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黛经
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1 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (5): 丹参酮增强顺铂抗前列腺癌作用及分子机制研究 * 侯莉莉, 许秋菊, 胡国强, 谢松强 ( 河南大学化学生物学研究所, 河南开封 ) 摘要 : 探讨丹参酮增强顺铂抗前列腺癌作用及其分子机制采用 MTT 法检测细胞增殖, 流式细胞仪检测细胞周期变化及凋亡率, Western blotting 检测蛋白的表达水平, 高效液相色谱法检测细胞内顺铂含量结果表明 : 丹参酮通过增加细胞内顺铂浓度从而产生协同抗细胞增殖作用, 两者联用可诱导 LNCaP 及 PC3 细胞周期阻滞于 S 期并引起细胞凋亡, caspase 及 Bcl-2 家族成员均参与了该凋亡过程提示丹参酮能明显增强顺铂的抗前列腺癌作用, 并对激素依赖性和非依赖性前列腺癌均有效关键词 : 丹参酮 ; 顺铂 ; 细胞周期 ; 细胞凋亡 ; 增效作用中图分类号 : R963 文献标识码 : A 文章编号 : (2013) Synergistic antitumor effects of tanshinone in combination with cisplatin via apoptosis in the prostate cancer cells HOU Li-li, XU Qiu-ju, HU Guo-qiang, XIE Song-qiang * (Institute of Chemical Biology, Henan University, Kaifeng , China ) Abstract: Treatment with the combination of Chinese herbs and cytotoxic chemotherapies showed a higher survival rate in clinical trials. In this report, the results demonstrated that the tanshinone ⅡA, a key component of Salvia miltiorrhiza bunge, when it is combined with the cytotoxic drug cisplatin showed synergistic antitumor effects on human prostate cancer PC3 cells and LNCaP cells in vitro. Antiproliferative effects were detected with MTT assay. Cell cycle distribution and apoptosis were detected by flow cytometer. Protein expression was detected by Western blotting. The intracellular concentration of cisplatin was detected by high performance liquid chromatography. The results demonstrated that tanshinone significantly enhanced the antiproliferative effects of cisplatin on human prostate cancer PC3 cells and LNCaP cells with the increase of the intracellular concentration of cisplatin. These effects were correlated with cell cycle arrested at S phase and cell apoptosis. The apoptosis might be achieved through death receptor pathway and mitochondrial pathway. Bcl-2 family members were also involved in this apoptotic process. combination of tanshinone Furthermore, the Collectively, these results indicated that the and cisplatin had a better treatment effect in vitro not only on androgen-dependent LNCaP cells but also on androgen-independent PC3 cells. Key words: tanshinone ⅡA; cisplatin; cell cycle; apoptosis; synergism 前列腺癌是老年男性常见的恶性肿瘤之一, 在收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 河南省基础与前沿技术研究项目 ( ); 河南省高校青年骨干教师资助计划 (2009GGJS-022). * 通讯作者 Tel: , Fax: , kfxsq@yahoo.com.cn 欧美地区发病率很高, 占男性恶性肿瘤的第 2 位 ; 虽然前列腺癌在我国发病率较低, 但随着老年人口的增加, 有逐年增加的趋势在男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中, 前列腺癌发病率已居第 3 位, 影响着我国 50 [1, 岁以上男性的生活质量和预期寿命 2] 前列腺癌敏感的化疗药物有顺铂环磷酰胺 5- 氟尿嘧啶阿霉

2 676 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (5): 素等, 但由于严重的毒副作用限制了它们的临床应用 [3] 丹参为唇形科鼠尾草属植物的干燥根部, 具有活血化瘀功效, 入药历史悠久丹参酮为丹参根部的乙醚或乙醇提取物, 是丹参的主要有效成分按其不同的化学结构分为丹参酮 I 丹参酮丹参酮 Ⅱ B 隐丹参酮 IV 等 15 种成分 [4] 研究表明丹参酮对多种肿瘤细胞均具有杀伤诱导分化和凋亡等作用, 丹参酮目前在白血病肝癌胃癌等临床治疗中已有应用, 且表现出较好的疗效 [5], 丹参酮能否运用到前列腺癌的临床治疗尚有待大量的实验研究及临床试验探索和证实联合化疗是临床治疗恶性肿瘤最常见的方式之一, 本文对丹参酮是否增强前列腺癌敏感的化疗药物顺铂的作用进行探讨, 以期为临床应用提供实验依据材料与方法药品与试剂胰蛋白酶 RPMI 1640 及胎牛血清 (Gibco 公司 ); MTT DFMO 丹参酮顺铂碘化丙啶等 (Sigma 公司 ); caspase-8 caspase-9 caspase-3 Bcl-2 Bax Bid 等一抗及相应的二抗 (Cell Signaling Technology 公司 ); Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒 ( 碧云天生物技术研究所 ) 细胞培养前列腺癌 PC3 细胞及 LNCaP 细胞均购于中国科学院上海细胞生物学研究所, 用含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基培养 [6] MTT 测试取 PC3 细胞及 LNCaP 细胞, 以细胞数 5 000/ 孔接种于 96 孔板培养 12 h 后, 加入不同浓度的丹参酮或 ( 和 ) 顺铂 ( 两者均用二甲基亚砜配制成 10 mmol L 1 的储存母液, 用时稀释成相应工作液浓度 ) 48 h 后每孔加入 5 g L 1 MTT 溶液 10 μl, 继续培养 4 h 后每孔加入二甲基亚砜 100 μl, 37 振荡 30 min 后用酶标仪在 570 nm 波长处检测其吸光度值, 按公式计算细胞抑制率 : 细胞抑制率 = (1 实验组吸光度值 / 对照组吸光度值 ) 100% [6] 联合用药指数 (CI) = E (A+B) /[E A +(1 E A )E B ], E (A+B) 为两药合用时的抑制率, E A 和 E B 分别为单用时的抑制率, CI 为 0.85~1.15 时表示两药作用相加, CI > 1.15 时表示两药作用协同, CI < 0.85 时表示两药作用拮抗 [7] 流式细胞仪检测细胞周期胰酶消化收集各浓度药物作用 48 h 后的 PC3 细胞或 LNCaP 细胞, PBS 洗涤 2 次, 70% 乙醇 ( 含 27% PBS, 3% 血清 ) 于 20 固定 12 h, 离心弃上清液, PBS 洗涤后用 RNA 酶 (1 mg ml 1, 200 μl) 37 孵育 30 min, 碘化丙啶染色, 流式细胞仪检测细胞周期 ( 激发波长 480 nm, 吸收波长 630 nm) [6] 流式细胞仪检测细胞凋亡率经丹参酮 ( 和 ) 顺铂作用 48 h 后, 离心 (2 000 r min 1, 5 min) 收集细胞用 PBS 洗涤细胞 1 次 (2 000 r min 1 离心 5 min) 并收集细胞加入结合缓冲液 (binding buffer) 悬浮细胞液 500 μl 加入 Annexin V-FITC 5 μl 混匀后, 再加入碘化丙啶 5 μl 混匀室温, 避光, 反应 15 min, 在 1 h 内进行流式细胞仪的观察和检测 ( 激发波长 488 nm, 发射波长 530 nm) [6] Western blotting 检测蛋白的表达或收集经丹参酮或 ( 和 ) 顺铂处理 48 h 后的细胞, 加入细胞裂解液 ( 碧云天生物技术研究所 ), 在冰上裂解 30 min, 于 g 离心 15 min, 取上清液蛋白定量后分别取蛋白 50 μg 加入上样缓冲液, 95 变性 10 min 12% 聚丙烯酰胺 -SDS 凝胶电泳后, 电转移至硝酸纤维素膜上, 5% 脱脂奶粉封闭后依次加入一抗和二抗, 室温孵育 2 h, TBST 缓冲液洗涤 5 次, 每次 10 min 加入化学发光试剂后放入暗盒中压片并依次显影定影摄像, 采用凝胶成像分析软件分析每条蛋白电泳条带的灰度值 [6] 高效液相色谱仪测定细胞内顺铂含量经顺铂单用及联用丹参酮作用 48 h 后, 离心 (2 000 r min 1, 5 min) 收集细胞用 PBS 洗涤细胞 2 次 (2 000 r min 1 离心 5 min), 收集细胞并计数细胞裂解后提取上清液, 应用高效液相色谱仪测定细胞内顺铂的含量 ( 顺铂的浓度以测定每个细胞中的顺铂量表示 ) 色谱条件 : 氨基键合硅胶柱, 样品溶剂为二甲基甲酰胺, 流动相为乙酸乙酯甲醇二甲基甲酰胺水 ( ), 检测波长为 310 nm, 流速 1.5 ml min 1, 进样量 20 μl 统计学处理所有数据均用 x ± s 表示, 组间比较应用 SPSS12.0 统计包进行单因素方差分析结果 1 丹参酮影响或 ( 和 ) 顺铂对前列腺癌细胞生长的 PC3 细胞或 LNCaP 细胞经不同浓度的丹参酮或顺铂作用 48 h 后, 细胞增殖均受到不同程度的抑制 ( 表 1), IC 50 分别为 (62.1 ± 5.4) (0.99 ± 0.13) 及 (56.4 ± 4.2) (0.75 ± 0.09) μmol L 1 ; 而丹参酮

3 侯莉莉等 : 丹参酮增强顺铂抗前列腺癌作用及分子机制研究 677 (20 μmol L 联用顺铂后对 PC3 细胞和 LNCaP 细胞的 IC 50 分别为 (0.07 ± 0.02) 及 (0.06 ± 0.01) μmol L 1, 提示应用低剂量的丹参酮 ⅡA (20 μmol L 能明显增强顺铂对 PC3 细胞及 LNCaP 细胞的生长抑制作用联合用药指数 (CI) 表明, 20 μmol L 1 丹参酮 ⅡA 与顺铂联用后 CI 值均大于 0.85 ( 但与 0.01 μmol L 1 顺铂联用对 LNCaP 细胞的作用除外, 其 CI 值为 0.8 ± 0.1), 提示联合用药后发生了协同或相加作用, 而 0.05 μmol L 1 顺铂联用丹参酮 ⅡA (20 μmol L 的 CI 值最高, 故选择该剂量联用进行抗前列腺癌分子机制探讨此外, 高效液相色谱仪检测表明 : 单用顺铂 (0.05 μmol L 时 LNCaP 细胞内顺铂的含量为 (5.3 ± 0.4) ng/10 6 个细胞, 而联用丹参酮 ⅡA (20 μmol L 后的含量为 (7.8 ± 0.6) ng/10 6 个细胞, 提示丹参酮 ⅡA 通过增加细胞内顺铂浓度而产生协同抗前列腺癌作用 Table 1 The synergistic antiproliferative effects of tanshinone (Tan) and cisplatin (Cis) on PC3 cells and LNCaP cells after 48 h. CI: Combination indices. n = 3, x ± s Treatment (μmol L Growth inhibited rate/% LNCaP cell PC3 cell LNCaP cell PC3 cell Tan (10) 8.6 ± ± Tan (20) 12.9 ± ± Tan (40) 38.5 ± ± Tan (80) 65.2 ± ± Tan (160) 82.4 ± ± Cis (0.01) 9.4 ± ± Cis (0.05) 14.5 ± ± Cis (0.1) 31.8 ± ± Cis (1) 45.2 ± ± Cis (10) 83.4 ± ± Tan (20) + Cis (0.01) 17.6 ± ± ± ± 0.1 Tan (20) + Cis (0.05) 49.5 ± ± ± ± 0.5 Tan (20) + Cis (0.1) 71.8 ± ± ± ± 0.4 Tan (20) + Cis (1) 86.4 ± ± ± ± 0.2 Tan (20) + Cis (10) 92.7 ± ± ± ± 0.1 CI 2 丹参酮凋亡的影响或 ( 和 ) 顺铂对前列腺癌细胞周期及丹参酮 ⅡA (20 μmol L 单用对细胞周期的影响与对照组相比无显著性差异, 而顺铂 (0.05 μmol L 单用则诱导 G 0 /G 1 期细胞比例降低而 S 期细胞显著增多, 提示顺铂可阻滞细胞周期于 S 期, 与对照组相比差异具有统计学意义 (P < 0.05); 两者联用后, 上述作用显著增强 (P < 0.01), 提示丹参酮增强了顺铂对细胞周期的影响此外, 实验结果表明联用后 Sub-G 1 峰明显升高, 提示可能诱导细胞发生了凋亡 ( 表 2 和图 1A) 为了进一步证明 Sub-G 1 峰为细胞凋亡峰, 应用凋亡特异性荧光染料 Annexin V-FITC 以及 PI 双标法进一步检测, 结果表明 : 与阴性对照组相比, 丹参酮与顺铂联用后右上象限 ( 晚期凋亡 ) 及右下象限 ( 早期凋亡 ) 的凋亡细胞百分率显著增加, 确证丹参酮与顺铂联用诱导细胞发生了凋亡 ( 表 3 和图 1B) Table 3 Effects of tanshinone (Tan, 20 μmol L and cisplatin (Cis, 0.05 μmol L on apoptosis of LNCaP cells and PC3 cells after 48 h. n = 3, x ± s. * P < 0.05, ** P < 0.01 vs control group Group LNCaP cell Apoptosis rate/% PC3 cell Control 3.5 ± ± 0.7 Tan 6.9 ± ± 0.9 Cis 14.8 ± 1.9 * 11.5 ± 1.2 * Tan + Cis 42.8 ± 3.4 ** 39.4 ± 3.6 ** 3 丹参酮关蛋白的影响或 ( 和 ) 顺铂对前列腺癌细胞凋亡相 LNCaP 及 PC3 细胞经丹参酮 ⅡA (20 μmol L 作用 48 h 后 caspase-3 caspase-8 caspase-9 Bcl-2 Bid 及细胞色素 c 等与阴性对照组相比均无明显变化 ; 顺铂 (0.05 μmol L 单用可诱导 caspase-3 caspase-8 caspase-9 活化以及 Bcl-2 Bid 蛋白表达降低而 Bax 蛋白表达增加, 但细胞浆内细胞色素 c 的表达并无明 Table 2 Effects of tanshinone (Tan) and cisplatin (Cis) on cell cycle distribution of LNCaP cells and PC3 cells after 48 h. n = 3, x ± s. * P < 0.05, ** P < 0.01 vs control group Treatment (μmol L LNCaP cell PC3 cell Sub-G 1 G 0/G 1 S G 2/M Sub-G 1 G 0/G 1 S G 2/M Control (0) 2.4 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.9 Tan (20) 5.6 ± ± ± ± ± ± ± ± 0.7 Cis (0.05) 15.2 ± 2.1 * 64.9 ± 2.8 * 22.5 ± 2.7 ** 12.6 ± 2.9 * 12.9 ± 1.4 * 65.2 ± 2.1 * 21.2 ± 1.9 ** 13.6 ± 2.4 * Tan (20) + Cis (0.05) 39.6 ± 2.7 ** 56.3 ± 2.1 ** 28.9 ± 1.8 ** 14.8 ± 0.5 * 36.1 ± 3.2 ** 58.3 ± 2.4 ** 26.6 ± 1.5 ** 15.1 ± 0.9 *

4 678 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (5): Figure 1 Effect of tanshinone (Tan) and cisplatin (Cis) on cell cycle distribution and cell apoptosis of LNCaP cells after 48 h 显增强 ; 两者联用后上述作用明显增强且细胞浆内细胞色素 c 的表达也明显增加 ( 图 2) 讨论早期前列腺癌的细胞类型多以雄激素依赖性细胞为主, 接受内分泌治疗之后, 雄激素依赖性细胞大量凋亡, 而雄激素非依赖性细胞逐渐成为主要的细胞类型因此针对不同的前列腺癌细胞类型, 治疗前列腺癌的药物可以大致分为激素类治疗药物和细胞毒类治疗药物两类 [8] 由于上述药物均存在严重的毒副作用限制了它们在临床的广泛应用, 临床亟待新的药物或新的治疗方案治疗前列腺癌以往的研究表明, 丹参酮 ⅡA 对多种肿瘤细胞如人早幼粒白血病 NB4 红白血病 K562 肝癌 SMMC7721 鼻咽癌 CNE1 肺腺癌 SPCA1 非小细胞肺癌 A549 等细胞均具有良好的增殖抑制作用 [9], 但是否对前列腺癌同样有效并不清楚顺铂是 DNA 损伤药物, 被广泛应用于恶性肿瘤的治疗, 但严重的毒副作用是其缺点之一, 而联合用药也是临床常用的治疗方案, 故本文以雄激素依赖性 LNCaP 细胞以及雄激素非依赖性 PC3 细胞为研究对象, 研究在毒副作用较小的剂量下丹参酮 ⅡA 与顺铂联用是否同样具有良好的抗前列腺癌作用及其分子机制本实验结果表明, 丹参酮 ⅡA 与顺铂联用对雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌细胞均具有明显的生长抑制作用, 且可诱导两类细胞凋亡及细胞周期 [10] 阻滞, 该作用与 Liu 等报道的力达霉素增强顺铂诱导人肝癌 BEL-7402 细胞凋亡的作用相似 ; 两者联用的抗前列腺癌作用比顺铂单用显著增强, 而高效液相色谱仪检测结果表明丹参酮 ⅡA 提高了细胞内顺铂的含量, 提示该作用是两者产生协同抗肿瘤作用的物质基础诱导肿瘤细胞凋亡是顺铂产生抗肿瘤作用最重要的分子机制之一, 凋亡主要通过膜死亡受体通路和 ( 或 ) 线粒体通路进行本研究表明丹参酮 ⅡA 与顺铂联用可诱导 caspase-8 caspase-9 caspase-3 活化, 由于 caspase-8 和 caspase-9 的活化分别是膜死亡受体通路和线粒体通路凋亡的标志性蛋白, 提示两种信号通路共同参与了该凋亡过程 Bcl-2 家族成员分为两大类, 即抗凋亡蛋白如 Bcl-2 和促凋亡蛋白如 Bax, 它们往往参与调控线粒体的结构和功能, Bid 是连接膜死亡受体通路和线粒体通路的关键蛋白, caspase-8 可通过活化 Bid 为 tbid 从而作用于线粒体并通过线粒体通路诱导凋亡两者失调后可引起线粒体膜损伤从而使细胞色素 c 由线粒体释放到胞浆中, 并最终通过线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡 [11] 实验结果表明, 丹参酮 ⅡA 与顺铂联用可诱导抑制凋亡的 Bcl-2 表达下调促进凋亡的 Bax 及 Bid 表达上调及细胞色素 c 释放到胞浆, 这进一步证明了 Bcl-2 家族成员参与了线粒体凋亡通路故本实验为前列腺癌的治疗提供了新思路以及进一步研究的理论基础

5 侯莉莉等: 丹参酮ⅡA 增强顺铂抗前列腺癌作用及分子机制研究 679 Figure 2 Effects of tanshinone ⅡA (Tan, 20 μmol L 1) and cisplatin (Cis, 0.05 μmol L 1) on expressions of caspase-3, caspase-8, caspase-9, cytochrome c (Cyto c), Bcl-2, Bid and Bax in LNCaP cells (A) and PC3 cells (B) after 48 h. The level of protein expression was quantified by densitometry analysis using Gel imaging system. n = 5, x ± s. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group References carcinoma and its molecular mechanism [J]. [1] (药学学报), 2011, 46: Gururajan M, Posadas EM, Chung LW. Future perspectives of prostate cancer therapy [J]. Transl Androl Urol, 2012, 1: [7] [2] Jiang H, Zhang L, Liu J, et al. Knockdown of zinc finger Higano CS. Sexuality and intimacy after definitive treatment cancer [J]. [9] Slovin S. Chemotherapy and immunotherapy combination in Clin Adv Hematol Oncol, 2012, J Clin Oncol, 2012, 30: Zhang Y, Wei RX, Zhu XB, et al. Tanshinone IIA induces apoptosis and inhibits the proliferation, migration, and invasion of the osteosarcoma MG-63 cell line in vitro [J]. Anticancer Drugs, 2012, 23: Zhao SJ, Zhang JJ, Yang L, et al. Determination and biosynthesis [10] Liu HZ, Li DD, Zhen YS, et al. Potentiation and mechanism of multiple salvianolic acids in hairy roots of Salvia miltiorrhiza of cisplatin-induced apoptosis by lidamycin in human hepatoma [J]. BEL-7402 cells [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2011, 46: Wei X, Zhou L, Hu L, et al. Tanshinone IIA arrests cell cycle and induces apoptosis in 786-O human renal cell carcinoma cells [J]. [6] Pain, 2002, 98: induces apoptosis by activating caspase-3 and caspase-9 [J]. 10: [5] The interaction index: a measure of drug synergism [J]. protein X-linked inhibits prostate cancer cell proliferation and advanced prostate cancer [J]. [4] Tallarida RJ. and subsequent androgen deprivation therapy for prostate Cancer Gene Ther, 2012, 19: [3] [8] Acta Pharm Sin Oncol Lett, 2012, 3: Xie SQ, Zhang LL, Yang T, et al. Acetylsalicylic acid strengthens the effects of ANISpm against hepatocellular Acta Pharm Sin (药学学报), 2003, 38: [11] Cheng CY, Su CC. Tanshinone IIA may inhibit the growth of small cell lung cancer H146 cells by up-regulating the Bax/ Bcl-2 ratio and decreasing mitochondrial membrane potential [J]. Mol Med Report, 2010, 3:

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼,

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼, 1072 基础研究 Basic Research www.tumorsci.org 肿瘤 2011 年 12 月第 31 卷第 12 期 TUMOR Vol. 31, December, 2011 DOI: 10.3781/j.issn.1000-7431.2011.12. 004 Copyright 2011 by TUMOR 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat