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1 黃 花 蜜 菜 中 的 Wedelolactone 對 前 列 腺 癌 及 骨 癌 細 胞 的 生 長 抑 制 之 探 討 指 導 老 師 : 蕭 培 文 教 授 作 者 : 黃 暉 凱 學 號 :9357 學 校 : 台 中 一 中
2 目 錄 一 摘 要..3 二 動 機..3 三 前 言 及 背 景.. 四 研 究 目 的..5 五 設 備 器 材 與 試 劑..5 六 實 驗 過 程 或 方 式..5 七 實 驗 結 果..7 八 討 論 與 結 論.19
3 一 摘 要 本 實 驗 以 Wedelolactone (IKK 激 脢 抑 制 劑 ) 作 為 藥 劑, 加 於 人 類 前 列 腺 癌 細 胞 以 及 骨 癌 細 胞, 以 探 討 Wedelolactone 對 於 這 些 不 同 癌 細 胞 的 影 響 我 們 將 各 種 癌 細 胞 養 在 1 孔 培 養 盤 上, 對 其 加 入 不 同 濃 度 的 Wedelolactone, 觀 察 於 加 藥 後 第 8 天 觀 察 並 做 結 晶 紫 染 色 法, 分 析 細 胞 生 長 的 狀 況 結 果 發 現 各 種 不 同 時 期 的 前 列 腺 癌 細 胞 均 會 受 Wedelolactone 抑 制, 而 骨 癌 細 胞 則 幾 乎 不 受 影 響, 因 此 推 測 此 藥 對 前 列 腺 癌 細 胞 具 有 較 高 生 長 抑 制 性 二 動 機 新 世 紀 的 疾 病 癌 症 在 國 內 外 十 大 死 因 中 居 高 不 下, 而 目 前 的 治 療 方 法 效 果 不 顯 著 且 常 造 成 人 體 其 它 組 織 的 傷 害, 這 是 個 棘 手 問 題, 人 們 往 往 聞 之 色 變 ; 若 是 能 找 到 方 法, 能 有 效 殺 死 癌 細 胞 而 不 對 正 常 細 胞 造 成 傷 害, 將 十 分 有 益 於 癌 症 的 治 療 前 列 腺 癌 是 一 個 日 嚴 重, 影 響 老 年 男 性 的 健 康 問 題 此 病 似 乎 日 益 普 遍, 人 口 老 化 是 主 要 原 因 之 一, 但 高 脂 肪 食 物 和 遺 傳 因 素 似 乎 亦 是 引 致 此 種 癌 症 的 原 因 它 在 歐 西 國 家 的 發 病 率 較 東 方 國 家 為 高, 但 在 亞 洲 也 有 日 益 嚴 重 的 趨 勢 在 美 國, 前 列 腺 癌 的 發 病 率 佔 男 性 惡 性 腫 瘤 的 第 二 位, 而 死 亡 率 佔 第 三 位 在 香 港, 每 十 萬 人 死 於 前 列 腺 癌 者 為 三 人 左 右, 遠 較 美 國 為 低 前 列 腺 癌 的 病 因 目 前 還 不 甚 明 瞭, 可 能 與 性 激 素 有 關, 絕 大 部 分 的 前 列 腺 癌 發 生 在 前 列 腺 後 葉, 多 為 腺 癌 早 期 的 前 列 腺 癌 常 無 症 狀, 常 見 的 排 尿 症 狀 與 前 列 腺 肥 症 相 似, 即 尿 頻 夜 尿 排 尿 困 難 尿 痛 及 尿 瀦 留 等 前 列 腺 癌 可 隨 淋 巴 管 轉 移 往 附 近 之 淋 巴 腺, 亦 可 循 血 循 環 轉 移 往 骨 骼 前 列 腺 癌 有 很 多 生 化 腫 瘤 標 記, 過 去 最 常 用 的 是 血 清 酸 性 磷 酸 酵 素, 但 其 特 異 性 和 敏 感 性 均 不 高 近 來 比 較 常 用 的 是 前 列 腺 特 異 抗 原 (PSA), 這 是 一 種 所 有 前 列 腺 細 胞 均 有 分 泌 的 一 種 蛋 白 質, 當 一 個 男 性 年 紀 漸 長, 前 列 腺 會 發 大, 故 PSA 之 濃 度 亦 會 隨 年 齡 而 增 高 ;PSA 值 如 在 或 以 下, 患 癌 的 可 能 性 極 低 ; 但 如 PSA 值 在 以 上 時, 患 癌 的 可 能 性 便 很 高 了 前 列 腺 癌 大 多 發 展 緩 慢, 隱 匿 性 的 可 長 期 無 明 顯 發 展, 但 在 出 現 症 狀 之 後, 多 數 發 展 較 快, 發 現 時 已 有 遠 處 轉 移 的 患 者, 五 年 生 存 率 只 有 四 分 之 一, 故 應 作 定 期 檢 查 和 及 早 處 理 很 幸 運 地, 我 參 加 了 中 研 院 所 舉 辦 的 高 中 生 物 資 優 生 培 育 計 畫, 並 有 幸 加 入 生 農 所 蕭 培 文 老 師 的 實 驗 室, 因 此 能 對 前 列 腺 癌 有 更 進 一 步 的 了 解 蕭 老 師 的 實 驗 室 已 發 現 IKK ( 蛋 白 質 激 脢 ) 對 於 前 列 腺 癌 細 胞 生 長 的 重 要 性, 而 此 實 驗 室 有 許 多 不 同 的 癌 症 細 胞 以 及 不 同 時 期 的 前 列 腺 癌 症 細 胞 株, 因 此, 我 的 實 驗 便 以 3
4 IKK 的 抑 制 劑 Wedelolactone 作 為 藥 劑, 對 不 同 種 癌 細 胞 以 及 不 同 時 期 癌 細 胞 做 加 藥 處 理, 來 實 驗 其 對 於 前 列 腺 癌 的 抑 制 效 果 三 前 言 及 背 景 ( 一 )Wedelolactone 的 簡 介 : Wedelolactone 是 一 種 Coumestans 結 構 的 化 合 物, 早 在 198 年 就 在 一 些 天 然 物 如 旱 蓮 草 黃 花 蜜 菜 中 分 離 出 來 Wedelolactone 早 期 是 用 來 治 療 蛇 毒 肝 炎 發 炎 反 應, 近 期 又 被 發 現 是 IKK( 蛋 白 質 激 脢 ) 的 抑 制 劑 H 3 CO O O OH OH O Wedelolactone OH ( 二 ) 前 列 腺 癌 細 胞 株 Rv/3-13( 簡 稱 13) 的 簡 介 : CWR 是 一 個 人 類 前 列 腺 癌 細 胞 將 CWR 種 到 老 鼠 裡, 然 後 將 老 鼠 醃 掉, 尚 能 存 活 的 細 胞 取 出 成 為 Rv1 Rv1 算 是 一 個 混 合 體, 內 有 部 分 細 胞 需 要 雄 性 賀 爾 蒙, 部 分 不 需 要 ( 而 下 面 介 紹 的 AI 是 幾 乎 都 不 需 要 雄 性 賀 爾 蒙 來 促 進 其 生 長 ) Rv/3-13 則 是 蕭 老 師 實 驗 室 將 某 些 特 殊 基 因 轉 植 入 Rv1 但 對 此 實 驗 並 無 影 響, 因 此 此 實 驗 就 用 Rv/3-13 來 代 替 Rv1 PS:p8 p78 是 指 細 胞 培 養 的 代 數 p8 模 擬 較 前 期 的 前 列 腺 癌 ;p78 模 擬 較 後 期 的 前 列 腺 癌 ( 三 ) 前 列 腺 癌 細 胞 株 AI- 的 簡 介 : 正 常 的 Rv/3-13 需 要 雄 性 素 來 促 進 生 長 ( 相 對 於 AI 是 需 要 的 ) 而 此 細 胞 是 將 的 medium 中 去 掉 雄 性 素, 而 將 能 夠 存 活 的 少 數 Rv/3-13 以 去 雄 性 素 的 medium 繼 續 培 養, 進 而 挑 選 出 可 在 此 種 medium 中 成 長 的 前 列 腺 癌 細 胞 株 AI- 現 今 治 療 前 列 腺 癌 的 方 法 之 一, 有 用 雌 性 素 來 抑 制 雄 性 素, 以 達 到 扼 殺 前 列 腺 癌 細 胞 的 作 用 AI 系 列 的 前 列 腺 癌 細 胞 不 需 要 雄 性 素 就 能 正 常 生 長, 因 而 用 此 來 模 擬 不 需 雄 性 素, 更 惡 化 的 前 列 腺 癌 細 胞 ( 四 ) 前 列 腺 癌 細 胞 株 AI- 的 簡 介 : 挑 選 方 法 與 AI- 相 同, 但 此 細 胞 株 生 長 速 度 較 AI- 快 速 ( 五 ) 骨 癌 細 胞 株 UOS 的 簡 介 : UOS 細 胞 株 是 在 19 年, 從 一 個 染 上 骨 癌 的 15 歲 女 孩 的 骨 頭 組 織 中 被 培 養 UOS 屬 於 附 著 性 細 胞, 早 期 是 和 WI-38 cells 共 同 培 養 時 UOS 對 insulin-like growth factor I (IGF-I) insulin-like growth factor II (IGF II) 的 接 受 器 有 正 面 的 反 應
5 他 也 表 現 出 許 多 抗 原, 包 括 blood type A, Rh+, HLA A, Aw3, B1, Bw35, and B(+/-). ( 六 ) 結 晶 紫 染 色 & 測 吸 光 子 : 我 們 採 取 結 晶 紫 染 色 (specific lysis assay by crystal violet staining) 分 析 黏 著 性 細 胞 之 細 胞 生 長 情 形 原 理 是 黏 著 性 細 胞 死 亡 後 會 浮 起, 而 留 下 的 細 胞 數 目 多 寡 則 經 由 其 吸 收 的 染 劑 決 定, 因 為 先 將 細 胞 固 定 後, 細 胞 越 多 則 吸 收 的 染 劑 越 多, 經 測 量 染 劑 之 特 殊 吸 光 值 就 可 以 知 道 細 胞 存 活 情 形 四 研 究 目 的 ( 一 ) 探 討 Wedelolactone 對 於 不 同 時 期 及 不 同 惡 程 度 的 前 列 腺 癌 細 胞 抑 制 的 效 果 ( 二 ) 比 較 Wedelolactone 對 於 前 列 腺 癌 細 胞 及 骨 癌 細 胞 的 抑 制 效 果 五 設 備 器 材 與 試 劑 ( 一 ) 器 材 :incubator flask tube 離 心 機 血 球 計 數 器 1-well plate 9-well plate incubator pipette elisa reader ( 二 ) 試 劑 : FBS CD-FBS PBS Trypsin Sodium pyruvate Glutamine glutaldehyde ddho crystal violet % 醋 酸 Wedelolactone ( 三 ) 細 胞 株 :Rv/3-13 AI- AI- UOS 六 實 驗 過 程 或 方 式 ( 一 ) 解 凍 細 胞 1. 從 液 態 氮 取 出 欲 解 凍 之 細 胞. 在 37 水 域, 使 之 成 半 溶 狀 態 3. 在 laminor flow 內 打 開, 取 至 5cc 離 心 管 1 x g 離 心 5 分 鐘. 把 上 清 液 吸 掉, 再 加 入 7cc medium, 打 散 後 放 入 75T flask 內 5. 放 入 37 細 胞 培 養 箱 內 培 養 ( 二 ) 繼 代 培 養 1. 在 空 間 將 滿 ( 約 八 分 滿 ) 的 75T flask 加 入 1 cc trypsin, 切 開 細 胞 對 flask 的 附 著, 使 細 胞 漂 浮. 放 入 37 5% CO ( 模 擬 人 體 環 境 ) incubator 3 分 鐘, 讓 trypsin 作 用 3. 再 加 入 3 cc medium, 將 細 胞 打 散, 取 約 1/3 量 的 細 胞 放 入 新 的 75T flask. 將 新 的 75T flask 補 入 5 cc medium, 即 可 放 入 incubator 培 養 5. 待 細 胞 約 八 分 滿, 再 循 環 至 第 1 點 5
6 ( 三 ) 種 細 胞 1. 將 欲 實 驗 的 細 胞 拿 出 ( 在 flask 內 ), 吸 掉 medium. 加 入 trypsin, 放 入 incubator 3 分 鐘, 使 其 切 開 細 胞 對 flask 的 附 著, 讓 細 胞 漂 浮 3. 吸 岀 細 胞 移 至 tube 內, 打 散 使 其 均 勻 混 合. 用 血 球 計 數 器 算 出 細 胞 濃 度 ( 隻 / ml) 5. 加 入 medium 將 細 胞 濃 度 調 到 1 隻 / ml. 如 圖, 將 細 胞 加 入 1 well plate, 每 well.5 ml ( 即 每 well 1 隻 細 胞 ) ( 圖 為 做 一 種 細 胞 所 需 的 盤 數 ) 7. 放 入 incubator 培 養, 天 後 開 始 treatment ( 四 ) 加 藥 處 理 1. 在 種 細 胞 兩 天 後 ( 即 加 藥 後 第 天 ), 將 染 出, 作 為 之 後 細 胞 生 長 倍 率 的 基 準 值 ( 細 胞 數 目 當 1). 剩 下 的 3 組 ( 如 右 圖, 個 plate 為 一 組 ) 便 依 右 圖 所 示, 加 不 同 濃 度 的 Wedelolactone 並 換 新 medium 3. 加 藥 後 第 天, 取 出 一 組 作 結 晶 紫 染 色 測 其 細 胞 數, 剩 下 的 組 繼 續 依 原 本 藥 的 濃 度 更 換 新 的 medium. 加 藥 後 第 天, 在 取 出 一 組 作 結 晶 紫 染 色 測 其 細 胞 數, 剩 下 的 1 組 繼 續 依 原 本 藥 的 濃 度 更 換 新 的 medium 5. 加 藥 後 第 天, 取 出 最 後 一 組 作 結 晶 紫 染 色 測 其 細 胞 數. 最 後, 從 加 藥 後 第 天 到 第 天, 將 其 畫 成 Growth Curve, 即 可 了 解 細 胞 的 生 長 狀 況 ( 五 ) 利 用 結 晶 紫 染 色 的 方 式 紀 錄 細 胞 生 長 情 形, 做 growth curve 在 加 藥 後 第 天 染 出 的 當 起 始 值 ( 細 胞 數 目 當 作 1), 加 藥 後 第.. 天 染 出 的 跟 第 天 比 較 以 下 是 染 色 及 測 O.D value of 595 nm 以 顯 示 細 胞 數 目 的 方 式 : 1. 吸 去 medium 然 後 用 PBS 洗 兩 次 (1 ml/well). 加 5 μl 1% glutaldehyde (5 μl /well) for 15 minutes. ( 固 定 細 胞 於 well 上 ) 3. 吸 去 glutaldehyde 然 後 加.1% crystal violet ( μl /well) for 3 minutes.( 染 色 ). 吸 去 crystal violet 然 後 用 ddh O 洗 兩 次 5. 乾 了 以 後, 用 % 醋 酸 (1 ml/well) 溶 出 crystal violet. 收 集 於 9well plate( μl /well) 測 O.D value of 595 nm
7 七 實 驗 結 果 ( 一 ) Wedelolactone on 13 p8 13 p8 在 加 入 Wedelolactone 後 數 天 之 細 胞 成 長 倍 數 及 生 存 曲 線 : 細 胞 成 長 倍 數 Treat\day uM uM uM uM Growth Curve 13 p uM Wed..1uM Wed. 1uM Wed. 1uM Wed. 7
8 Wedelolactone on 13 P uM.1uM 1uM 1uM Concentration * 倍 顯 微 鏡 下 的 癌 細 胞 生 長 情 形 Treat with Wed. s on 13 p8.1 M.1 M 1 M 1 M 8
9 Treat with Wed. s on 13 p8.1 M.1 M 1 M 1 M ( 二 ) Wedelolactone on 13 p78 13 p78 在 加 入 Wedelolactone 後 數 天 之 細 胞 成 長 倍 數 及 生 存 曲 線 : 細 胞 成 長 倍 數 treat\day uM uM uM uM Growth Curve Wedelolactone on 13 P uM.1uM 1uM 1uM 9
10 Wedelolactone on 13p uM.1uM 1uM 1uM Concentration * 倍 顯 微 鏡 下 的 癌 細 胞 生 長 情 形 Treat with Wed. s on 13 p78.1 M.1 M 1 M 1 M 1
11 Treat with Wed. s on 13 p78.1 M.1 M 1 M 1 M Treat with Wed. s on 13 p78.1 M.1 M 1 M 1 M 11
12 ( 三 ) Wedelolactone on AI- AI- 在 加 入 Wedelolactone 後 數 天 之 細 胞 成 長 倍 數 及 生 存 曲 線 : 細 胞 成 長 倍 數 treat\day uM uM uM uM Growth Curve Wedelolactone on AI uM Wed..1uM Wed. 1uM Wed. 1uM Wed. Wedelolactone on AI Concentration.1uM.1uM 1uM 1uM 1
13 * 倍 顯 微 鏡 下 的 癌 細 胞 生 長 情 形 Treat with Wed. s on AI-.1 M.1 M 1 M 1 M Treat with Wed. s on AI-.1 M.1 M 1 M 1 M 13
14 Treat with Wed. s on AI-.1 M.1 M 1 M 1 M ( 三 ) Wedelolactone on AI- AI- 在 加 入 Wedelolactone 後 數 天 之 細 胞 成 長 倍 數 及 生 存 曲 線 : 細 胞 成 長 倍 數 treat\day uM uM uM uM Growth Curve Wedelolactone on AI uM Wed..1uM Wed. 1uM Wed. 1uM Wed. 1
15 Wedelolactone on AI uM.1uM 1uM Concentration 1uM * 倍 顯 微 鏡 下 的 癌 細 胞 生 長 情 形 Treat with Wed. s on AI-.1 M.1 M 1 M 1 M 15
16 Treat with Wed. s on AI-.1 M.1 M 1 M 1 M Treat with Wed. s on AI-.1 M.1 M 1 M 1 M 1
17 ( 三 ) Wedelolactone on UOS UOS 在 加 入 Wedelolactone 後 數 天 之 細 胞 成 長 倍 數 及 生 存 曲 線 : 細 胞 成 長 倍 數 treat\day uM uM uM uM Growth Curve Wedelolactone on UOS uM.1uM 1uM 1uM Wedelolactone on UOS uM.1uM 1uM Concentration 1uM 17
18 * 倍 顯 微 鏡 下 的 癌 細 胞 生 長 情 形 Treat with Wed. s on UOS.1 M.1 M 1 M 1 M 18
19 八 討 論 與 結 論 Wedelolactone on 13 p8 Wedelolactone on 13 P uM Wed..1uM Wed. 1uM Wed. 1uM Wed uM.1uM 1uM 1uM Wedelolactone on AI Wedelolactone on AI uM Wed..1uM Wed. 1uM Wed. 1uM Wed uM Wed..1uM Wed. 1uM Wed. 1uM Wed. Wedelolactone on UOS uM.1uM 1uM 1uM ( 一 ) Rv/3-13 所 衍 生 的 不 同 惡 性 程 度 的 前 列 腺 癌 細 胞,Wedelolactone 皆 有 明 顯 的 抑 制 效 果 由 實 驗 結 果 可 發 現,Wedelolactone 不 論 是 對 於 13 p8 13 p78, 皆 有 相 同 的 抑 制 效 果 因 此 Wedelolactone 不 只 可 以 抑 制 早 期 前 列 腺 癌, 對 於 晚 期 的 前 列 腺 癌 亦 有 所 作 用 ( 二 ) 前 列 腺 癌 細 胞 不 論 其 為 雄 性 素 依 存 或 不 依 存,Wedelolactone 皆 有 明 顯 的 抑 制 效 果 一 開 始 猜 測 Wedelolactone 或 許 是 因 為 間 接 抑 制 了 雄 性 素 對 癌 細 胞 的 生 長 幫 助, 藉 此 對 於 前 列 腺 癌 細 胞 有 抑 制 效 果 因 此 我 便 對 AI 系 列 的 前 列 腺 癌 細 胞 亦 19
20 做 相 同 的 處 理, 以 期 對 AI 有 較 不 明 顯 的 抑 制, 但 結 果 是,Wedelolactone 對 於 不 需 要 雄 性 素 的 AI 亦 有 抑 制 作 用, 因 此 Wedelolactone 抑 制 前 列 腺 癌 細 胞 的 機 制 還 有 待 研 究 ( 三 ) Wedelolactone 濃 度 達 1μΜ 以 上, 加 藥 第 天 後, 開 始 對 前 列 腺 癌 細 胞 產 生 明 顯 抑 制 而 Wedelolactone 對 於 骨 癌 細 胞, 則 幾 乎 沒 有 抑 制 性 實 驗 結 果 如 上 述 但 實 驗 後 發 現,UOS 在 加 藥 後 第 天,Wedelolactone 濃 度 為 1μM 的 細 胞, 竟 出 現 細 胞 老 化 現 象 ( 如 圖 ), 但 還 未 死 亡, 因 此 還 是 會 吸 收 染 劑 此 現 象 仍 跟 前 列 腺 癌 細 胞 直 接 死 亡 有 所 不 同, 因 實 驗 只 做 一 次, 恐 有 誤 差, 因 此 還 需 再 做 更 進 一 步 的 探 討 與 證 實 但 大 致 上,Wedelolactone 對 於 骨 癌 細 胞 的 抑 制 效 果, 遠 低 於 前 列 腺 癌 細 胞 ( 四 ) Wedelolactone 對 於 前 列 腺 癌 細 胞 有 專 一 性 Wedelolactone 對 於 骨 癌 細 胞, 相 較 於 前 列 腺 癌 細 胞, 幾 乎 不 對 其 有 任 何 抑 制 效 果, 因 此 猜 測 此 藥 只 對 前 列 腺 癌 有 效 由 此 可 推 論,Wedelolactone 的 目 標 物 應 該 位 於 前 列 腺 細 胞 相 對 於 其 他 體 細 胞 之 特 有 處 本 來 是 要 再 以 正 常 人 體 之 纖 維 母 細 胞 作 為 另 一 個 對 照 組, 礙 於 時 間 關 係 沒 有 做 完 但 後 來 實 驗 室 學 長 姐 有 做 此 實 驗, 發 現 相 較 於 前 列 腺 癌 細 胞, 正 常 人 體 之 纖 維 母 細 胞 明 顯 較 不 受 Wedelolactone 所 抑 制, 因 此 Wedelolactone 對 於 前 列 腺 癌 細 胞 應 有 專 一 性
壹、
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