复旦学报 医学版 年 月 " "2 2"2 2" " "0" " " " " " " " "2 2 0 " " " 肺血管重构是肺动脉高压晚期重要的病理改变 往往与肺动脉平滑肌细胞过度增生和凋亡下降 有关 研究表明肺动脉平滑肌细胞表面的 羟色胺转运子 " 可促进 羟色胺向细胞内转运
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- 稍 尹
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1 复旦学报 医学版 西地那非通过上调 磷酸化增强 羟色胺的促肺动脉平滑肌细胞增殖作用 李冰冰 姜 桢 沈建颖 南京大学医学院附属鼓楼医院麻醉科 南京 复旦大学附属中山医院麻醉科 上海 同济大学附属上海市第十人民医院心内科 上海 摘要 目的 探讨西地那非增强 羟色胺引起的肺动脉平滑肌细胞增殖作用的可能机制 方法 体外原代培养猪肺动脉平滑肌细胞 取第 代细胞用于实验 细胞随机分为 组 对照组 1 羟色胺组 西地那非组 - 西地那非和 羟色胺联合干预组 细胞传代培养的第 天 给予含 7 胎牛血清的培养基饥饿 1 组 组 - 组分别给予 4 西地那非干预 组提前 给予 西地那非干预 再给予 羟色胺处理 细胞干预 后采用 法测定各组细胞外信号调节激酶 2 2 的磷酸化水平 加入 羟色胺 后 流式细胞法测定细胞周期并计算 期细胞占细胞总数的比例 加入 羟色胺 后 法检测细胞增殖程度 结果 与 1 组相比 组 2 2 的磷酸化水平 期细胞比例及细胞增殖率明显增加 组 2 2 的磷酸化水平 期细胞比例及细胞增殖率较 组进一步增加 各组间总 2 2 水平差异无统计学意义 结论 西地那非增强 羟色胺引起的肺动脉平滑肌细胞 3 合成和增殖 可能与 2 2 的磷酸化水平上调有关 关键词 细胞外信号调节 激酶类 磷酸二酯酶抑制剂 血管平滑肌 肺动脉 羟色胺 中图分类号 文献标志码 -4 -;.. " - "" 0" " " " " " " "" 1 " " - " 0" " " " -"" -"" 0" " " 02 2 " " "0 " 1 " " " 2 2 " " "0 "
2 复旦学报 医学版 年 月 " "2 2"2 2" " "0" " " " " " " " "2 2 0 " " " 肺血管重构是肺动脉高压晚期重要的病理改变 往往与肺动脉平滑肌细胞过度增生和凋亡下降 有关 研究表明肺动脉平滑肌细胞表面的 羟色胺转运子 " 可促进 羟色胺向细胞内转运 激活 2 信号通路 引起平滑肌细胞过度增殖和肥大 导致肺小血管中层肥厚 管腔狭窄 在肺血管重构中起重要作 用 西地那非作为磷酸二酯酶 的特异性抑制剂 能增加细胞内 含量 促进平滑肌舒张 而且还可通过干扰 2 信号通路 抑制肺动脉平滑肌细胞增殖 已被运用于肺动脉高压的治 疗中 最初我们推测西地那非可通过 2 通路抑制 羟色胺引起的肺动脉平滑肌细胞增殖 但是近来的研究证实 西地那非能剂量和时间依赖性地促进 4 细胞 合成并向细胞表面 聚集 促进 羟色胺内化 西地那非能否同样增强肺动脉平滑肌细胞 活性 引起平滑肌细胞增殖 目前还没有定论 值得进一步研究 材料和方法 材料和仪器 枸橼酸西地那非 美国 公司 羟色胺 四甲基偶氮唑蓝 平滑肌细胞肌动蛋白抗体 美国 公司 总 2 2 磷酸化 2 2 一抗 抗兔二抗 美国 公司 流式细胞仪 型号 肺动脉平滑肌细胞的培养和鉴定 无菌条件下取猪肺动脉 剥除外膜 刮掉内膜后将中膜剪成 大小的组织块 并转移到培养瓶中贴壁培养 见组织块周围有平滑肌细胞爬出 左右细胞铺满瓶底面积 7 胰酶消化后用 目滤网过滤组织块 传代培养 细胞鉴定采用平滑肌细胞肌动蛋白 抗体 免疫组化 4 法鉴定 7 以上细胞浆着色呈棕色 细胞培养 代后 用 7 胰酶消化 分别以 个 个 密度接种到 孔板或者 孔板 细胞贴壁生长 后 用含 7 胎牛血清的培养基饥饿 再次用含 7 胎牛血清的培养基换液后用 于实验 分组 细胞随机分为 组 对照组 1 羟色胺组 西地那非组 - 和联合组 细胞传代培养的第 天 给予含 7 的胎牛血清的培养基饥饿 1 组 组 - 组分别给予 4 羟色胺 西地那非干预 联合组提前 给予 西地那非干预 再给予 羟色胺处理 加入 羟色胺 后采用 2 " 检测总 及其磷酸化的表达 在相应的干预点 提取蛋白 细胞用 - 裂解 6 下 离心 取上清用 4 法进行蛋白定量 用加样缓冲液标化各组的浓度 沸水中加热 取 蛋白上样 行 3 采用半干法行蛋白转膜 膜封闭后分别与一抗 兔抗人总 2 2 多克隆抗体或磷酸化 2 2 单克隆抗体 稀释浓度为 进行抗原抗体结合反应 再与辣根过氧化酶标记二抗 山羊抗兔 - 稀释浓度均为 反应 经适当洗涤 膜片与高敏化学发光剂 作用 在 成像系统上曝光 后 显现特异的蛋白信号 最后以目的条带和内参条带 3 的灰度比值分别表示磷酸化和总 2 2 的表达水平 加入 羟色胺 - 后采用流式细胞法行细胞周期分析 干预结束后消化收集细胞 7 乙醇 6 固定 加入碘化丙啶 6 避光 后上机行流式细胞检测 用 软件获取 个细胞 用 细胞周期软件分析 检测 期细胞数占总细胞数的比例 加入 羟色胺 0 后 测定肺动脉平滑肌细胞数目 在实验结束前 加入 终浓度 7 继续孵育到结束 加入 31 溶解紫色结晶 在酶标仪 处测定吸光度 值 增殖率 - 7 分别代表 - 各组的 值 代表 1 组 值 统计学处理 采用 统计软件处理 计量资料以 表示 组间采用单因素方差分析 两两比较采用 2 法 为差异有统计学意义
3 0羟色胺的促肺动脉平滑肌细胞增殖作用 李冰冰等 =西地那非通过上调 B6PB6P 磷酸化增强 而 0J1 组条带较 J1 组进一步加深 C"= ""西 地那非本身对 B6PB6P 磷酸化水平无明显影响 结 果 而各组间总 B6PB6P 条带无明显差异图 " 与 ;I. 组 比 较J1 组 0J1 组 细 胞 增 殖 率 分别增加到 U C"= "" U C"= "" 期细胞比例从 = 分 别 增 加 到 " U U C"= " = U C"= ""相对 J1 组 0J1 组细 胞增 殖 率和 期细胞比例 进 一 步 升 高差 异 有 统 计 学 意 义 C"= "" EG 组 细 胞 增 殖 率 和 期 细 胞 比 例 较 ;I. 组无明显改变 C"= ""图 " 磷酸化 B6PB6P 的 L 7 结果显示 G ""9 7 0羟 色 胺 刺 激 细 胞 " 9 后 B6P B6P 磷酸化水平上调 3 达 高 峰 3 后回到 刺激 图 C 平滑肌细胞干预 HG" 后细胞增殖率的变化 前水平所 以 我 们 选 择 3 作 为 时 间 点 比 较 组 - B6PB6P 磷酸化表 达结果 表 明 J1 组 B6P B6P 磷酸化条带相对 ;I. 组明显加深 C"= "" - ;4 > " - HG" " C"= " ;I.A? "4"C"= " J1A? "4 图 G 平滑肌细胞干预 GE" 后 N 期细胞比例的改变 - -NB - B6N9< - ;4 > " - " C"= " ;I.A? "4"C"= " J1A? "4 图 I 平滑肌细胞干预 LT2 AO:=CO:=G 的变化 - 后 AO:=CO:=G 和 1 - " 1 - O:=CO:=G1" - B6N9< ;4 > " - 1". " C"= " ;I.A? "4"C"= " J1A? "4= 0B6PB6P 1 7B6PB6P4 0B6PB6P B6PB6P
4 复旦学报 医学版 年 月 讨 论 我们的结果表明 西地那非促进 羟色胺诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖 可能与西地那非促进 羟色胺内化和 2 2 的磷酸化水平上调有关 肺动脉高压是以肺血管阻力增加 原位血栓形成 肺血管重构为特征的一组肺血管病变 最终可导致右心功能衰竭 肺动脉高压的早期以肺血管收缩为主 随着病程进展 肺血管表现为无肌细动脉肌化 中层管壁增厚 新生内膜形成造成管腔狭窄 免疫组化分析表明 上述部位伴有平滑肌 肌动蛋白高表达 说明肺血管重构与肺动脉平滑肌细胞的过 度增殖密切相关 大量研究证实 羟色胺能促进肺动脉平滑肌细胞 3 合成 期细胞进入增殖周期 加速细胞有丝分裂 可能与结合细胞表面相应的受体 通过 蛋白激活磷脂酶 增加二酰甘油含量 促进 内流 激活 基因有 关 近年来研究发现 羟色胺转运体在促进肺动脉平滑肌细胞增殖方面起重要作用 它通过加速 羟色胺内化 促进细胞内 1 表达 激活下游的 2 生长信号通路 引起肺动脉平滑肌 细胞过度增殖 以往的研究证实升高细胞内 含量的药物能抑制生长因子诱发的平滑肌细胞增殖 可能的机制包括通过激活蛋白激酶 2 后者磷酸化 蛋白 造成 蛋白不能与 结合 或上调丝裂原激活蛋白激酶的磷酸酶 2 蛋白的表达 引起 2 信号通路障 碍 所以本实验中 我们预先给予西地那非处理 再用 羟色胺刺激平滑肌细胞增殖 观察西地那非对肺动脉平滑肌细胞的作用 我们的研究发现在 浓度范围内 羟色胺剂量依赖地促进细胞增殖 进一步增加 浓度反而减弱其促增殖作用 与 等的研究不同 我们最大效应浓度为 而不是 可能与选择的细胞类型不同有关 体外实验证实 羟色胺被细胞 主动摄取后 激活 蛋白 与 3 氧化酶的附基结合 促进 1 的合成 后者激活下游 2 2 通 路 引起一系列反应 2 通路中包括 种同工酶 即 2" 和 2 它们与细胞凋亡 应激 分化和增殖有关 其中 2 则与细胞增殖的关系最为密切 研究表明只有 2 磷酸化后 才能激活下游信号 促进细胞周期蛋白表达 细胞通过 期 限制点进入 期 启动细胞有丝分裂 细胞增 殖 我们的结果显示 细胞给予 羟色胺刺激后 2 通路中 2 2 磷酸化增强 后 期细胞比例增加 说明大量的细胞进入增殖周期 后细胞数目也较对照组明显增加 本研究新的发现在于 提前给予 西地那非处理后 再给予 羟色胺刺激 相对于 组进一步增强 2 2 的磷酸化水平 导致随后的细胞过度分裂 增殖 可能的原因包括 研究证实西地那非能剂量和时间依赖性地加强 4 细胞 的活性 促进 羟色胺内化 我们推测本实验中西地那非同样可促进肺动脉平滑肌细胞 合成和在细胞表面聚集 加速 羟色胺向细胞内转移 激活 2 信号通路 我们以前的研究中 西地那非在 浓度范围内能抑制血小板源生长因子 3 引起的猪肺动脉平滑肌细胞增殖 与西地那非剂量依赖性上调 2 表达 促进 2 2 磷酸化降解有关 而本实验中选择的西地那非为 我们推测在此浓度下西地那非不能上调肺动脉平滑肌细胞 2 的表达 相反促进 活化 导致 羟色胺内化 综上所述 西地那非可促进 羟色胺的内化 激活 2 2 磷酸化 导致细胞过度增殖 所以 口服西地那非对于肺高压特别是家族性肺高压的病人 能否加剧 活化 从而加重肺高压症状有待进一步研究验证 参 考 文 献 " " " " " "0" "" "" " " " " " " " " " 0" ".. " " " " ". 1 ; 4 " " "
5 李冰冰 等 西地那非通过上调 2 2 磷酸化增强 羟色胺的促肺动脉平滑肌细胞增殖作用 " " 4. 李冰冰 姜桢 羟色胺在肺动脉平滑肌细胞增殖 肺血管重构中的作用 国际麻醉学与复苏杂志 "" 0".. """ " " 收稿日期 编辑 张秀峰 上接第. 页 李静 沈宜 汤为学 等 小鼠肝癌细胞 源 0 的制备及其免疫相关蛋白的初步研究 中华肝脏病杂志 杨麟 沈宜 李静 等 热休克小鼠肝癌细胞 源 0 的制备及其蛋白组成的初步研究 重庆医科大学学报 钟良 陈坚 徐近 等 对胰腺癌细胞 40 增殖的影响及机制 复旦学报 医学版 乔滨 徐薇 陈刚 等 33 对巨噬细胞株 的刺激作 复旦学报 医学版. 3 " " "2 邹立 蔡绍先 陈玮莹 等 细胞粘附分子与肝脏疾病 国际检验医学杂志. -- "- 收稿日期 编辑 王蔚
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