复旦学报医学版年月金属材料之一口腔环境是一个非常复杂的电解质环境并且有大量的微生物存在镍铬合金制作的修复体在口腔中行使功能时会发生各种形式的腐蚀在腐蚀过程中会有金属离子的析出研究发现是从镍铬合金中析出的主要金属离子从镍基合金中析出的金属离子进入口腔后引起牙龈的炎症变色细胞

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悠羽柴
5 years ago
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1 复旦学报医学版与相互作用对人牙龈成纤维细胞的生物学效应苏俭生罗真兰王海波同济大学口腔医学院修复科上海摘要目的分析表没食子儿茶素没食子酸酯 ) ) 及其相互作用对人牙龈成纤维细胞 --0) 的生物学效应方法用法检测 0) 的存活率运用彗星电泳检测细胞的损伤情况使用流式细胞仪法检测 0) 周期变化结果可呈时间依赖性抑制 0) 的生长造成细胞损伤并且可使细胞周期阻滞于期诱导细胞凋亡高浓度的 ) ) 5 可明显抑制 0) 生长使细胞的损伤与 ) ) 相互作用后增加了对 0) 的抑制的损伤及凋亡细胞也明显增加结论和 ) ) 相互作用后使对 0) 的抑制作用增强加剧 0) 的损伤和细胞周期阻滞并明显增加细胞凋亡关键词表没食子儿茶素没食子酸酯生物学效应彗星电泳人牙龈成纤维细胞中图分类号文献标志码 5; ) 0- - ) ) --0) ) 5-2 ) ) 5-0) ) 5) ) - 2 ) ) -0) ) ) 0) - 2 ) - -- 金属材料是口腔临床上常用的种材料之一在口腔医学中占有十分重要的地位被广泛用于牙列缺失和牙列缺损的修复颌骨缺损的修复口腔正畸种植牙根以及口腔医疗操作的设备等其中镍铬合金因具有良好的物理机械性能和稳定的生物学性能且价格低廉长期以来成为临床上应用广泛的国家自然科学基金项目

2 复旦学报医学版年月金属材料之一口腔环境是一个非常复杂的电解质环境并且有大量的微生物存在镍铬合金制作的修复体在口腔中行使功能时会发生各种形式的腐蚀在腐蚀过程中会有金属离子的析出研究发现是从镍铬合金中析出的主要金属离子从镍基合金中析出的金属离子进入口腔后引起牙龈的炎症变色细胞的突变及癌变等不良反应已经引起临床工作者的广泛关注茶是世界上饮用最普遍的饮料茶中含有许多具有化学保护和预防的成分而且它还富含类黄酮包括儿茶素及其衍生物绿茶中儿茶素的主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯 ) ) 无论在细胞培养还是体内肿瘤模型中都显示出显著地抑制癌细胞增殖的潜能也有许多研究表明 ) ) 对口腔鳞癌有细胞毒性且可诱导凋亡有学者研究发现 ) ) 的生物活性受金属离子尤其是过度金属离子的影响 ) ) 与金属离子尤其是过度元素金属离子间可发生复杂的化学反应并且改变其生物学活性和新陈代谢但是儿茶素与牙科铸造合金析出的金属离子间发生络合反应而形成络合物的生物学效应的研究国内外尚未见报道所以揭示儿茶素与牙科铸造合金析出的金属离子间的相互作用及其生成产物对正常细胞的生物学效应是非常必要的本研究旨在检测儿茶素的主要活性成分 ) ) 与镍铬合金铸造合金析出的之间相互作用后对人牙龈成纤维细胞 -- 0) 的生物学效应材料和方法化学药品及试剂上海国药集团化学试剂有限公司分析纯纯 ) ) 桂酰肌氨酸钠碱正常熔点琼脂糖低熔点琼脂糖碘化丙啶及溴化乙啶美国公司胎牛血清杭州四季青公司培养液胰酶及双抗青链霉素 5 上海生物工程有限公司粉和型胶原酶南京凯基生物科技发展有限公司波形蛋白抗体和细胞角蛋白抗体武汉博士德生物工程有限公司细胞培养应用改良酶消组织块培养法培养 0) 方法如下将牙冠及牙根龈缘冠方以上的牙齿浸泡于次氯酸钠溶液后用含庆大霉素冲洗次再将牙齿置于无血清的液中内含 5 青霉素 5 链霉素浸泡后用手术刀刮下牙颈部的牙龈组织将牙龈组织剪成大小的组织块将剪碎的组织块移入离心管中加入型胶原酶 55 吹打混匀后移入水浴震荡器处理 8 取出离心管加入 5 胎牛血清吹打混悬液后离心离心后弃去上清液加入含胎牛血清加双抗使混悬液含 5 青霉素 5 链霉素重悬细胞吹打组织块待组织块自然沉降后吸取上清液移入离心管中吸取离心管中的组织块至培养瓶中用牙科探针将其贴壁回收离心管中的上清液至培养瓶中培养箱中倒置培养后翻瓶继续培养方法 0) 的鉴定将第代 0) 细胞接种于孔板中的盖玻片上待细胞铺满盖玻片底部约时弃去培养液冲洗酒精固定冲洗加于湿盒内孵育用冲洗的正常山羊血清 8 湿盒内孵育加一抗鼠抗人波形丝蛋白单抗 8 下湿盒内孵育后冲洗加二抗标记的山羊抗鼠 ) 于 8 湿盒内避光孵育冲洗用 5 的处理冲洗甘油封片鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体作阴性对照作空白对照激光共聚焦显微镜观察细胞法检测细胞存活率取对数生长期的细胞经胰蛋白酶消化后用培养液制成浓度为 5 的细胞悬液接种于孔培养板中每个实验组个孔每孔 5 细胞悬液分别留个孔加细胞悬液和纯培养液的孔作为阴性和阳性对照 8 条件下培养待细胞贴壁生长后弃去原培养液冲洗遍加入 5 培养液及 5 不同浓度的 ) ) 5 及 5 继续培养和本实验选用 5 的 ) ) 分别与 5 的共同处理牙龈成纤维细胞以相应浓度的单独的处理组为对照组处理后每孔加入 5 液培养小心析出孔内培养液每孔加入 5 液室温下平板置微孔震荡器上震荡使结晶物溶解用酶标仪检测各孔的值细胞存活率计算如下细胞存活率 2 处理器空白阴性对照空白流式细胞仪法检测细胞细胞周期取对数生长

与 6AA 相互作用对人牙龈成纤维细胞的生物学效应 B 苏俭生等 = 期的细胞经胰蛋白酶消化后用培养液制成浓度为片即第层胶取 S 细胞悬液在 V 下与 -8S 的细胞悬液接种于孔培养板中每孔 8S于 V 培养 )5细胞细胞贴壁后去掉 S用 XO 液配制 Q 低熔点琼脂糖充分混匀后取 S 加入到第层胶上立即

3 与 6AA 相互作用对人牙龈成纤维细胞的生物学效应 B 苏俭生等 = 期的细胞经胰蛋白酶消化后用培养液制成浓度为片即第层胶取 S 细胞悬液在 V 下与 -8S 的细胞悬液接种于孔培养板中每孔 8S于 V 培养 )5细胞细胞贴壁后去掉 S用 XO 液配制 Q 低熔点琼脂糖充分混匀后取 S 加入到第层胶上立即加盖盖玻片原培养液 XO 冲洗一遍后加入 = 8S 培养液和 )V 固化 8 即第层胶取下盖玻片将凝胶 -S B 载玻片浸入新配制的裂解液中 = 80 -S -S S 的 6AA 80 B 80 和 6AA -S0B -S继续培养 )5然后弃去原培养液经胰蛋白酶消化后将细胞悬液分别转移到已编号的离心管中 -8 离心 8 弃去上清液各管加入 XO 缓冲液8S振荡悬液一边振荡一边加入 V 预冷的 Q 乙醇约 8S )V 冰箱固定过夜固定好的 -8 细胞经离心 8 弃去上清液 XO -S -S Q 月桂酰肌氨酸钠 880 6UCB Q 的 0 I 和 Q UF )V 裂解 5从裂解液中取出载玻片用蒸馏水洗去多余的盐分移入水平电泳槽解旋 8 -S 6UCB -S BF T 电压 8C 电流低温避光电泳缓冲液漂洗两次将细胞悬液移至样品管中每管 -S 8 )80 2 漂洗次每次 = -8S 溴化乙锭 8 然后滴加 )V 避光保存保中加入 2 S V 水浴 8 加入碘化丙啶 )S避光室温下保存 8 流持湿润)5 内观察以防荧光猝灭同步照相每剂量点张片子每张片子分析个细胞用彗星式细胞仪测定细胞各增殖周期的 UBC 百分含量图像软件 CX 对 UBC 损伤参数进行图像分析彗星电泳法检测细胞细胞 UBC 损伤取对数生数据分析采用 X= 统计软件对本实验长期的细胞经胰蛋白酶消化后用培养液制成浓度为数据进行分析所有数据记录为? F M -8S的细胞悬液接种于孔培养板中每孔 8S于 V培养 )5细胞贴壁后去掉原培养液 CBFTC 和 M0 2 检验< 为差异有统计学意义 XO冲洗一遍后加入 = 8S 培养液和 S 的 -SB 6AA 80 结果 -S和 6AA -S0B -S 继续培养) 5然后弃去原培养液经胰蛋白酶消化后将细胞悬液分别转移到以编号的离心管中 S 原代培养细胞鉴定结果 A 原代培养细胞鉴定结果显示图 A 成长梭形卵圆形 -8 离心 8 弃去上清液各管加入 XO 缓冲液 8S调整细胞浓度为 -8S用 XO 液配制核免疫荧光染色可见抗波形丝蛋白阳性细胞质的 Q 正常熔点琼脂糖熔解后加在事先准备好的质阴性细胞核染成蓝色符合中胚层来源的成纤载玻片上加盖盖玻片 )V 下固化 8 揭去盖玻维细胞样细胞的特征棕黄色染色细胞核染成蓝色抗角蛋白阴性细胞图 ES 免疫组化染色结果KE ;;0-2 2 ; S KE E) 2 C 0 2 < 0 8 O < 0 P = 及其相互作用对细胞存活率的影响法检测 6AAB 及其相互作用对细胞存活率的影响结果显示图 6AA 浓度小于 80 -S 时对 A 的生长几乎无影

复旦学报医学版年月响细胞存活率都大于当细胞浓度在 5 时 ) ) 呈浓度及时间依赖性抑制 0) 的生长浓度大于 5 时细胞的存活率维持在一个很低的水平当不同浓度处理 0) 时呈现出明显的时间依赖性处理时细胞增殖无明显影响细胞存活率都在以上处理及时细胞的存活率随时间延长而降低且当浓度大于 5 时其对细胞的抑制呈浓度依赖性 ) ) 与相互作用后的结果显示图

4 复旦学报医学版年月响细胞存活率都大于当细胞浓度在 5 时 ) ) 呈浓度及时间依赖性抑制 0) 的生长浓度大于 5 时细胞的存活率维持在一个很低的水平当不同浓度处理 0) 时呈现出明显的时间依赖性处理时细胞增殖无明显影响细胞存活率都在以上处理及时细胞的存活率随时间延长而降低且当浓度大于 5 时其对细胞的抑制呈浓度依赖性 ) ) 与相互作用后的结果显示图 ) ) 与相互作用后可明显增加对两种细胞存活率的抑制作用且随着浓度增加抑制作用也增强及其相互作用对 50 周期的影响选用 5 ) ) 5 和 5) ) 5 作用于 0) 用流式细胞法检测细胞周期变化表图结果显示 5) ) 处理 0) 后对细胞周期的影响不明显也未见明显凋亡细胞作用于 0) 后期细胞明显增加 ) ) 期明显减少凋亡细胞比例显著增加 ) ) 与相互作用后 ) 期与期细胞比例降低细胞 ) ) 期的细胞和凋亡细胞显著增加图对 50 存活率的影响 0 50 ) ) - - 图对 50 存活率的影响及其相作用对细胞 6 的损伤用彗星电泳的方法检测的损伤表图结果显示 5 以下的 ) ) 对 0) 后彗星尾长度彗星尾含量及都无明显影响而 5) ) 处理 0) 后彗星尾长度彗星尾含量及都有显著增加 5 及以上的可使 0) 的彗星尾长度彗星尾含量及显著增加选用 5 ) ) 与 5 共同作用于 0) 图结果显示与 ) ) 相互作用后明显使 0) 的值增加图与共同处理 50 后的细胞存活率 0 50 ) ) 表 - 与相互作用对 50 细胞周期的影响 ) ) ) ) ) ) ) )

5 与 6AA 相互作用对人牙龈成纤维细胞的生物学效应 B 苏俭生等 = 图 Q 及其相互作用对 S 细胞周期的影响 2 <-@ R 2-2 S Q 表 I 对 ST 损伤的彗星电泳结果? ) - 2 <-@ -S 080 -S UBC 808 F 808 6AA = = ) = = ) = = ) B = = = )= = )) = )= ) = ) = ) ) = ) = ) )= = = ) = = = = ) = = -S< M < = 8

复旦学报医学版年月 ) 图 V 慧星电泳法检测及其相互作用对 ST 的损伤KI @<;< - 2 < 2-2 <-@ 2-S 8 2; < < VTC KI 6 5 8E 082-8SS-2 间依赖性抑制 A 的生长这个结果说明 6AA 在低浓度时不影响 A 的生长而在高浓度时明显抑制其生长6AA 与 B 相互作用后使 B 对细胞生长的抑制作用增

6 复旦学报医学版年月 ) 图 V 慧星电泳法检测及其相互作用对 ST - 2 < 2-2 <-@ 2-S 8 2; < < VTC KI 6 5 8E 082-8SS-2 间依赖性抑制 A 的生长这个结果说明 6AA 在低浓度时不影响 A 的生长而在高浓度时明显抑制其生长6AA 与 B 相互作用后使 B 对细胞生长的抑制作用增强细胞形态上的变化也加剧图 W 及其相互作用 UBC 是细胞内具有遗传信息传递作用的一种重要的生物大分子有多种因子能够引起细胞的 UBC 损对 ST 的损伤作用伤例如电离辐射 - 2 < 2-2 WTC 子等彗星电泳是研究低剂量遗传毒理效应的有效工 <-@ 2-S 具这种方法具有灵敏度高需要的样品量少应用范 )< < = 围广材料消耗少技术简单时间短可进行单细胞水平的原位检测等优点其最突出的优点是在单细胞水平测量 UBC 损伤彗星电泳分析的指标很多单一的讨论指标不能很好地说明细胞 UBC 损伤的程度经过多年镍铬合金是我国目前应用广泛的牙科铸造合金技术的发展与革新后彗星尾长度彗星尾 UBC 含量时会因口腔内复杂的电解质及微生物环境而发生各 08 及 F 08 ) 项指标是最常用且被国内外学者认可的指标因此本实验采用彗星种腐蚀其中最重要的就是电化学腐蚀这种腐蚀尾长度彗星尾 UBC 含量 08 及 F 可使合金中的金属离子进入口腔并可吸收进入血液循环从而引起一些生物学效应如局部的炎症着及其相互作用对 08 )项指标来说明 6AA B -S 及以上的 AUBC 的损伤结果显示 80 色等有研究表明镍铬合金主要的析出离子为浓度 B 处理 A) 5后彗星尾长度彗星尾 UBC B B 可通过多种途径进入细胞与某些生物成分结合并改变多种细胞系细胞的功能形态和超含量 08 及 F 08 显著增加说明 UBC 的损伤是比较明显的 -S 及以下的 80 微结构 )B 还具有氧化还原活性能削弱细本实验结果表 6AA 处理 A 后彗星尾长度彗星尾 UBC 含量说明细 08 及 F 08 无明显变化明 B 处理 A 时呈现出明显的时间依赖性抑制细胞生长处理 )5 时细胞增殖无明显影响细胞 UBC 损伤不明显 -S 及以上的 6AA 处 80 理 A 后彗星尾长度彗星尾 UBC 含量胞存活率都在 Q 以上处理 )5 及 5 时细胞的存活率随时间增加而降低且当浓度大于 08 及 F 08 才有明显增加说明低浓度的 6AA 对 A 的 UBC 是无损伤的而高浓度 -S 时其对细胞的抑制呈浓度依赖性这说 80 明 B 的细胞毒性不仅与浓度有关作用时间也是的 6AA 可使 A 的 UBC 发生损伤6AA 与相互作用后处理 A 时 F B 08 值较之一但用镍铬合金制作的义齿在口腔内行使功能胞对过氧化反应的防御机制 ) ) 至关重要的这个结果与最新的研究相似 )) 处理组的 F 单独的 6AA 处理组和 B -S 时对 A 的生长几 6AA 浓度小于 80 乎无影响细胞存活率都大于 Q 当细胞浓度在相互作用 08 值有明显增高说明 6AA 与 B 后使 A 的 UBC 损伤明显加剧流式细胞仪检测细低浓度的 6AA 对 A 的细胞周期胞周期结果显示 -S 到 80 -S 时 6AA 成浓度及时 80

7 苏俭生等与 ) ) 相互作用对人牙龈成纤维细胞的生物学效应无明显影响而处理 0) 后期细胞明显增加且可见部分凋亡细胞说明使细胞阻滞于期 ) ) 与相互作用后两种细胞的细胞周期阻滞于 ) ) 期且凋亡细胞也增多与单独作用相比 ) ) 与相互作用后凋亡细胞增加说明 ) ) 与相互作用后使对细胞的毒性增强结论能抑制 0) 的生长且具有时间和浓度依赖性高浓度的 ) ) 也可抑制 0) 的生长与 ) ) 相互反应后使对 0) 的抑制作用增强了和高浓度的 ) ) 可使 0) 的发生损伤与 ) ) 相互作用后使 0) 的损伤加剧作用于 0) 后具有细胞周期阻滞作用且可诱导细胞凋亡 ) ) 和相互作用后细胞的凋亡增加参考文献 5 ) )) ) 0-0 ) ) ) 5) ) 5 ) ) ) 0- ; ) ) ; ) ) 收稿日期编辑王蔚

第期马海燕等臭氧水和超声波协同作用在速冻西兰花中的应用研究材料与方法臭氧水的制取臭氧水处理超声波处理超声波和臭氧水协同处理对照处理邻苯二胺分光光度法测

第期马海燕等臭氧水和超声波协同作用在速冻西兰花中的应用研究材料与方法臭氧水的制取臭氧水处理超声波处理超声波和臭氧水协同处理对照处理邻苯二胺分光光度法测第卷第期年月食品与生物技术学报臭氧水和超声波协同作用在速冻西兰花中的应用研究马海燕张慜孙金才食品科学与技术国家重点实验室江南大学江苏无锡海通食品集团股份有限公司浙江慈溪由于速冻蔬菜加工过程中的热烫处理对