計畫編號:DOH93-DC-2031
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- 桶 廉
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4 Abstract Yersinia pestis is the causative pathogen of plague. This disease is still prevalent to some degree and happens sporadically in Asia, Africa, and Americas. Besides, international travel nowadays is extremely convenient and popular, and bio-terrorism is threatening the entire world. Those factors make an effective and speedy plaque control system indispensable. The objectives of this study are four folds: to set up a standard diagnostic method for Yersinia pestis detection and identification, to prepare antigen and antibody ourselves with purification capability, to improve our currently used laboratory methods dealing with the disease to conform with the WHO standards, and to set up a comprehensive plague reference laboratory. What we have accomplished so far are the followings: having successfully purified 17Kd F1 capsule antigen, made two strains of F1 IgG hybridoma cells in high production, used purified antibody to prepare a direct immunofluorescene assay reagent, used modern real-time PCR technology in developing a fast diagnostic test for plague detection, and established the 16S rdna sequence as one of its identities. Furthermore, we have completed the 2004 annual serological study by ELISA on 385 field rodents trapped in the international harbor areas of this country. The results are all negative. Along with the maturing of bacterial molecular technology, molecular detecting methods will inevitably become more important in the days to come. Therefore, our next step in research will focus on something like: how to design suitable primers and probes, and how to extract maximum DNA template from various specimens for the purposes of our laboratory screening and identification work. Key wordsplague, F1 antigen, monoclonal antibody, ELISA 4
5 1894 逹 1,2 200 逹 100% (Yersinia spp) Yersinia pseudotuberculosis Yersinia enterocolitica Y. pseudotuberculosis 5000 Y pseudotuberculosis Y. pestis 5
6 3 携 1 70-Kbp pcd1 携 type III (Yersinia outer protein: Yop) LcrV 2 100Kbp pmt1 携 F1 (murine toxin)3 9.6Kbp pcp 携 (bacteriocin) 酶 (protease) 酶 (plasminogen activator protease) pcd1 Y. pestisy. pseudotuberculosis Y. enterocolitica pmt1pcp Y. pestis 4 Phage Yersinia spp F1 ELISAlatex PHA 1,5 pmt1 caf1 Inv pcp pla pcd1 yopm multiplex PCR 6 6
7 F1 37 F1 F1 8,9 F1 1,7 17,18 (Multiplex PCR) F1 PHA IHAF1 I II III IX XELISA XI 16S RNA XIII real time PCR 7
8 . K/A(Yersinia pestis Yreka, PMBP-0019)A/A pcp Yersinia pseudotuberculosis ATCC6902 Yersinia enterocolitica ATCC23715F1 5%sheep blood Brain heart infusion agar 37 5%CO F %NaCl Amicon XM300 YM 10 ultrafiltration membrane 30% Seperdex-200 Hiload preparative gel filtration column Gerand BALB/c ICR 37 Y. pestisk/a 8
9 ml (5660 ) F1 3ml(1mg/5ml) Freund Adjuvant 3ml 5ml 10ug/0.2ml ( Complete Freund Adjuvant Incomplete Freund Adjuvant ) BALB/c Y. pestisk/aa/a Pristene NS-1. ELISA g F1 /100l coating 96 ELISA 370 Y. pestisy. pseudotuberculosis F1 (PHA) 9
10 40 3 SD ELISA cut point 0.1g F1 Ag/ 100l coating 96 ELISA plate4 overnight( 16h)200l/ well Blocking Buffer, 4 overnightblocking buffer, 100l/ well 37 30minsPBS-T wash 5 HRP Stabilizer HRP conjugate l/ well 37 30minsPBS-T wash l/ well TMB substrate 15mins 100l/ well TMB stop solution ELISA readermrc TC II, DYNEX 450nm OD.F1 5 BALB/c 5 F1 Complete Freund Adjuvant 50g/0.2ml14 Incomplete Freund Adjuvant 50g/0.2ml14 0.2ml50ug/0.2ml PBS ml30 g/0.2ml 3 4 NS-1 10
11 T-80 DMEM PEG1000 serum-free DMEM NS-1 spleen cell 50ml 600rpm10 37 PEG 2 0.2ml PEG PEG 2 8ml DMEM 30mlHAThypoxathine, aminopterin, and thymidine-10 DMEM 37incubactor well well l 37 5% CO FCS HAT-DMEM 3 10FCS HAT-DMEM 3 HT-DMEM ELISA subcloning Ig. F1 10%FCS DMEM PBS /ml 8 BALB/c 15 2ml BALB/c pristane 0.5ml 11
12 3000rpm rpm15 4 PBS PBS4 3000rpm fluorescin isothiocyante(fitc)dmso 12.5mg/ml 1mg FITC 50ug Sephadex G Y. pestis Y. pseudotuberculosis Y. enterocolitica 抺.16SrDNA Applied Biosystems DNA (DNA ) 20l QLAGEN Protease ( Proteinase K)Vortexing 15sec56 sample 200l Buffer AL pulse-vortexing 15sec7010min Spin-down 200l(96~100%)ethanolpulse-vortexing 15sec spin-downtransfer QLAamp Spin Column8,000rpm 12
13 1min collection tube 500l Buffer AW1 8,000rpm 1min collection tube 500l Buffer AW213,500rpm 3min 1min QLAamp Spin Column 1.5ml tube 200l Buffer AE 1min8,000rpm 1minDNA -20 DNA PCR MicroSeq Full Gene 16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit <PCR > Pre-denature 95 10min Denature (Melt) 95 30sec Annealing 60 30sec 30 or 32 cycles Extension 72 45sec Post-extension 72 10min Final 4 PCR products -20 PCR products PCR products 10l2% agarose100v 20~30min band 460~560bp 700~800bp ( sample band )PCR products QIAquick PCR Purification Kit Cycle Sequencing Reactions MicroSeq Full Gene 16SrDNA Bacterial Identification Sequencing Kit 13
14 <Sequencing PCR > Preheating 96 1~2min Melt 96 30sec Annealing 50 30sec 25 cycles Extension 60 45sec Final 4 products -4overnight -20 Sequencing Products 70l 75% ethanolvortexing 2,500g(1,800rpm) 5min speed vac 70 12minspin-downElectrophoresis tube 10l Hi-Di Formamide (HD)Transfer sequencing 96 well plate sequencing 2hr sequencing files MicroSeq. Real time PCR 1LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I PCR DNA Master SYBR Green I 2l MgCl2 2.4l ddh2o 0.6lPrimer (S,A) (100 pm /l ) 5 Template 5l Total 20l YpF1SATG AAA AAA ATC AGT TCC GTT YpF1ATTG GTT AGA TAC GGT TAC GGT 14
15 PCR predenature95 cycling denature 94 annealing 54 35~60cycle exension 72 Postextension72 2Roche LightCycler-Yersinia pestis Detection Kit For use with the Roche FastStart reagents run and initial heating for 10 min at 95. Composition of the Patameter Value Patameter Value reaction mix Water 6.6l Cycles 55 Cycles 1 MgCl 2 2.4l Analysis Mode Quantification Analysis Mode Melting Curve Reagent mix 4.0l Segment Segment HybFastStart 2.0l Sample 5.0l Target Temp Target Temp Final volume 20l Incubation Timesec Incubation Timesec Final MgCl 2 Transition Rate /s Transition Rate /s concentration: MgC 4.0mM Acquisition Mode none single none Acquisition Mode none none cont Finally the Rotor should be cooled to 40for 30 s. 15
16 F1 2.5%NaCl Toluene F1 ultrafiltration membrane 10Kd 30% Seperdex-200 Hiload preparative gel filtration column F1 17Kd fig.1 Baker F %25% 30%25% F1 逹 OD ELISA fig.2 PHA 14 F1 42 F1 OD BALB/c ICR (Yersinia pestis Yreka, PMBP-0019) 16
17 F1 Freund Adjuvant incomplete Freund Adjuvant fig.3 F1 12SDS PAGE Western blots YP 25 F1 fig.4 Western blots band 17Kda band NS-1 NS-1 BALB/c ELISA 40 10g/100ul1g/100ul 0.1g/100ul coating 0.1g/100lCut point value average= 黄 370 Table 1 ELISA F1 ELISA ELISA 17
18 coating well 穏 穏 P0.05 PHA F1 ELISA reader F1 34 well ELISA 1A1 1B6 F1 OD 3.0 subcloning IgG HRP conjugate F1 IgG 13,19 ATCC F1-3G8-11gA IgA 没 protein A column F1 Ig F1 ATCC F1-3G8-11gA Y. pestisy. pseudotuberculois 18
19 200 fig.5 IgGAM 16SrDNA Sequencing MicroSeq Libraries16S Bacteria Library Applied Biosystems Y. pestis 100 Y. pseudotuberculosis 99.7 bp NCBI 1461bp rdna Y. pestis, Y. pseudoculosis rrna 1-2bp 16S rdna Real time PCR LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I F1 Tm fig.6 real time PCR 19
20 1516 Y. pestis F1 LcrV probe real time PCR Roche LightCycler-Yersinia pestis Detection Kit Y. pseudotuberculosis 16S rrna pmt1 pcd1 304bp 16S rrna LightCycler Red 640 probes 16S rrna melting curve(tm) primer pmt1 caf1 240bp LC640 probe Tm primer pcd1 LcrV 287bp hybridization probes-lc640 Tm
21 Real time PCR 16S rdna probe 21
22 1. Plague manualepidemiology, Distribution, Surveillance and Control W.H.O : Shiguo Zhou. et al A whole-genome shotgun optical map of yersinia pestis strain KIM. Applied and Environmental Microbiology, 68: Abigail A. Salyers and Dixie D. Whitt. Second edition Bacterial Pathogenesis, A Molecular Approach 5. Patrick R. Murray et al. 1999, Manual of Clinical Microbiology 7 th edition, ASM press. 6. Tsukano, Hiroko, K.I. Itoh, S. Suzuki and H. Watanable. Detection and identification of Yersinia pestis by polymerase chain reaction (PCR) using multiplex primers. Microbiol. Lmmunol : Chen, T.H., and K.F. Meyer An evaluation of Pasteurella pestis fraction-1-specific antibody for conformation of plague infections. Bull.W.H.O. 34: Friedlander, AM., S.L. Welkos., P.L. Worsham., G.P. Andrews, D.G. Heath., G.W. Anderson, and K. Davis Relationship between virulence and immunity as related in recent studies of the F1 capsule of Yersinia pestis. Clin. Infect. Dis. 2(suppl.): Anderson, G.W., E.D. Williamson., R.W. Titball., S.L. Welkos., P.L. Worsham., and A.M. Friedlander Recombinant V antigen protects mice against pneumonic and bubonic plague caused by F1-capsule-positive and negative strains of Yersini spestis. Infect. Immun. 64: Holmstrom. A., J. Olsson, P. Cherepanov, E. Maier, R. Nordefelth, J. Pettersson, R. BenZ., H. Wolf-WatZ., A.A. Forsberg LcrV is a channel size-determining component of the Yop effector translocation of Yersinia. Mol. Microbiol. 39(3); Gerard P. Andrews, David G. Heath, George W. Anderson, JP., Susan L. Welkos, and Arthur M. Friedlander Fraction 1 capsular 22
23 antigen (F1) purfication from Yersinia pestis CO92 and from an Escherichia coli recombinant strain and efficacy aginst lethal plague challenge. Infection and Immunity, Vol. 64. No Sosuke Suzuki, Yoshio Chikasato, and Susumu hotta Studies on antiplague haemagglutinating antibodies. Bull. W.H.O V. A. Feodorova and Z.L. Devdariani Development, characterization and diagnostic application of monoclonal antibodies against Yersinia pestis fibrinolysin and coagulase. J. Med. Microbiol. 49: Fred Ausubel. et al Short protocols in molecular biology, third edition. Published by John Wiley& Sons, Inc. 15. Elizabeth A. Mothershed, et al Development of a Real- time Fluorescence PCR Assay for Rapid Detection of the Diphtheria Toxin Gene. J. Clin. Microbiol. 40: Marco R. Oggioni, Francesca Meacci, Alessandra Carattoli, Alessandra Ciervo, Germano Orru, Antonio Cassone, and Gianni Pozzi Protocol for Real-time PCR identification of Anthrax Spores from Nasal Swabs after Broth Enrichment. J. Clin. Microbiol. 40:
24 M (1) (2) (3) (4) (5) M 21.5 kd 14.4 kd Fig1. F1 SDS Page (1) F1 (2) ~ (5) Fig 2. BALB/c 8 F1 24
25 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 17 kd Fig 3. F1 Western blots (1) F1 Ab (2)Y. pestis YP 25(blood) (3)YP25(Ascites) (4)YP37(blood) (5)YP(A/A)37(blood) (6)YP37(Ascites) (7) F1 hybridoma cell supernatant (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 17 kd Fig 4.. F1 Western blots (1) F1 Ab (2) YP25(blood) (3)YP25(Ascites) (4)YP37(blood) (5)YP(A/A)37(blood) (6)YP37 (Ascites) (7) F1 hybridoma cell supernatant 25
26 Fig 抺 Fig 6. temple F1 541bp Tm 26
27 黄 27
摘要
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