EBV-EA IgG IFA Test 操作手冊
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- 磋 卓
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1 型 號 : 限 由 醫 師 或 醫 檢 師 使 用 效 能 因 諾 瓦 酒 精 固 定 抗 嗜 中 性 白 血 球 細 胞 質 抗 體 檢 測 系 統 NOVA Lite ANCA (Ethanol) Kit with DAPI 使 用 前 請 務 必 詳 閱 原 廠 之 使 用 說 明 書 並 遵 照 指 示 使 用 體 外 診 斷 用 許 可 證 字 號 : 衛 部 醫 器 輸 字 第 號 本 產 品 利 用 間 接 免 疫 螢 光 分 析 法 (indirect immunofluorescent assay, IFA) 進 行 人 類 血 清 檢 體 內 之 抗 嗜 中 性 白 血 球 細 胞 質 抗 體 (anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA) 之 篩 檢 及 半 定 量 檢 測 ANCA 抗 體 的 存 在 與 否 可 與 其 他 血 清 檢 測 法 及 臨 床 症 狀 一 同 協 助 醫 師 診 斷 各 種 系 統 性 血 管 炎 檢 測 摘 要 及 說 明 抗 嗜 中 性 白 血 球 細 胞 質 抗 體 (anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA) 檢 測 在 診 斷 與 治 療 各 種 自 體 免 疫 造 成 的 血 管 炎, 有 革 命 性 的 突 破 1-4 細 胞 核 周 圍 或 panca (Perinuclear ANCA) 以 及 細 胞 質 或 canca (cytoplasmic ANCA) 的 自 體 抗 體 已 證 實 可 用 來 偵 測 多 種 疾 病, 像 是 肉 芽 腫 併 多 發 性 血 管 炎 ( 先 前 最 為 人 所 知 為 韋 格 氏 肉 芽 腫 (Wegener s granulomatosis)) 17 至 少 有 六 個 已 確 認 為 ANCA 的 抗 原, 但 仍 有 很 多 未 發 現 1,5 這 些 抗 體 大 部 分 似 乎 是 存 在 於 噬 中 性 白 血 球 主 要 顆 粒 中 的 酵 素 旁 這 些 酵 素 包 括 過 氧 化 髓 酶 (myeloperoxidase, MPO) 絲 胺 酸 蛋 白 酶 3(serine protease 3, PR3) 彈 性 蛋 白 酶 (elastase) 乳 鐵 蛋 白 (lactoferrin) 組 織 蛋 白 酶 G(cathepsin G) 陽 離 子 蛋 白 57(CAP-57) ELISA 測 試 已 經 發 展 出 許 多 可 偵 測 重 要 的 噬 中 性 白 血 球 抗 體 的 偵 測 法, 然 而, 大 部 分 自 體 免 疫 血 管 炎 領 域 的 專 家 仍 然 建 議 用 IFA 做 初 次 篩 檢 使 用 標 準 的 ANCA IFA 程 序 做 檢 測 可 偵 測 到 兩 種 型 態 典 型 的 ANCA 會 出 現 的 螢 光 是 顆 粒 狀 的, 位 於 細 胞 質 這 種 型 可 能 是 韋 格 氏 肉 芽 腫 以 及 顯 微 鏡 下 較 小 範 圍 的 多 動 脈 炎, 此 型 稱 為 canca 6 第 二 種 型 的 ANCA 7,8, 會 在 經 酒 精 固 定 的 嗜 中 性 白 血 球 的 細 胞 核 周 圍 有 染 色, 此 型 稱 為 panca panca 與 限 於 器 官 的 血 管 炎 有 關, 特 別 是 新 月 體 或 是 急 進 性 絲 球 腎 炎 9 canca 和 韋 格 氏 肉 芽 腫 有 很 大 的 關 係 3,10, 肉 芽 腫 形 成 以 及 血 管 炎 伴 隨 壞 死 發 炎 的 過 是 韋 格 氏 肉 芽 腫 的 特 徵, 通 常 最 先 發 生 於 上 或 下 呼 吸 道 以 及 腎 臟 這 些 臨 床 上 的 相 關 症 狀 正 是 韋 格 氏 肉 芽 腫 的 特 徵 canca 存 在 於 高 達 96% 廣 義 的 韋 格 氏 肉 芽 腫 的 病 人 當 中, 但 是 減 少 至 65% 於 狹 義 的 韋 格 氏 肉 芽 腫 的 病 人 身 上, 並 只 存 在 於 30-40% 病 狀 輕 微 的 病 人 當 中 canca 的 滴 定 量 會 隨 著 既 定 的 療 程 改 變, 症 狀 減 輕 則 滴 定 量 下 降, 而 病 症 復 發 時 滴 定 量 也 隨 之 增 加 4,12 不 像 canca 以 及 其 相 關 的 顯 著 系 統 性 疾 病 韋 格 氏 肉 芽 腫,pANCA 經 常 伴 隨 著 壞 死 的 腎 絲 球 腎 炎 panca 通 常 不 在 系 統 性 併 發 症 當 中 發 現 panca 最 常 見 的 相 關 抗 原 是 過 氧 化 髓 酶, 但 也 會 偵 測 到 彈 性 蛋 白 酶 及 乳 鐵 蛋 白 的 活 性 幾 乎 90% 有 腎 絲 球 腎 炎 的 panca 陽 性 病 人 的 血 清 測 得 過 氧 化 髓 酶 的 活 性 ; 但 是 沒 有 腎 絲 球 腎 炎 的 病 患 也 有 panca, 只 是 所 測 得 的 過 氧 化 髓 酶 活 性 的 百 分 比 遠 低 於 有 腎 絲 球 腎 炎 的 病 人 11,13 這 可 能 表 示, 含 有 抗 核 抗 體 的 血 清, 可 以 以 酒 精 固 定 噬 中 性 白 血 球 做 細 胞 核 周 圍 染 色 偵 測 的 到 多 種 抗 原 藉 由 對 福 馬 林 固 定 的 嗜 中 性 白 血 球 做 IFA, 有 可 能 可 以 確 定 以 酒 精 固 定 的 嗜 中 性 白 血 球 的 細 胞 核 周 圍 的 型 為 panca pnaca 主 要 的 目 標 抗 原 過 氧 化 髓 酶 會 留 在 以 福 馬 林 固 定 的 細 胞 細 胞 質 中, 但 是 在 酒 精 固 定 的 細 胞, 該 抗 原 會 游 移 至 細 胞 核, 導 致 產 生 細 胞 核 周 圍 的 型 碩 景 股 份 有 限 公 司 台 北 Tel: FAX: 台 北 市 信 義 區 松 德 路 74 號 8 樓 #
2 步 驟 原 理 在 非 直 接 免 疫 螢 光 技 術 中, 檢 體 和 抗 體 受 質 一 起 培 養, 而 未 產 生 反 應 的 抗 體 會 被 洗 掉 受 質 和 具 專 一 性 螢 光 標 定 的 共 軛 物 一 起 培 養, 而 未 鍵 结 的 試 劑 會 被 洗 去 以 螢 光 顯 微 鏡 觀 察 時, 自 體 抗 體 陽 性 的 檢 體 會 顯 現 蘋 果 綠 螢 光, 相 當 於 自 體 抗 體 會 鍵 結 的 細 胞 或 是 細 胞 核 區 域 試 劑 警 告 1. ANCA 玻 片, 酒 精 固 定 的 人 類 嗜 中 性 白 血 球 受 質 玻 片,12 孔 / 片, 含 乾 燥 劑 2. 經 FITC 螢 光 標 定 的 人 類 免 疫 球 蛋 白 G 共 軛 物, 含 DAPI 染 劑 以 及 0.09% 三 氮 化 鈉 3. canca 陽 性 對 照 組,1 瓶, 含 有 0.09% 三 氮 化 鈉 及 對 應 canca 抗 原 的 人 類 血 清 抗 體 緩 衝 液, 已 稀 釋 4. panca 陽 性 對 照 組,1 瓶, 含 有 0.09% 三 氮 化 鈉 及 對 應 panca 抗 原 的 人 類 血 清 抗 體 緩 衝 液, 已 稀 釋 5. IFA 系 統 陰 性 對 照 組,1 瓶, 含 有 0.09% 三 氮 化 鈉 且 不 含 對 應 ANCA 抗 原 的 人 類 血 清 抗 體 緩 衝 液, 已 稀 釋 6. PBSII 濃 縮 緩 衝 液 (40x) 7. 封 片 膠, 含 有 0.09% 三 氮 化 鈉 8. 蓋 玻 片 1) 本 檢 驗 試 劑 對 照 組 中 所 有 來 自 人 類 成 份 之 製 備, 已 經 過 由 美 國 食 物 藥 品 檢 驗 局 (USA FDA) 認 可 之 HIV, HBsAg, 及 HCV 檢 驗 試 劑 測 試, 均 為 陰 性 反 應 雖 然 如 此, 目 前 仍 無 任 何 測 試 方 法 可 以 保 證 完 全 排 除 HIV, HBV, HCV 或 其 他 感 染 性 物 質 等 存 在 因 此 panca 陽 性 對 照 組 canca 陽 性 對 照 組 IFA 系 統 陰 性 對 照 組 應 該 被 視 為 具 有 潛 在 感 染 力 物 質 2) 三 氮 化 鈉 (NaN3) 為 保 存 劑 之 用, 但 誤 食 三 氮 化 鈉 或 透 過 皮 膚 / 眼 睛 吸 收 則 會 導 致 中 毒 三 氮 化 鈉 會 與 鉛 及 銅 作 用 而 形 成 具 有 爆 炸 性 的 氮 金 屬 化 合 物 因 此 在 傾 倒 液 體 時, 請 使 用 大 量 清 水 來 預 防 氮 化 物 形 成 3) 檢 驗 過 程 中, 請 使 用 適 當 之 個 人 防 護 措 施 4) 任 何 潑 出 的 物 質 應 該 馬 上 清 除, 並 依 照 當 地 環 保 組 織 之 程 序 處 理 廢 棄 物 注 意 事 項 1) 本 產 品 僅 限 體 外 診 斷 使 用 2) 若 以 任 何 其 他 物 質 替 換 本 試 劑 組 內 的 試 劑 可 能 會 導 致 錯 誤 的 結 果 3) 不 正 確 或 不 完 整 之 清 洗 步 驟 以 及 不 足 的 清 洗 液, 將 會 造 成 背 景 值 過 高 4) 部 分 或 完 全 使 用 檢 體 自 動 處 理 器, 和 其 他 液 體 處 理 儀 器 來 做 本 檢 測 法 的 試 驗, 可 能 會 產 生 與 完 全 照 手 冊 程 序 得 到 的 結 果 不 同 請 實 驗 室 自 行 負 責 確 認 自 動 處 理 程 序 產 生 出 來 的 檢 測 結 果, 在 可 接 受 的 範 圍 內 5) 很 多 因 素 會 影 響 試 劑 組 之 表 現, 包 括 : 試 劑 的 初 溫 顯 微 鏡 燈 泡 使 用 長 度 移 液 管 之 正 確 性 碩 景 股 份 有 限 公 司 台 北 Tel: FAX: 台 北 市 信 義 區 松 德 路 74 號 8 樓 #
3 及 再 現 性 完 全 清 洗 的 時 間 以 及 反 應 時 間 的 長 度 請 注 意 操 作 步 驟 的 一 致 性, 如 此 才 能 得 到 正 確 且 具 再 現 性 之 結 果 6) 抗 人 類 免 疫 球 蛋 白 G 共 軛 物 能 會 因 為 暴 露 於 光 照 下 隨 著 時 間 變 色, 但 是 顏 色 的 改 變 不 會 影 響 試 劑 的 表 現 7) 建 議 完 全 依 照 操 作 手 冊 進 行 保 存 條 件 1. 將 整 個 試 劑 組 保 存 於 2-8 C 請 勿 冷 凍 試 劑 按 照 指 示 保 存 及 處 理 就 可 以 在 保 存 期 限 到 期 前 維 持 穩 定 不 變 質 2. 一 旦 玻 片 從 鋁 箔 袋 中 拿 出, 應 立 即 使 用 3. 已 稀 釋 之 PBS 緩 衝 液 可 在 2-8 C 下 保 存 4 星 期 4. 此 試 劑 共 軛 物 應 該 盡 可 能 避 免 陽 光, 螢 光 或 是 紫 外 線 檢 體 之 製 備 使 用 血 清 檢 體 進 行 本 試 驗 加 入 氮 化 物 或 是 其 他 保 存 劑 到 檢 體 中 可 能 會 對 結 果 有 不 利 的 影 響 請 勿 使 用 已 受 到 微 生 物 感 染 熱 處 理 過 遭 嚴 重 污 染 或 是 可 見 沈 澱 物 之 檢 體 避 免 使 用 已 溶 血 脂 血 的 檢 體 收 集 檢 體 後, 血 清 應 從 凝 塊 中 分 離 出 來 臨 床 實 驗 室 標 準 國 家 委 員 會 (NCCLS) 文 獻 H18-A 建 議 用 下 列 保 存 方 法 保 存 檢 體 :1) 檢 體 不 要 在 室 溫 下 超 過 八 小 時 2) 若 無 法 在 8 小 時 內 完 成 檢 驗, 則 請 冷 藏 保 存 (2-8 C) 檢 體 3) 若 無 法 在 48 小 時 內 完 成 檢 驗 或 完 成 檢 體 的 運 送, 則 請 冷 凍 保 存 (-20 C 或 是 更 低 的 溫 度 ) 檢 體 解 凍 之 檢 體 須 經 充 分 混 合 後, 才 可 進 行 檢 驗 步 驟 提 供 的 材 料 有 : 孔 酒 精 固 定 之 鍍 有 人 類 嗜 中 性 球 受 質 玻 片 1 15mL 抗 人 類 免 疫 球 蛋 白 G, 標 有 FITC 和 DAPI ml canca 陽 性 對 照 組 ml panca 陽 性 對 照 組 1 0.5mL IFA 系 統 陰 性 對 照 組 1 25mL PBS 緩 衝 液 濃 縮 (40x) 1 7mL 封 片 膠 1 20 片 蓋 玻 片 1 試 劑 說 明 書 需 要 但 未 提 供 的 實 驗 材 料 1. 去 離 子 水 2. 1 公 升 的 容 器 ( 用 來 稀 釋 PBS) 碩 景 股 份 有 限 公 司 台 北 Tel: FAX: 台 北 市 信 義 區 松 德 路 74 號 8 樓 #
4 3. 微 量 移 液 管 以 及 拋 棄 式 的 微 量 管 4. 溼 度 箱 5. 擠 壓 式 洗 瓶 6. 染 色 壺 (Coplin jar) 7. 螢 光 顯 微 鏡 方 法 操 作 前 : 1. 將 所 有 檢 體 及 檢 驗 試 劑 組 取 出, 使 之 回 溫 (20-26 C), 並 混 合 均 勻 2. 稀 釋 PBS 清 洗 濃 縮 液 : 注 意 : 將 所 有 的 PBS 緩 衝 濃 縮 液 以 1:40 稀 釋, 全 數 倒 入 975 ml 蒸 餾 水 或 去 離 子 水, 並 完 全 混 合 均 勻 PBS 緩 衝 液 是 用 來 稀 釋 病 人 的 檢 體, 並 當 做 清 洗 液 已 稀 釋 之 清 洗 液 在 2-8 C 下 可 保 存 4 星 期 3. 稀 釋 病 人 檢 體 : 檢 驗 步 驟 a. 初 次 篩 檢 : 以 PBS 緩 衝 液 以 1:20 的 稀 釋 倍 數 稀 釋 ( 也 就 是 加 50µL 的 血 清 到 950µL 的 PBS 緩 衝 液 中 ) b. 滴 定 : 從 初 次 篩 檢 呈 陽 性 反 應 檢 體 的 稀 釋 液 中, 再 以 PBS 緩 衝 液 做 兩 倍 稀 釋 倍 數 稀 釋 ( 也 就 是 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 等 ) 例 如 : 拿 100µL 的 1:20 已 稀 釋 檢 體, 再 加 入 100 µl 的 PBS II, 產 生 1:40 的 稀 釋 倍 數 重 複 此 步 驟 產 生 其 他 稀 釋 倍 數 1. 準 備 受 質 玻 片 : 從 袋 中 取 出 前 先 將 受 質 玻 片 放 置 室 溫 回 溫 用 鉛 筆 標 明 並 放 在 適 當 的 溼 度 箱 中 ㄧ 個 孔 內 加 入 1 滴 (20-25µL) 未 稀 釋 的 陽 性 控 制 組, 另 一 個 孔 加 入 1 滴 (20-25µL) 未 稀 釋 的 陰 性 控 制 組 加 入 1 滴 (20-25µL) 已 稀 釋 的 病 人 檢 體 至 剩 餘 的 孔 洞 中 2. 玻 片 培 養 : 將 玻 片 置 於 濕 度 箱 中 培 養 30 分 鐘 ±5 分 鐘 ( 將 弄 濕 的 紙 巾 平 放 在 密 閉 的 塑 膠 或 玻 璃 容 器 中, 可 以 保 持 適 當 的 溼 度 ) 在 檢 驗 的 程 序 中, 不 要 讓 受 質 變 乾 3. 清 洗 玻 片 : 在 培 養 之 後, 用 已 稀 釋 的 PBS 緩 衝 液 置 於 塑 膠 擠 壓 洗 瓶 或 移 液 管 中, 輕 輕 的 將 血 清 洗 去 將 玻 片 傾 斜 讓 PBS 緩 衝 液 流 出, 以 便 減 少 孔 洞 間 的 檢 體 互 相 溢 入 而 混 合 避 免 直 接 水 流 直 接 流 入 孔 洞 而 產 生 對 受 質 的 破 壞 將 玻 片 放 到 內 有 PBS 緩 衝 液 的 染 色 壺 中, 放 入 之 後 計 時 5 分 鐘 後 拿 出 4. 加 入 螢 光 共 軛 物 : 將 多 餘 的 PBS 緩 衝 液 甩 掉, 再 將 玻 片 放 回 溼 度 箱 並 馬 上 在 每 個 孔 內 滴 入 螢 光 共 軛 物, 培 養 30 分 鐘 5. 清 洗 玻 片 : 重 複 步 驟 3 6. 蓋 玻 片 : 蓋 玻 片 的 步 驟 每 個 實 驗 室 都 不 同, 以 下 是 建 議 的 方 式 : a. 將 蓋 玻 片 放 在 紙 巾 上 b. 將 封 片 劑 從 蓋 玻 片 底 部 邊 緣 以 連 續 劃 線 的 方 法 塗 滿 c. 甩 乾 過 量 的 的 PBS 緩 衝 液, 載 玻 片 邊 緣 先 接 觸 蓋 玻 片 邊 緣 底 部, 輕 輕 的 將 載 玻 片 放 到 蓋 玻 片 上, 這 樣 的 做 法 可 以 使 封 片 劑 流 到 載 玻 片 上 面 的 邊 緣, 而 且 不 會 有 氣 泡 在 裡 面 形 成 7. 在 顯 微 鏡 下 觀 察 玻 片 : 已 實 驗 結 束 的 玻 片 應 該 儲 存 在 2-8 C, 並 盡 快 地 觀 察 完 畢 碩 景 股 份 有 限 公 司 台 北 Tel: FAX: 台 北 市 信 義 區 松 德 路 74 號 8 樓 #
5 品 質 控 制 每 一 批 樣 本 的 檢 驗 都 應 該 同 時 進 行 陽 性 對 照 組 (canca 陽 性 對 照 組 和 panca 陽 性 對 照 組 ) 和 IFA 系 統 陰 性 對 照 組, 以 確 保 所 有 的 試 劑 和 程 序 都 是 正 確 操 作 亦 可 進 行 更 多 的 對 照 組, 如 數 個 血 清 檢 體 之 混 合 分 裝, 並 將 之 保 存 於 -70 C 或 以 下 檢 驗 結 果 必 須 符 合 下 面 列 出 幾 個 條 件, 才 能 確 認 為 有 效 檢 驗 若 無, 則 該 次 檢 驗 視 為 無 效, 需 要 重 複 檢 驗 1. 未 稀 釋 的 canca 陽 性 對 照 組 必 須 未 稀 釋 的 panca 陽 性 對 照 組 必 須 IFA 系 統 陰 性 控 制 組 必 須 呈 現 陰 性 反 應 結 果 闡 述 陰 性 反 應 : 具 專 一 性 的 細 胞 核 或 細 胞 質 的 染 色, 如 果 等 於 或 少 於 IFA 系 統 陰 性 控 制 組, 則 應 該 視 該 檢 體 為 陰 性 檢 體 可 能 會 因 為 具 異 染 性 抗 體, 或 細 胞 質 組 成 的 自 體 抗 體 量 ( 例 如 收 縮 蛋 白 ) 很 低, 而 顯 示 不 同 程 度 背 景 值 陽 性 控 制 組 : 如 果 專 一 的 細 胞 核 或 / 和 細 胞 質 的 染 色 如 底 下 所 描 述, 觀 察 到 的 染 色 比 陰 性 控 制 組 更 強, 而 染 色 強 度 是 1 或 大 於 1, 則 該 檢 體 視 為 陽 性 決 定 螢 光 等 級 或 強 度 可 以 用 這 些 準 則 : 4+ 強 烈 明 亮 的 蘋 果 綠 螢 光 3+ 明 亮 的 蘋 果 綠 螢 光 2+ 清 楚 可 辨 的 陽 性 螢 光 1+ 最 低 的 專 一 性 螢 光, 可 以 使 細 胞 核 或 / 和 細 胞 質 的 染 色 清 楚 的 由 背 景 螢 光 值 分 辨 出 來 型 態 說 明 : 細 胞 核 和 細 胞 質 染 色 表 現 各 種 形 態 模 式, 與 檢 體 內 自 體 抗 體 的 種 類 與 相 對 數 量 有 關 可 能 觀 察 到 的 有 以 下 幾 種 模 式 : canca 或 稱 細 胞 質 染 色 : 這 種 模 式 通 常 呈 現 看 起 來 粗 糙 有 斑 點 的 細 胞 質 螢 光, 常 常 伴 隨 著 在 核 周 圍 有 強 烈 的 螢 光 這 種 模 式 通 常 都 發 生 在 會 與 主 要 顆 粒 酵 素 絲 胺 酸 蛋 白 酶 3 產 生 反 應 的 自 體 抗 體 panca 或 稱 細 胞 核 周 圍 的 染 色 : 這 個 模 式 通 常 會 在 核 的 部 份 出 現 均 質 的 染 色, 伴 隨 著 在 核 的 周 圍 會 有 強 螢 光 的 出 現, 由 抗 過 氧 化 酶 抗 體 產 生 因 為 有 一 些 抗 核 抗 體 (antinuclear antibodies, ANA) 也 會 與 酒 精 固 定 的 人 類 嗜 中 性 白 血 球 產 生 反 應, 因 此 建 議 這 類 型 的 檢 體 也 需 做 ANA 的 檢 測 除 此, 這 些 檢 體 可 在 福 馬 林 固 定 而 非 酒 精 固 定 的 人 類 嗜 中 性 白 血 球 中 檢 測 福 馬 林 固 定 是 交 叉 結 合 的 固 定, 會 破 壞 大 部 份 的 核 抗 原, 假 設 檢 體 含 抗 過 氧 化 酶 抗 體 會 從 和 周 邊 染 色 型 態 變 成 細 胞 質 型 態 福 馬 林 固 定 的 受 直 玻 片 可 用 來 區 分 步 驟 限 制 1. 經 熱 去 活 化 溶 血 微 生 物 污 染 或 不 完 全 去 纖 維 蛋 白 的 檢 體, 都 可 能 導 致 染 色 的 高 背 景 值, 而 使 得 辦 別 不 易 必 須 再 取 得 新 鮮 的 樣 本 並 重 新 檢 驗 加 入 2% 的 白 蛋 白 或 小 牛 血 清 到 用 於 稀 釋 檢 體 的 PBS 緩 衝 液 中, 可 以 減 少 有 問 題 的 檢 體 染 色 背 景 值 2. ANA 陽 性 的 檢 體 可 能 與 酒 精 固 定 的 嗜 中 性 白 血 球 產 生 反 應 細 胞 核 周 圍 模 式 呈 陽 性 的 檢 體 應 該 也 做 ANA 和 / 或 福 馬 林 固 定 的 嗜 中 性 白 血 球 玻 片 的 檢 測 碩 景 股 份 有 限 公 司 台 北 Tel: FAX: 台 北 市 信 義 區 松 德 路 74 號 8 樓 #
6 3. 因 為 酒 精 固 定 的 人 類 嗜 中 性 白 血 球 包 含 多 種 主 要 顆 粒 抗 原 像 是 蛋 白 酶 (elastase) 乳 鐵 蛋 白 (lactoferrin) 組 織 蛋 白 酶 G(cathepsin G) 陽 離 子 蛋 白 57(CAP-57) 以 及 其 他 未 發 現 的 嗜 中 性 白 血 球 抗 原, 檢 體 顯 示 p 或 canca 陽 性 並 非 全 然 都 是 過 氧 化 髓 酶 抗 體 (myeloperoxidase, MPO) 或 絲 胺 酸 蛋 白 酶 3 抗 體 (serine protease 3, PR3) 陽 性 4. 除 了 ANA 之 外, 某 些 自 體 抗 體 也 會 和 酒 精 固 定 的 人 類 嗜 中 性 白 血 球 產 生 反 應 這 些 抗 體 包 括 抗 平 滑 肌 ( 肌 動 蛋 白,actin) 以 及 某 些 異 抗 體 (alloantibodies), 像 是 Mart 或 NB1 15 肌 動 蛋 白 或 平 滑 肌 抗 體 會 與 嗜 中 性 白 血 球 細 胞 質 反 應, 但 是 會 顯 示 均 質 的 模 式 而 非 看 起 來 粗 糙 有 斑 點 的 模 式, 也 就 是 會 看 起 來 是 會 是 典 型 的 canca 異 抗 體 也 會 顯 現 像 是 細 胞 質 的 模 式, 但 是 與 canca 比 較 起 來 有 較 細 的 顆 粒 而 且 只 有 少 數 的 細 胞 有 被 螢 光 染 色 ( 通 常 是 40% 或 更 少 ) 5. 檢 體 偶 而 會 出 現 超 過 一 種 自 體 抗 體 例 如,cANCA 以 及 p ANCA 或 ANCA 加 上 ANA 6. IFA 陽 性 的 檢 體 必 須 要 再 利 用 MPO,PR3 的 ELISA 的 方 法 再 做 確 認 7. 有 些 病 人 有 發 炎 性 的 腸 疾 或 潰 瘍 性 的 結 腸, 這 些 病 人 的 嗜 中 性 白 血 球 會 與 抗 體 反 應 這 些 檢 體 在 酒 精 固 定 的 嗜 中 性 白 血 球 看 起 來 會 像 是 panca 的 模 式, 而 且 有 非 常 強 烈 的 細 胞 核 周 圍 的 染 色 通 常 這 些 檢 體 在 福 馬 林 固 定 的 嗜 中 性 白 血 球 玻 片 會 顯 現 陰 性 反 應 或 有 弱 陽 性 的 均 質 細 胞 質 的 螢 光, 8. 在 染 色 程 序 中, 玻 片 處 理 過 程 錯 誤, 特 別 是 在 步 驟 間 讓 玻 片 乾 掉, 可 能 會 造 成 毀 壞 的 模 式 現 象, 也 會 有 很 高 的 染 色 背 景 值 9. 使 用 其 他 種 染 色 抗 體 試 劑 組 的 試 劑 ( 特 別 是 共 軛 物 ), 可 能 對 酒 精 固 定 的 嗜 中 性 白 血 球 受 質 玻 片 的 敏 感 度 以 及 專 一 性 有 不 利 的 影 響 10. 各 種 會 影 響 檢 測 敏 感 度 的 外 部 因 子, 包 括 所 使 用 的 螢 光 顯 微 鏡 種 類 燈 泡 強 度 及 年 齡 使 用 的 放 大 倍 率 濾 光 系 統 及 觀 察 員 等, 都 會 影 響 檢 測 11. 光 源, 濾 鏡 或 是 螢 光 寫 微 鏡 的 光 學 鏡 頭 都 會 影 響 到 此 試 劑 的 敏 感 度 正 確 的 保 養 會 影 響 到 顯 微 鏡 的 表 現 尤 其 是 某 些 汞 燈 以 及 一 段 時 間 後 更 換 汞 燈 12. 玻 片 只 能 用 鉛 筆 標 示 使 用 其 它 種 類 的 筆 可 能 造 成 人 為 染 色 13. 所 有 用 來 清 洗 玻 片 的 coplin jars 應 該 不 能 有 任 何 其 他 物 質 殘 留 使 用 還 含 有 染 劑 殘 留 的 coplin jars 可 能 導 致 假 的 染 色 14. 本 檢 驗 試 劑 分 析 的 結 果 應 該 與 臨 床 的 觀 察 以 及 其 他 的 血 清 測 試 結 果 一 起 做 診 斷 15. 本 測 試 沒 有 建 立 除 了 血 清 以 外 的 公 制 單 位 期 望 值 115 個 隨 機 抽 取 的 正 常 檢 體 用 酒 精 固 定 的 NOVA Lite ANCA 玻 片 做 檢 測 這 些 被 抽 取 檢 體 的 人 都 先 做 身 體 健 康 檢 查, 且 這 些 個 體 本 身 並 非 老 年 人 或 兒 童 這 些 檢 體 經 男 女 隨 機 混 合, 所 有 115 個 檢 體 在 1:20 的 稀 釋 下 都 呈 現 陰 性 反 應 另 外 也 做 了 45 個 韋 格 氏 症 候 群 39 個 多 發 性 血 管 炎 20 個 新 月 型 腎 絲 球 腎 炎 的 病 患, 以 及 有 各 種 結 締 組 織 疾 病 的 病 患 結 果 總 結 於 下 表 : 病 人 族 群 病 人 數 目 % 陽 性 反 應 隨 機 抽 正 常 人 檢 體 韋 格 氏 症 候 群 ( 全 都 是 canca) 多 發 性 血 管 炎 ( 全 都 是 panca) 碩 景 股 份 有 限 公 司 台 北 Tel: FAX: 台 北 市 信 義 區 松 德 路 74 號 8 樓 #
7 新 月 型 腎 絲 球 腎 炎 ( 全 都 是 panca) 紅 斑 性 狼 瘡 27 7 (canca 和 panca 都 有 ) 修 格 蘭 氏 症 候 群 21 0 硬 皮 病 15 0 多 發 性 肌 炎 6 0 NOVA Lite ANCA 玻 片 與 大 學 研 究 ANCA 委 託 中 心 通 常 使 用 的 經 細 胞 離 心 的 嗜 中 性 白 血 球 製 備 一 起 比 較 55 個 陽 性 血 清 (23 canca,28 panca,4 個 非 典 型 的 ), 以 及 14 個 ANCA 呈 陰 性 的 檢 體 作 測 試 55 個 陽 性 檢 體 中,54 個 在 NOVA Lite ANCA 玻 片 檢 測 出 現 完 全 一 樣 的 染 色 模 式, 剩 下 一 個 低 滴 定 量 的 canca 檢 體 在 INOVA 的 玻 片 上 產 生 陰 性 反 應 14 個 呈 ANCA 陰 性 的 檢 體 在 NOVA Lite TM ANCA 的 玻 片 上 產 生 一 樣 的 陰 性 結 果 55 個 陽 性 檢 體 的 滴 定 量 在 兩 種 受 質 上 都 產 生 一 樣 的 結 果, 或 者 可 以 說 53 個 檢 體 的 檢 測 只 有 一 個 加 倍 稀 釋 的 不 同, 另 外 兩 個 則 有 兩 個 加 倍 稀 釋 的 不 同 48 個 隨 機 血 清 檢 體 都 有 受 到 美 國 主 要 委 託 做 ANCA 檢 驗 的 實 驗 室, 同 時 用 NOVA Lite TM ANCA 玻 片 做 ANCA 的 檢 測 以 及 測 試 專 一 於 MPO 和 PR-3 抗 體 的 INOVA QUANTA Lite TM ELISA 試 劑 組 結 果 總 結 於 下 表 : IFA 結 果 樣 本 數 %ELISA 陽 性 MPO 陰 性 PR-3 panca canca panca 和 canca 非 典 型 的 用 免 疫 螢 光 分 析 法 有 8 個 檢 體 呈 ANCA 陰 性, 這 8 個 檢 體 以 ELISA 做 MPO 及 PR-3 的 檢 測 都 呈 陰 性,MPO 及 PR-3 的 結 果 範 圍 從 1-5 個 單 位 都 有, 遠 低 於 20 個 單 位 的 陽 性 反 應 臨 界 值 以 IFA 檢 測 的 13 個 檢 體 結 果 為 panca, 這 些 檢 體 有 11 個 是 MPO 陽 性, 而 沒 有 任 何 一 個 是 PR-3 陽 性 免 疫 螢 光 分 析 結 果 有 21 個 檢 體 呈 canca 陽 性, 而 這 些 檢 體 中 沒 有 一 個 呈 MPO 陽 性, 而 21 個 當 中 的 20 個 檢 體 呈 PR-3 陽 性 免 疫 螢 光 分 析 的 結 果 有 5 個 檢 體 是 同 時 呈 現 p 和 canca 兩 種 模 式, 其 中 四 個 呈 MPO 陽 性, 沒 有 PR-3 陽 性 一 個 檢 體 檢 驗 結 果 為 非 典 型 的 panca, 這 個 非 典 型 panca 的 檢 體 對 MPO 及 PR-3 試 劑 組 測 試 都 呈 陰 性 ANCA 以 ELISA 與 IFA 檢 測 結 果 的 一 致 性 有 幾 種 其 他 嗜 中 性 白 血 球 的 主 要 顆 粒 酵 素 的 抗 體, 在 免 疫 螢 光 分 析 酒 精 固 定 的 嗜 中 性 白 血 球 的 檢 測 下, 也 可 能 產 生 c 和 panca 的 染 色 模 式 特 別 是 在 panca 抗 體 的 案 例 中 特 別 明 顯, 除 了 MPO 外, 還 有 至 少 3 種 對 應 該 抗 原 的 抗 體 會 產 生 panca 型 IFA 模 式 為 了 說 明 這 點, 上 述 提 到 的 韋 格 氏 症 候 群 多 發 性 血 管 炎 新 月 型 腎 絲 球 腎 炎 的 族 群 以 及 48 個 檢 體, 都 受 到 例 行 的 血 清 檢 測 以 將 該 樣 本 分 類 酒 精 固 定 的 人 類 嗜 中 性 白 血 球 免 疫 螢 光 分 析 以 及 ELISA 的 結 果 如 下 : canca IFA QUANTA Lite PR-3 IgG + - 相 對 敏 感 度 90.9 % 相 對 專 一 性 98.8 % 一 致 性 95.4 % 碩 景 股 份 有 限 公 司 台 北 Tel: FAX: 台 北 市 信 義 區 松 德 路 74 號 8 樓 #
8 panca IFA QUANTA Lite MPO IgG + - 相 對 敏 感 度 61.0 % 相 對 專 一 性 100 % 一 致 性 80.3 % canca IFA 檢 測 呈 陽 性 的 66 個 樣 本 中,6 個 呈 PR3 陰 性, 而 其 中 1 個 在 ELISA 呈 陽 性 而 在 IFA 呈 陰 性 77 個 panca IFA 呈 陽 性 的 檢 體, 其 中 有 30 個 以 專 一 的 MPO ELISA 檢 測 呈 陰 性 沒 有 panca IFA 呈 陰 性 的 檢 體, 發 現 以 MPO ELISA 測 試 呈 陽 性 反 應 參 考 文 獻 1. Goeken JA, Antineutrophil cytoplasmic antibody - a useful serological marker for vasculitis. J Clin Immunol 11: , Specks U, et. al., Anticytoplasmic autoantibodies in the diagnosis and follow-up of Wegener s granulomatosis. May Clin Proc 64:28-36, van der Woude FJ, et. al., Autoantibodies against neutrophils and monocytes: tools for diagnosis and marker of disease activity in Wegener s granulomatosis. Lancet , Cohen-Tervaert JW, et. al., Association between active Wegener s granulomatosis and anticytoplasmic antibodies. Arch Intern Med 149: , Cambridge, et. al., Antineutrophil antibodies in inflammatory bowel disease: prevalence and diagnostic role. Gut 33: , Nolle B, et. al., Anticytoplasmic autoantibodies: their immunodiagnostic value in Wegener s granulomatosis. Ann Int Med 111:28-40, Charles LA, Falk RJ, Jennette JC, Clin Immunol Immunopathol 53: , Falk RJ, Jennette JC, Anti neutrophil cytoplasmic autoantibodies with specificity for myeloperoxidase in patients with systemic vasculitis and idiopathic necrotizing and crescentic glomerulonephritis. N Engl J Med 318: , Jennette JC, Wilkman AS, Falk RJ, Am J Path 135: , Gross WL, Ludemann G, et. al., Lancet 1:806, Cohen-Tervaert JW, et. al., Association of autoantibodies to myeloperoxidase with different forms of vasculitis. Arth and Rheum 33(8): , Cohen-Tervaert JW, et. al., Autoantibodies against myeloid lysosomal enzymes in crescentic glomerulonephritis. Kidney Int 37: , Cohen-Tervaert JW, et. al., Detection of autoantibodies against myeloid lysosomal enzymes: a useful adjunct to classification of patients with biopsy proven necrotizing arteritis. Am J Med 91:59-66, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999 Fourth Edition (HHS Pub. # (CDC) ). 碩 景 股 份 有 限 公 司 台 北 Tel: FAX: 台 北 市 信 義 區 松 德 路 74 號 8 樓 #
9 15. Stroncek DF, et. al., Neutrophil alloantibodies react with cytoplasmic antigens: a possible cause of false-positive indirect immunofluorescence assays for antibodies to neutrophil cytoplasmic antigens. Am J Kidney Dis 21: , Hardarson S, et. al., Antineutrophil cytoplasmic antibody in inflammatory bowel and hepatobiliary diseases. Clinical Microbiology and Immunology 99: No. 3, 製 造 廠 名 稱 :INOVA Diagnostics, Inc. 製 造 廠 地 址 :9900 Old Grove Rd, San Diego, CA USA 藥 商 名 稱 : 碩 景 股 份 有 限 公 司 藥 商 地 址 : 台 北 市 信 義 區 松 德 路 74 號 8 樓 碩 景 股 份 有 限 公 司 台 北 Tel: FAX: 台 北 市 信 義 區 松 德 路 74 號 8 樓 #
QUANTA LiteTM M2 EP(MIT3) 704540
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