 多聚甲醛固

3 复旦学报医学版年月定 6 过夜石蜡包埋切片石蜡切片脱蜡脱水过氧化氢封闭内源性过氧化物酶枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复用 4 马血清封闭抗体顺序用,! 一抗生物素化的,! 二抗孵育显色剂显色苏木精复染脱水至透明树胶封片显微镜下观察 #! 检测提取细胞或者组织的总蛋白用 -, 试剂盒进行蛋白定量后进行 3 %$ # 检测用 4 的 0, 凝胶电泳转膜 4 的脱脂奶粉封闭抗体先用,! 一抗二抗孵育再用, 02 抗体孵育一抗 6 孵育过夜抗体稀释倍数为,! 抗体, 02 抗体次日二抗室温孵育最后采用 ") 发光试剂进行显影反应 *$(# 裂解细胞提取总!., 紫外分光光度计检测其浓度将!., 逆转录后进行 "! 反应, 02 上游引物 ;*"**" 统计方法统计数据以 ) 表示两组间比较采用检验统计分析采用软件 * 为差异有统计学意义结果在人胎盘组织及细胞系中的表达免疫组化染色表明早期绒毛和晚期胎盘组织中,! 主要分布于合体滋养层细胞和血管内皮细胞图, 3 %$# 检测结果表明正常晚期胎盘组织中,! 蛋白的表达水平高于早期绒毛组织差异有统计学意义 * 同时发现,! 蛋白在中表达量较高而在,! 细胞中几乎检测不到图 - **** " *" "", ; 下游引物 ;, """", ""**"*"",;,! 上游引物 ;",* "* ***"****,* "; 下游引物 ;**"""* **"*****"* *"";":, 上游引物 ; *"***"*"**""* "*,*"; 下游引物 ; "* *"*"**"""**","*;,!":,, 02 退火温度分别为循环次数均为次 "! 产物用 4 的琼脂糖凝胶电泳在凝胶成像系统中进行分析增殖实验向孔板中铺入,! 细胞个孔放入细胞培养箱中培养后加入终浓度分别为和的 1* 1* 粉末用 0 溶解分别培养天细胞用甲醛固定 4 结晶紫溶液染色 4 脱氧胆酸钠溶液溶解细胞酶标仪上测定吸光度值波长设置为重复上述实验次细胞周期检测将,! 细胞悬液铺在孔板中细胞密度约 4 左右放在培养箱中贴壁分别加入 0 对照组或 1* 终浓度为培养用胰酶消化收集细胞制成单细胞悬液细胞计数加入预冷的 4 乙醇制成单细胞悬液置于 6 过夜固定细胞次日常温 ' 离心加碘化丙啶染液重悬后流式细胞仪上检测细胞周期图 0 在人胎盘组织及胎盘滋养层细胞系 <87, 和 < 中的表达 +&0 #!# ##!!!! #<87,<,1# #( ##/,!&% %% % #/$ %# #$&#%% '/#$,!-&$ %%# #/,! &$# &% %% %#/% %#$# $ # %,!. *0 $ &$ % %) 68 诱导 <87, 细胞中 00 * 的表达向培养基中加入终浓度为 # ) 的

郝克红等芳香烃受体,! 内源性配体 1* 对胎盘滋养层细胞的增殖抑制作用及其机制 1* 分别培养和后检测 ":,!., 水平随着培养时间增加 ":,!., 水平升高时达最高图, 向细胞培细胞数目增多期的细胞数目减少 * 图而 1* 对,! 细胞周期无明显影响养基中加入终浓度分别为和 # ) 的 1* 培养检测 ":,!., 水平随着药物剂量增加 ":,!

4 郝克红等芳香烃受体,! 内源性配体 1* 对胎盘滋养层细胞的增殖抑制作用及其机制 1* 分别培养和后检测 ":,!., 水平随着培养时间增加 ":,!., 水平升高时达最高图, 向细胞培细胞数目增多期的细胞数目减少 * 图而 1* 对,! 细胞周期无明显影响养基中加入终浓度分别为和 # ) 的 1* 培养检测 ":,!., 水平随着药物剂量增加 ":,!., 水平升高图, 相反 1* 处理前后,! 中 ":,!., 水平均无明显变化图 - 图,68 对 < 和 <87, ; 增殖的影响图 68 对 <87,< 中下游靶基因 00 * 表达的影响 +& 8$#$68 (#&& 00 *# <87,<,1* #%& ":,!., &$ %%# %-1* ":,!.,&$ %%##,! % 68 抑制 <87, 细胞增殖向培养基中加入终浓度分别为和 # ) 的 1* 分别培养天结晶紫法检测细胞增殖相对于对照组 1* 显著抑制了细胞增殖该抑制作用具有剂量和时间依赖性 1* 浓度在 # ) 和 # ) 细胞培养至第天和第天时其对细胞增殖的抑制作用均有统计学意义 * 图 - 而 1* 对,! 细胞的增殖无明显影响图, 68 改变 <87, 细胞周期流式细胞仪检测 # ) 的 1* 处理第天的和,! 细胞周期 1* 处理后处于细胞周期期的 +&,8$#$68!!$ #$ < <87, ; * 讨论近年来越来越多的研究证实了,! 在生殖中的重要作用研究发现,! 在人兔鼠等胎盘组织中均有较高的表达我们前期的工作也证实了,! 在胎盘合体滋养层细胞中有所表达与前述报道一致本研究利用不同孕周的胎盘组织进一步证实了,! 在胎盘组织的高表达而且相对于早期胎盘绒毛组织孕晚期胎盘组织中的,! 蛋白表达较高免疫组化实验也证实在早期和晚期的胎盘组织中,! 都主要分布在合体滋养层细胞早期绒毛组织中细胞滋养层细胞无,! 表达但其小血管内皮细胞有中等量,! 表达而晚期胎盘组织中只有少数大血管内皮细胞有中等量,! 表达这一结果提示,! 在胎盘生长发育过程中发挥着重要作用

5 复旦学报医学版年月 0 $ % # %) * 图 68 对 <87,< 细胞周期的影响 +& 8$#$68 <87,<!"! # # 胎盘合体滋养层细胞是一种终末分化的细胞是构成胎盘的主要成分其主要功能是合成和分泌孕期的多种重要激素和酶类胎盘滋养层细胞行为学的改变包括细胞增殖迁移以及分泌将会直接导致胎盘功能的损害,! 在胎盘组织尤其是合体滋养层细胞表达丰富说明其对正常胎盘功能起到重要作用研究表明 + 0 基因缺陷型小鼠不能维持正常妊娠状态和或胚胎胎儿的正常发育不同孕周胎盘的,! 表达水平不同可能意味着孕晚期胎盘比孕早期对,! 的内外源性配体更为敏感然而,! 对胎盘滋养层细胞的行为学尤其是对细胞增殖的影响尚未见相关报道本课题利用,! 的内源性配体 1* 来研究 1* 对,! 的激活作用及其对胎盘滋养层细胞增

6 郝克红等芳香烃受体,! 内源性配体 1* 对胎盘滋养层细胞的增殖抑制作用及其机制殖功能的影响人滋养层细胞系和,! 被广泛用于研究胎盘滋养层细胞的功能 3 %$ # 检测证实细胞中,! 的表达量较高而,! 细胞中,! 几乎检测不到因此这两种细胞系成为研究,! 功能的理想模型本研究发现 1* 能显著激活细胞的,! 诱导下游靶基因 ":,!., 表达而且这种激活作用具有时间和剂量依赖性同时 1* 能显著抑制细胞增殖流式细胞仪检测发现 1* 处理后细胞滞留于细胞周期的期而不进入期以往大量的研究也证实了,! 的激活可以导致细胞周期停滞 0., 复制能力下降细胞增殖受到抑制由于,! 在,! 细胞中的表达甚微本研究并未检测到 1* 对,! 细胞,! 的激活以及 ":,!., 水平的改变细胞增殖和周期均无明显改变这充分说明 1* 抑制胎盘滋养层细胞增殖是通过,! 的激活来实现的综上所述,! 在人胎盘的生长过程中尤其是滋养层细胞的生物行为学中发挥着重要作用但本研究仅探讨了胎盘滋养层细胞的增殖功能后续将进一步研究,! 对滋养层细胞迁移分泌功能的影响以及其在维持胎盘免疫耐受中的作用从而进一步揭示,! 在维持正常妊娠中的作用及机制参考文献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收稿日期编辑段佳

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

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