如何迎接 临床基因诊断实验室 验收

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1 如 何 迎 接 临 床 基 因 诊 断 实 验 室 验 收 江 苏 省 临 床 检 验 中 心 许 斌

2 质 量 管 理 的 历 史 质 量 控 制 (Quality Control,QC) 良 好 实 验 室 实 践 准 则 (Good Laboratory Practice,GLP), 质 量 保 证 (Quality assurance, QA) 质 量 体 系 认 证 及 实 验 室 认 可 制 度 (TQM,Total Quality Management), 关 注 QI 质 量 体 系 认 证 ISO9000(2000 版 ) 实 验 室 认 可 ISO/IEC 标 准 校 准 和 检 测 实 验 室 资 格 的 通 用 要 求 ; ISO/DIS 标 准 医 学 实 验 室 的 质 量 管 理

3 检 验 流 程 图 TQM

4 美 国 临 床 实 验 室 认 证 发 证 机 构 :HCFA(Health Care Financing Administrations), 卫 生 保 健 署 认 证 依 据 :CLIA 88, 行 业 认 可, 强 制, 体 系 + 能 力 认 证 中 介 机 构 : JCAHO(Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations) 卫 生 机 构 认 可 联 合 委 员 会 CAP(College of American Pathologist) 美 国 病 理 家 学 会 COLA(Commission on Office Laboratory Accreditation) 医 生 实 验 室 认 可 委 员 会

5 我 国 实 验 室 合 格 评 定 国 家 评 定 实 验 室 认 可 依 据 :ISO/IEC 国 家 评 审, 自 愿, 体 系 + 能 力 质 量 体 系 认 证 依 据 :ISO 9000:2000 版 中 介 机 构, 自 愿, 体 系 行 业 技 术 验 收 临 床 实 验 室 管 理 办 法 ( 襁 褓 中 ) 江 苏 省 医 院 检 验 科 建 设 与 管 理 规 范 省 市 临 床 检 验 中 心, 强 制, 体 系 + 能 力

6 医 院 管 理 评 价 指 南 ( 试 行 ) 临 床 检 验 质 量 管 理 与 持 续 改 进 卫 医 发 (2005)104 号 贯 彻 落 实 病 原 微 生 物 实 验 室 生 物 安 全 管 理 条 例 等 有 关 规 定 临 床 检 验 实 验 室 集 中 设 置, 统 一 管 理, 资 源 共 享 实 验 室 管 理 统 一 标 准, 统 一 质 控, 保 证 质 量 临 床 检 验 实 验 室 布 局 与 流 程 应 当 安 全 合 理, 并 符 合 医 院 感 染 控 制 和 生 物 安 全 要 求 临 床 检 验 项 目 满 足 临 床 需 要, 并 能 提 供 24 小 时 急 诊 检 验 服 务

7 医 院 管 理 评 价 指 南 ( 试 行 ) 落 实 全 面 质 量 管 理 与 改 进 制 度, 按 照 规 定 开 展 室 内 质 控 参 加 室 间 质 评 没 有 质 控 的 临 床 检 验 项 目 或 科 研 项 目, 不 得 以 创 收 为 目 的, 不 得 向 临 床 出 具 检 验 报 告 检 验 报 告 及 时 准 确 规 范, 有 审 核 制 度 遵 守 检 验 项 目 和 检 测 仪 器 操 作 规 程, 定 期 校 准 检 测 系 统, 并 及 时 淘 汰 经 检 定 不 合 格 的 设 备 和 试 剂 患 者 医 师 与 护 理 人 员 对 检 验 部 门 服 务 满 意

8 医 院 管 理 评 价 指 南 ( 试 行 ) 三 级 综 合 医 院 统 计 指 标 临 床 化 学 室 间 质 评 平 均 合 格 血 液 学 室 间 质 评 平 均 合 格 免 疫 学 室 间 质 评 平 均 合 格 微 生 物 室 间 质 评 全 年 鉴 定 正 确 率 80% 开 展 成 分 输 血 比 例 90% 全 血 和 成 分 输 血 适 应 症 合 格 率 90% 常 规 检 验 检 查 项 目 出 报 告 时 间 30 分 钟 患 者 医 师 和 护 理 人 员 对 检 验 科 服 务 满 意 度 90%

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10 PCR 实 验 室 验 收 依 据 临 床 基 因 扩 增 检 验 实 验 室 管 理 暂 行 办 法 卫 医 发 [2002]10 号 临 床 基 因 扩 增 检 验 实 验 室 工 作 规 范 卫 检 字 [2002]8 号 关 于 成 立 临 床 基 因 扩 增 检 验 专 家 组 的 通 知 苏 卫 医 [2002]42 号

11 美 国 NCCLS NCCLS 对 NAT NAT 的 法 规 ( 一 ) 1993 年 1995 年 12 月 (MM3-A, 已 批 准 ) NAT 用 于 传 染 病 的 规 定 2000 年 ( MM1-A, 已 批 准 ) NAT 用 于 遗 传 病 的 规 定 2000 年 ( MM5-P, 审 定 中 ) NAT 用 于 血 液 病 的 规 定 2001 年 ( MM6-P, 审 定 中 ) 定 量 NAT 用 于 传 染 病 的 规 定 2001 年 ( MM7-P, 审 定 中 ) 原 位 杂 交 NAT 用 于 遗 传 病 的 规 定

12 美 国 NCCLS NCCLS 对 NAT NAT 的 法 规 ( 二 ) 2002 年 正 在 编 写 中 的 MM9 NAT 用 于 遗 传 病 的 规 定 MM10 遗 传 病 的 基 因 型 鉴 定 MM11 NAT 用 于 细 菌 分 裂 MM12 点 阵 式 NAT 在 临 检 中 的 应 用 方 法 MM13 NAT 的 样 品 制 备 MM14 NAT 的 质 控 MM15 NAT 在 人 类 基 因 组 应 用 中 的 规 定

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16 PCR 验 收 意 义 开 创 临 床 检 验 技 术 准 入 的 先 河 推 动 临 床 实 验 室 标 准 化 建 设 规 范 检 测 市 场 建 立 医 疗 事 故 预 防 机 制

17 已 验 收 实 验 室 第 一 个 : 深 圳 市 人 民 医 院 第 一 个 部 队 医 院 : 沈 阳 军 区 202 医 院 第 一 个 二 级 医 院 : 浙 江 温 岭 人 民 医 院 第 一 个 系 统 外 : 浙 江 计 划 生 育 研 究 所 第 一 个 一 次 同 时 8 家 : 江 苏 ( 省 人 医, 省 中, 军 总, 中 大, 鼓 楼, 宁 一 院, 南 通 附 院, 连 云 港 一 院 ) 第 一 个 独 立 实 验 室 : 广 州 金 域 最 多 的 省 份 : 浙 江 (90 家 ) 最 活 跃 的 地 区 : 华 东 地 区 (200 家 ) 第 一 批 :51 目 前 :300 左 右

18 实 验 室 验 收 申 请 表 实 验 室 验 收 表

19 验 收 基 本 程 序 材 料 初 审 ( 省 中 心 ): 实 验 室 设 置 人 员 仪 器 设 备 试 剂 标 准 操 作 程 序 (SOP) 文 件 材 料 初 审 合 格 即 安 排 人 员 现 场 初 验 ( 省 中 心 ), 合 格 者 准 予 试 远 行 上 报 部 中 心, 部 中 心 给 拟 委 派 专 家 发 出 技 术 验 收 任 务 书 给 被 验 收 单 位 发 出 验 收 通 知, 同 时 通 知 相 关 省 临 床 检 验 中 心 协 调 不 超 过 六 个 月, 部 省 组 成 联 合 专 家 组 进 行 现 场 验 收

20 初 审 实 验 室 设 置 合 理 实 验 室 面 积, 不 小 于 40 平 米, 4 个 分 区 ( 扩 增 检 测 一 体 可 合 并 3 4 区 ) 相 应 的 仪 器 设 备 防 污 染 措 施

21 防 污 染 物 理 的 : 分 区 及 单 向 流 动 专 用 移 液 器 一 次 性 试 管 架 紫 外 灯 PCR 工 作 罩 滤 芯 吸 嘴 化 学 的 :dutp/ung PCR 产 物 防 污 染 系 统 DNA 清 洁 液 制 度 和 操 作 规 范 方 法 学 的 : 即 时 Taqman 法,Lab-on-a-chip 芯 片 法,RT PCR 一 步 法

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23 固 定 移 液 器

24 易 耗 品

25 PCR 方 法 学 / 防 污 染 两 步 法 一 步 法 RT RNA cdna PCR Tth (RT+Taq) Taq RNA PCR Taqman CT (I-Cycler/7000 / COBAS-Taqman) 动 力 学 (Caliper AG-9900 自 动 加 样 ) Lab on a Chip 封 闭 废 液 孔

26 UNG/dUTP 系 统 扩 增 中 以 脱 氧 尿 苷 (dutp) 取 代 脱 氧 胸 苷 (dttp), 扩 增 产 物 可 被 尿 苷 酶 (UNG) 消 解, 在 经 加 热 处 理, 即 在 脱 氧 尿 苷 处 断 裂, 不 再 能 作 为 模 板 被 扩 增 后 续 扩 增 进 行 之 前 在 PCR 反 应 体 系 中 加 入 UNG 处 理, 在 预 变 性 加 热 后, 可 能 的 产 物 污 染 即 被 消 除 T A A T T A A T T A UNG 和 dutp 防 止 假 阳 性 的 图 解 这 种 假 阳 性 是 由 于 污 染 了 前 次 PCR 产 物 所 致 A T U A A T PCR A U A U A U A U A * U A U UNG A A A A A 加 热 A PCR 防 污 染 PCR

27 实 验 室 分 区 原 则 单 一 流 向 明 确 的 识 别 标 记 各 区 仪 器 设 备 物 品 配 备 的 充 分 性 和 科 学 性 防 污 染

28 分 区

29 3 总 面 积 为 50 平 方 米 的 场 地, 可 分 隔 如 下 : 冰 箱 实 验 台 洗 扳 机 水 槽 后 PCR 区 热 循 环 仪 计 算 机 酶 标 仪 或 芯 片 仪 冰 箱 防 污 罩 冰 箱 防 污 罩 打 印 机 实 验 台 实 验 台 样 品 加 样 区 阳 性 对 照 加 样 区 恒 温 箱 离 心 机 冰 箱 防 污 罩 样 品 制 备 区 前 PCR 区 实 验 台 单 向 流 动 生 物 样 品 单 向 传 递 窗 双 向 流 动

30 分 区

31 南 通 医 学 院 附 属 医 院 临 床 基 因 诊 断 实 验 室 布 局 及 人 流 物 流 平 面 示 意 图 产 物 分 析 区 门 门 PCR 扩 增 区 门 样 品 准 备 区 样 品 接 收 区 门 工 作 走 向 门 试 剂 准 备 区

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33 试 剂 准 备 区 试 剂 准 备 区 的 仪 器 设 备 主 要 有 加 样 器 天 平 和 离 心 机 等, 除 了 要 专 用 外, 还 应 有 定 期 校 准 试 剂 分 装 应 在 超 净 台 中 进 行 通 过 质 控 一 是 看 是 否 有 污 染 ( 试 剂 空 白 ), 即 是 否 有 假 阳 性 存 在 ; 二 是 了 解 扩 增 检 测 效 果 ( 弱 阳 性 质 控 物 )

34 标 本 制 备 区 标 本 制 备 区 内 的 生 物 安 全 柜 超 净 台 加 样 器 离 心 机 及 其 它 设 备 都 应 使 用 10% 次 氯 酸 钠 溶 液 消 毒, 然 后 用 蒸 馏 水 或 70% 乙 醇 洗 涤 去 除 残 留 的 次 氯 酸 钠. 标 本 制 备 的 全 过 程 中 都 应 戴 一 次 性 手 套, 并 经 常 更 换 实 验 时 所 使 用 的 加 样 器 吸 头 必 须 带 滤 芯

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36 扩 增 区 扩 增 区 的 主 要 仪 器 就 是 核 酸 扩 增 热 循 环 仪 扩 增 反 应 体 系 的 配 制 和 提 取 核 酸 的 加 入 可 在 标 本 制 备 区 也 可 在 本 区 内 进 行, 关 键 是 要 防 止 产 物 的 污 染 加 样 时, 先 加 提 取 的 核 酸 模 板 样 本, 每 加 完 一 个 即 盖 好 盖 子, 然 后 加 阳 性 质 控 核 酸 模 板, 再 就 是 标 本 制 备 阴 性 质 控 和 仅 含 按 样 本 一 样 稀 释 的 主 反 应 混 合 液 的 扩 增 阴 性 质 控

37 产 物 检 测 区 本 区 是 唯 一 能 打 开 扩 增 后 反 应 管 的 地 方 由 于 本 工 作 区 应 设 置 为 负 压 状 态, 空 气 流 向 为 由 外 向 内, 以 防 止 扩 增 产 物 气 溶 胶 流 出, 故 本 区 可 无 缓 冲 间 本 区 所 使 用 的 仪 器 设 备 可 能 有 酶 标 仪 洗 板 机 加 样 器 和 水 浴 箱 等, 酶 标 仪 应 定 期 校 准, 洗 板 机 每 次 使 用 完 都 应 进 行 清 洗, 其 它 如 加 样 器 和 水 浴 箱 可 按 有 关 方 法 进 行 校 准

38 初 审 人 员 要 求 操 作 人 员 经 有 资 质 的 单 位 培 训, 考 试 合 格 获 取 上 岗 证 ; 数 量 足 够 ; 再 培 训 计 划 专 业 主 管 为 本 科 以 上 学 历 和 中 级 以 上 职 称, 三 年 以 上 工 作 经 历 工 作 人 员 有 专 业 技 术 职 称 培 训 单 位 须 由 省 卫 生 厅 指 定, 部 临 检 中 心 认 可

39 诊 断 试 剂 管 理 由 SDA 管 理 报 批 程 序 : 申 报 ( 提 供 试 剂 盒 方 法 学 性 能 及 相 关 资 料 ) 生 物 检 定 所 (Kit 性 能 指 标 评 价 ) 临 床 考 核 (SDA 确 认 的 三 家 以 上 单 位 ) 新 药 证 书 GMP 认 证 生 产 许 可 证 ( 试 准 )

40 已 通 过 SDA 审 批 的 临 床 基 因 扩 增 检 测 试 剂 盒 列 表 生 产 厂 家 试 剂 盒 名 称 新 药 证 书 编 号 生 产 批 准 文 号 深 圳 匹 基 乙 型 肝 炎 荧 光 试 剂 盒 国 药 证 字 (1999)S-48 国 药 试 字 S 丙 型 肝 炎 荧 光 试 剂 盒 国 药 证 字 (2000)S-01 国 药 试 字 S 结 核 分 支 杆 菌 荧 光 试 剂 盒 国 药 证 字 (2000)S-41 国 药 试 字 S 沙 眼 衣 原 体 和 淋 球 菌 荧 光 双 检 试 剂 盒 国 药 证 字 S 国 药 试 字 S 上 海 久 盛 乙 型 肝 炎 - 酶 免 试 剂 盒 国 药 证 字 (2000)S-16 结 核 分 支 杆 菌 - 酶 免 试 剂 盒 国 药 证 字 (2000)S-10 沙 眼 衣 原 体 - 酶 免 试 剂 盒 国 药 证 字 (2000)S-36 中 山 大 学 达 安 乙 型 肝 炎 荧 光 试 剂 盒 国 药 证 字 (1999)S-50 国 药 试 字 S 丙 型 肝 炎 荧 光 试 剂 盒 国 药 证 字 (2000)S-44 国 药 试 字 S 结 核 分 支 杆 菌 荧 光 试 剂 盒 国 药 证 字 (2000)S-43 国 药 试 字 S 沙 眼 衣 原 体 荧 光 试 剂 盒 国 药 证 字 S 国 药 准 字 S 广 州 蓝 星 乙 型 肝 炎 - 酶 免 试 剂 盒 国 药 证 字 S 结 核 分 支 杆 菌 - 酶 免 试 剂 盒 国 药 证 字 S 沙 眼 衣 原 体 - 酶 免 试 剂 盒 国 药 证 字 S

41 已 通 过 SDA 审 批 的 临 床 基 因 扩 增 检 测 试 剂 盒 列 表 上 海 浩 源 乙 型 肝 炎 - 酶 免 定 量 试 剂 盒 国 药 证 字 (2000)S-02 厦 门 安 普 利 乙 型 肝 炎 - 荧 光 试 剂 盒 国 药 证 字 S 结 核 分 支 杆 菌 - 荧 光 试 剂 盒 国 药 证 字 S 沙 眼 衣 原 体 - 荧 光 试 剂 盒 国 药 证 字 S 华 美 乙 型 肝 炎 - 酶 免 试 剂 盒 国 药 证 字 S 丙 型 肝 炎 - 酶 免 试 剂 盒 国 药 证 字 S 结 核 分 支 杆 菌 - 酶 免 试 剂 盒 国 药 证 字 S 沙 眼 衣 原 体 - 酶 免 试 剂 盒 国 药 证 字 S 上 海 复 星 乙 型 肝 炎 - 杂 交 梳 试 剂 盒 国 药 证 字 (2000)S-15 结 核 分 支 杆 菌 - 杂 交 梳 试 剂 盒 国 药 证 字 (2000)S-17 沙 眼 衣 原 体 - 杂 交 梳 试 剂 盒 国 药 证 字 S 上 海 申 友 乙 型 肝 炎 荧 光 试 剂 盒 国 药 证 字 S 沙 眼 衣 原 体 - 酶 免 试 剂 盒 国 药 证 字 S

42 仪 器 设 备 索 证 ( 仪 器 档 案 必 须 有 注 册 证 合 格 证 销 售 证 ) 操 作 手 册 ( 实 验 室 的 法 规 ) 维 护 及 使 用 记 录 ( 仪 器 状 态 的 证 明 ) 校 准 和 质 控 程 序 及 记 录 ( 准 确 性 和 精 密 度 的 证 明 ) 计 量 设 备 的 强 检 记 录

43 软 件 要 求 目 的 是 使 检 测 的 全 过 程 ( 从 采 样 到 发 出 报 告 后 ) 处 于 全 面 质 量 控 制 13 个 SOP 是 最 低 要 求, 最 好 能 将 检 测 相 关 的 所 有 活 动 均 用 文 件 化 的 SOP 加 以 规 范 SOP 是 由 专 业 主 管 组 织 操 作 人 员 编 写, 由 最 高 管 理 者 批 准 实 施 SOP 一 定 要 明 确 谁 做 谁 负 责

44 规 定 应 具 有 的 SOP 仪 器 设 备 的 维 护 保 养 程 序 仪 器 设 备 的 校 准 程 序 仪 器 设 备 的 操 作 程 序 临 床 标 本 的 收 集 程 序 临 床 标 本 的 处 理 ( 核 酸 纯 化 ) 程 序 临 床 标 本 的 保 存 程 序 核 酸 扩 增 及 产 物 分 析 检 测 的 操 作 程 序 试 剂 的 质 检 操 作 程 序 消 耗 品 购 置 验 收 和 储 存 程 序 废 弃 物 的 处 理 程 序 内 务 管 理 程 序 室 内 质 量 控 制 程 序 抱 怨 处 理 程 序

45 ISO/IEC 标 准 内 容 标 准 ( 溯 源 及 校 准 ) 人 ( 员 ) 机 ( 仪 器 设 备 ) 料 ( 试 剂 及 耗 品 ) 样 ( 品 ) 法 ( 方 法 学 ) 测 ( 操 作 报 告 记 录 )

46 SOP 的 编 写 质 量 手 册 生 物 安 全

47 申 请 单 按 照 病 历 书 写 规 范 的 要 求 及 格 式 项 目 编 号 使 用 卫 生 部 统 一 编 号 申 请 项 目 的 完 整 性 及 合 理 性 编 号 的 唯 一 性 ( 包 括 标 本 报 告 ) 原 始 单 的 保 留 (2 年 ) 标 本 采 集 接 受 时 间

48 报 告 单 检 验 报 告 单 应 包 含 以 下 信 息 : 实 验 室 名 称 唯 一 性 编 号 日 期 检 测 项 目 及 其 方 法 结 果 参 考 值 实 验 室 声 明 ; 定 性 结 果 以 中 文 形 式 报 告, 不 得 以 符 号 表 示 ; 检 测 者 和 审 核 者 签 全 名 检 验 科 已 建 立 计 算 机 网 络 系 统, 可 将 申 请 单 和 报 告 单 分 开, 格 式 及 内 容 参 照 病 历 书 写 规 范 的 要 求 执 行 实 习 生 进 修 人 员 见 习 期 工 作 人 员 无 报 告 权, 需 由 带 教 老 师 签 发 ; 新 分 配 毕 业 生 见 习 期 满 后, 经 专 业 主 管 考 核 合 格, 由 科 主 任 批 准 可 获 得 某 一 或 几 个 专 业 的 报 告 权 所 有 报 告 须 经 有 关 人 员 审 核 后 发 出 : 当 室 内 质 控 在 控 时, 常 规 报 告 由 专 业 主 管 指 定 的 检 验 人 员 审 核 后 发 出 ; 异 常 结 果 及 室 内 质 控 失 控 时, 需 采 取 措 施 处 理 后 由 专 业 主 管 审 核 发 出 采 取 有 效 措 施 保 留 所 有 报 告 的 原 始 数 据

49 RIA 南 京 医 学 放 射 免 疫 检 测 中 心 南 京 市 第 一 医 院 中 心 实 验 室 报 告 单 样 本 号 :87 姓 名 : 沙 朝 民 性 别 : 男 年 龄 :58 住 院 号 : 病 区 : 床 号 : 标 本 类 型 : 血 清 标 本 性 状 : 正 常 临 床 诊 断 : 乙 肝? 送 检 医 院 : 南 京 市 第 一 医 院 送 检 医 生 : 张 振 玉 接 收 日 期 : :00 编 码 : 项 目 检 测 方 法 结 果 检 出 限 HBV-DNA TaqMan 荧 光 定 量 报 告 日 期 : :00 检 测 人 : 夏 伟 审 核 人 : 王 书 奎 送 标 本 地 点 : 长 乐 路 68 号 南 京 市 第 一 医 院 急 诊 楼 电 话 : ( 或 8353) 实 验 室 声 明 : 本 实 验 室 已 通 过 国 家 认 证, 检 验 结 果 只 对 所 测 标 本 负 责, 如 有 疑 问 请 在 一 周 内 提 出

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52 部 现 场 验 收 严 重 缺 陷 设 置 人 员 设 备 试 剂 室 间 质 评 室 内 质 控 生 物 安 全 柜 合 格 评 定 5 项 一 般 缺 陷 合 格 一 项 严 重 缺 陷 或 和 5-10 项 一 般 缺 陷 基 本 合 格 二 项 严 重 缺 陷 或 和 11 项 以 上 一 般 缺 陷 不 合 格

53 评 审 中 常 见 问 题 文 件 不 全, 无 系 统 性 质 量 要 素 描 述 不 全 格 式 不 对 与 实 际 工 作 脱 节 无 现 行 有 效 性 ( 无 手 签, 各 区 无 相 应 手 册 ) 记 录 不 全 不 规 范

54 人 员 人 员 档 案 : 每 人 一 个 档 案 袋, 有 关 资 格 证 书 ( 如 上 岗 证 ) 培 训 技 能 和 经 历 等 培 训 计 划 及 实 施 记 录 : 每 人 有 年 度 季 度 月 的 培 训 内 容 及 实 施 记 录 ; 内 容 包 括 外 出 学 习 进 修, 内 部 质 量 手 册 学 习 业 务 学 习 新 项 目 引 进 等

55 设 施 与 环 境 通 风 ( 排 风 扇 开 窗 ) 紫 外 ( 环 境 桌 面 ) 清 洁 消 毒 的 程 序 及 记 录 生 物 防 护 和 实 验 室 安 全 的 程 序 及 记 录 生 物 垃 圾 的 处 理 ( 黄 黑 )

56 采 购 程 序 及 验 收 标 准 校 准 程 序 及 状 态 标 识 仪 器 设 备 使 用 维 护 保 养 的 程 序 及 记 录 档 案 : 每 个 与 检 测 质 量 相 关 的 设 备 均 应 建 档, 内 容 包 括 : 设 备 的 名 称 ; 制 造 商 名 称 型 号 序 号 或 其 它 唯 一 性 标 识 ; 接 收 日 期 和 启 用 日 期 ;) 目 前 放 置 地 点 ; 接 收 时 的 状 态 ( 例 如 全 新 的 经 改 装 的 ); 仪 器 使 用 说 明 书 或 其 复 印 件 ; 校 准 和 / 或 检 测 的 日 期 和 结 果 以 及 下 次 校 准 和 / 或 检 测 的 日 期 ; 迄 今 所 进 行 的 维 护 和 今 后 维 护 计 划 的 细 节 ; 损 坏 故 障 改 装 或 修 理 的 历 史 应 急 措 施 : 故 障 停 电 破 管 爆 盖

57 校 准 需 校 准 的 仪 器 设 备 : 与 检 测 准 确 度 相 关 的, 加 样 器 温 度 计 低 温 冷 冻 离 心 机 加 热 模 块 ( 水 浴 箱 ) PCR 仪 等 校 准 的 技 术 参 数 : 加 样 器 ---- 加 样 精 度 准 确 度 温 度 计 ---- 指 示 温 度 的 准 确 度 冷 冻 离 心 机 加 热 模 块 ( 水 浴 箱 )---- 温 度 均 一 性 准 确 度 PCR 仪 ---- 温 度 光 学 荧 光 校 准 方 法 : 自 检 测 送 校 校 准 周 期 : 厂 方 或 计 量 局 校 准 状 态 维 持

58 料 ( 试 剂 耗 品 ) 采 购 程 序 及 领 用 记 录 质 检 标 准 程 序 及 记 录 应 急 程 序 : 缺 货 试 剂 变 质 室 内 质 控 品

59 样 ( 品 ) 标 本 唯 一 编 号, 年 月 日 项 目 顺 序 号 标 本 采 集 标 准 操 作 程 序 标 本 接 受 ( 拒 收 ) 标 准 交 接 记 录 标 本 保 存 销 毁 的 程 序 及 记 录 标 本 处 理 标 准 操 作 程 序

60 临 床 标 本 的 接 收 接 收 处 : 四 个 区 之 外 标 本 应 为 原 始 收 集, 不 能 用 分 自 于 生 化 或 免 疫 检 验 标 本 核 酸 提 取 时, 由 基 因 扩 增 检 验 实 验 室 人 员 将 标 本 带 入 至 标 本 制 备 区

61 标 本 采 集 标 本 采 集 的 操 作 程 序 (SOP) 患 者 准 备 方 法 ; 标 本 收 集 方 法 ; 标 本 标 识 方 法 ; 标 本 运 送 条 件 和 方 法 ; 保 证 从 标 本 收 集 到 检 测 完 成 并 报 告 结 果 期 间 标 本 的 完 整 性 和 唯 一 标 识 ; 标 本 拒 绝 ( 不 合 格 标 本 应 建 议 重 新 采 集 ) 标 本 的 交 接 : 数 量 质 量 时 间 实 验 室 间 标 本 传 递 : 数 量 质 量 时 间 唯 一 性 标 本 的 保 留 : 一 般 标 本 与 重 要 标 本 的 留 样 时 间 方 式 记 录 及 启 用 程 序

62 标 本 收 集 标 本 采 集 时 间 对 扩 增 检 测 结 果 的 影 响 标 本 采 集 部 位 的 准 备 标 本 的 类 型 和 采 集 量 采 样 质 量 的 评 价 采 样 及 运 输 容 器 标 本 采 集 中 的 防 污 染

63 全 血, 血 清 ( 浆 ) 标 本 对 于 DNA 测 定 的 项 目, 血 清 标 本 的 采 集 和 保 存 与 一 般 血 液 标 本 的 处 理 程 序 基 本 相 同, 对 PCR 实 验 影 响 不 大 但 抗 凝 剂 通 常 用 EDTA 或 枸 橼 酸 盐, 而 不 用 肝 素 抗 凝, 因 为 肝 素 是 Taq 酶 的 强 抑 制 剂, 且 在 核 酸 提 取 过 程 中 难 以 将 其 去 除 抗 凝 血 应 在 3 小 时 内 分 离 血 浆 ; 未 作 抗 凝 处 理 则 应 在 1 小 时 内 分 离 出 血 清 标 本 如 需 长 期 保 存, 应 保 存 于 -70 以 下, 并 避 免 反 复 冻 融 全 血 标 本 如 用 于 DNA 检 测, 可 于 4 下 短 期 保 存 ; 如 用 于 RNA 检 测, 则 应 在 采 血 后, 尽 快 提 取 RNA 若 从 外 周 血 单 个 核 细 胞 中 提 取 RNA 或 DNA, 则 先 用 淋 巴 细 胞 分 离 液 或 通 过 红 细 胞 裂 解 液 得 到 单 个 核 细 胞 若 暂 不 提 取 核 酸, 单 个 核 细 胞 可 于 -70 保 存

64 使 用 真 空 采 血 管 分 离 胶 不 抗 凝 标 本 对 免 疫 項 目 ( 化 学 发 光 法 ) 的 影 响 对 玻 璃 采 血 管 的 比 例 (%) (%) AFP CEA CA 19-9 TSH FT3 FT4 HBsAg VB12

65 痰 自 然 咳 痰 : 最 好 留 取 晨 痰 ( 晨 痰 量 多, 含 菌 量 多 ) 肺 部 分 泌 液 : 因 为 唾 液 标 本 分 离 不 到 病 原 菌 支 气 管 肺 泡 冲 洗 液 痰 液 无 论 普 通 培 养 还 是 进 行 PCR 检 测, 都 应 连 续 2-3 天 采 集 标 本 送 检

66 痰 属 于 分 泌 物, 临 床 上 常 用 作 结 核 杆 菌 DNA 测 定 样 本, 由 于 痰 标 本 中 含 有 大 量 粘 蛋 白 和 杂 质, 故 在 核 酸 提 取 时, 需 对 样 本 进 行 初 步 处 理, 用 1mol/L NaOH 液 化, 需 注 意 的 是, 液 化 时 不 能 加 热, 液 化 时 间 不 能 过 长 液 化 标 本 如 不 立 即 用 于 核 酸 提 取, 可 保 存 于 70 下 此 外, 对 用 于 非 结 核 杆 菌 如 肺 炎 支 原 体 的 PCR 检 测, 痰 标 本 只 能 室 温 悬 浮 于 生 理 盐 水 中, 充 分 振 荡 混 匀, 促 使 大 块 粘 状 物 下 沉, 取 上 清 离 心, 所 得 到 的 沉 淀 物 即 可 用 于 核 酸 提 取

67 棉 拭 子 在 使 用 PCR 方 法 检 测 性 病 病 原 体 时, 临 床 标 本 一 般 为 棉 拭 子 ( 停 留 约 秒 ), 可 将 已 采 样 的 棉 拭 子 置 于 适 量 生 理 盐 水 中, 充 分 震 荡 洗 涤 后, 室 温 静 置 5-10 分 钟, 待 大 块 状 物 下 沉 后, 取 上 清 立 即 离 心, 其 后 的 沉 淀 即 可 用 于 DNA 提 取 如 不 立 即 用 于 核 酸 提 取, 则 需 保 存 于 -70 下

68 脓 液 脓 液 的 处 理 依 情 况 而 定, 如 用 于 分 枝 杆 菌 ( 如 结 核 杆 菌 ) 核 酸 测 定 的 标 本, 粘 稠 的 脓 液 同 痰 标 本 的 处 理 模 式, 先 进 行 液 化, 再 离 心 取 沉 淀 提 取 DNA; 水 样 的 脓 液 则 直 接 离 心, 沉 淀 用 生 理 盐 水 洗 2-3 次 后, 即 可 用 于 DNA 提 取 对 于 用 于 非 分 支 杆 菌 测 定 的 脓 液 标 本, 如 过 于 粘 稠, 则 加 入 适 量 生 理 盐 水, 充 分 振 荡 后, 静 置, 取 上 清 立 即 离 心, 沉 淀 用 于 DNA 提 取 ; 如 为 水 样, 则 按 上 述 直 接 离 心 取 沉 淀 即 可 沉 淀 样 本 的 保 存 条 件 同 样 为 -70

69 体 液 临 床 体 液 标 本 包 括 胸 水, 腹 水, 脑 脊 液, 尿 液 等, 可 按 水 样 标 本 的 方 式 离 心 取 沉 淀 后, 提 取 核 酸 沉 淀 样 本 的 保 存 同 上

70 组 织 组 织 有 新 鲜 组 织 块 和 石 蜡 切 片 新 鲜 组 织 块 的 处 理 步 骤 首 先 用 生 理 盐 水 洗 二 次, 然 后 将 其 捣 碎 或 切 碎, 加 入 生 理 盐 水 后 剧 烈 振 荡 混 匀, 离 心, 弃 上 清, 在 用 蛋 白 酶 K 消 化 后 提 取 核 酸 新 鲜 组 织 最 好 是 保 存 于 50% 乙 醇 中, 具 体 做 法 是, 先 用 生 理 盐 水 将 组 织 洗 一 次, 切 成 宽 度 小 于 1cm 的 小 片, 加 入 适 量 的 生 理 盐 水, 然 后, 边 摇 边 加 入 无 水 乙 醇 至 终 浓 度 为 50% 这 样 固 定 的 组 织 样 本 室 温 下 可 保 存 数 日,4 可 保 存 6 年 石 蜡 切 片 用 于 核 酸 提 取, 需 先 用 辛 烷 或 二 甲 苯 脱 腊, 用 蛋 白 酶 K 消 化 后 即 可 进 行 DNA 提 取

71 培 养 细 胞 收 集 培 养 细 胞 约 细 胞 培 养 液 离 心 沉 淀 后, 按 常 规 方 法 提 取 核 酸

72 特 殊 标 本 包 括 血 斑 口 腔 上 皮 细 胞 毛 发 精 斑 混 合 斑 凝 血 块 等 标 本 核 酸 制 备 方 法 是 先 剪 碎 或 用 生 理 盐 水 洗 脱 出 沉 淀 物, 然 后 经 离 心 得 到 沉 淀, 按 常 规 方 法 提 取 核 酸 如 不 立 即 用 于 核 酸 提 取, 则 需 保 存 于 -70 下

73 标 本 品 种 来 源 数 量 采 集 时 间 送 样 人 质 量 接 收 时 间 接 收 人 全 血 血 清 体 液 其 他 建 议 下 列 标 本 重 采 重 采 理 由 签 名

74 标 本 处 理 登 记 及 时 正 确 分 离 分 发 回 收 保 存 销 毁 及 记 录

75 标 本 号 姓 名 品 种 来 源 分 发 实 验 室 回 收 保 存 地 销 毁

76 核 酸 提 取 的 改 良 方 法 1 旋 转 离 心 柱 提 取 (Spin( column) 旋 转 离 心 柱 技 术 是 从 生 物 样 品 中 分 离 纯 化 微 量 核 酸 的 较 为 简 便 的 方 法, 属 于 硅 吸 附 方 法 的 一 种 是 美 国 和 欧 洲 的 科 学 家 们 从 20 世 纪 80 年 代 末 起 开 始 研 制 的 一 种 微 量 快 速 的 核 酸 分 离 纯 化 方 法, 其 克 服 了 传 统 核 酸 纯 化 方 法 的 缺 陷, 适 合 于 现 代 分 子 生 物 学 工 作 需 要 进 行 大 量 微 量 核 酸 分 离 纯 化 的 工 作 特 点 在 美 国, 旋 转 离 心 柱 技 术 出 现 在 90 年 代 初, 以 后 逐 渐 被 市 场 和 技 术 工 作 人 员 所 接 受, 成 微 量 核 酸 分 离 纯 化 的 主 导 技 术

77 原 理 : 1 利 用 裂 解 液 促 使 细 胞 破 碎, 使 细 胞 中 的 核 酸 释 放 出 来 ; 2 把 释 放 的 核 酸 特 异 地 吸 附 在 特 定 的 硅 载 体 上, 当 然 这 种 载 体 只 对 核 酸 有 较 强 的 亲 和 力 和 吸 附 力 而 对 其 它 的 生 化 组 分 如 蛋 白 质 多 糖 脂 类 则 不 相 亲 和 也 不 吸 附 ; 3 把 吸 附 在 特 定 载 体 上 的 核 酸 洗 脱 下 来, 从 而 得 到 纯 化 的 核 酸

78 旋 转 离 心 柱 技 术 的 一 次 操 作 过 程 一 般 在 10 分 钟 到 20 分 钟 不 等, 比 传 统 纯 化 方 法 的 操 作 时 间 ( 几 个 小 时 ) 大 大 减 少 旋 转 离 心 柱 纯 化 的 DNA 产 物 的 OD 260 /OD 280 一 般 在 之 间,RNA 物 的 OD 260 /OD 280 一 般 在 之 间 ; 分 离 纯 化 效 率 在 80%- 100% 之 间 能 快 速 简 便 地 从 生 物 样 品 中 分 离 纯 化 包 括 人 体 DNA 质 粒 DNA 总 RNA mrna 在 内 的 各 类 脱 氧 核 糖 核 酸 (DNA) 和 核 糖 核 (RNA) 大 分 子

79 2 玻 璃 粉 吸 附 法 (Adsorption( by glass powde) DNA 或 RNA 可 特 异 地 吸 附 于 玻 璃 粉 上, 因 此 将 玻 璃 粉 悬 液 与 临 床 标 本 混 匀 离 心 洗 璃 粉 沉 淀, 即 可 从 玻 璃 粉 上 获 得 纯 化 的 核 酸 Yamada 等 为 简 化 使 用 PCR 检 测 病 原 体 的 核 酸 提 取 方 法, 使 用 玻 璃 粉 悬 液 直 接 从 人 外 周 血 单 个 核 细 胞 (PBMC) 和 血 浆 中 提 取 核 酸, 这 样 得 到 的 核 酸 标 本 用 于 DNA 和 RNA 的 扩 增 检 测, 得 到 满 意 的 结 果 其 提 取 方 法 分 述 如 下 :

80 3 二 氧 化 硅 (Se( Se) 或 硅 藻 (D( 颗 粒 ) 吸 附 法 除 了 玻 璃 粉 以 外,Se 和 硅 藻 ( 单 细 胞 藻 类 的 化 石 化 细 胞 壁,D) 颗 粒 也 具 有 特 异 吸 附 核 酸 的 特 性 Chatropic 试 剂 硫 酸 氨 版 兼 具 细 胞 裂 解 及 核 酸 失 活 两 种 特 性, 因 而 在 高 浓 度 硫 氨 酸 肌 存 在 下, 从 细 胞 ( 包 括 细 菌 ) 或 病 毒 颗 粒 中 释 放 出 的 核 酸 成 分 可 结 合 于 Se 或 D 颗 粒 上 Boom 等 利 用 硫 氨 酸 版 和 Se 或 D 颗 粒 的 上 述 特 性, 成 功 地 从 血 清 尿 液 以 及 细 胞 中 纯 化 了 DNA 和 RNA, 可 在 不 到 1 小 时 内 完 成 12 个 不 同 临 床 标 本 的 核 酸 提 取 工 作, 其 有 Y/ Se 和 Y/D 两 种 提 取 方 案,Y/Se 方 案 为 使 用 Se 以 提 取 血 液 和 尿 液 等 体 液 中 的 核 酸 ;Y/D 方 案 为 使 用 D 颗 粒 以 提 取 细 胞 中 的 核 酸

81 Y/Se 方 案 50μl 血 清 或 尿 液 加 入 900μ 裂 解 缓 冲 液 L6 及 40μlSe lse, 混 匀 5 秒, 室 温 10min 转 混 匀 5 秒, 离 心 rmp 离 心 15 秒 用 洗 涤 缓 冲 溶 液 L2 将 沉 淀 洗 涤 2 次 沉 淀 用 70% 乙 醇 洗 2 次, 丙 酮 洗 1 次 去 掉 丙 酮, 反 应 管 开 盖 56 干 燥 10min 加 入 溶 解 缓 冲 溶 液 TE, 混 匀 min12 min rpm 离 心 2min, 上 清 即 含 纯 化 的 核 酸

82 特 点 : 1 可 以 从 血 清 或 尿 液 中 高 产 量 地 ( 通 常 超 过 50%) 提 取 单 链 双 链 共 价 闭 合 或 开 环 的 DNA 或 RNA, 其 可 作 为 限 制 性 内 切 酶 DNA 连 接 酶 反 转 录 酶 大 肠 杆 菌 DNA 多 聚 酶 和 Taq DNA 多 聚 酶 的 良 好 基 质 2 适 用 于 病 毒 及 革 兰 阴 性 菌 ( 如 脑 膜 炎 球 菌 伤 寒 杆 菌 淋 球 菌 等 ) 的 基 因 组 核 酸 提 取, 但 不 能 直 接 从 革 兰 阳 性 菌 ( 如 金 黄 色 葡 萄 球 菌 链 球 菌 或 酵 母 菌 等 ) 中 提 取 核 酸, 原 因 可 能 是 由 于 硫 氨 酸 服 不 能 很 好 的 裂 解 革 兰 阳 性 菌 3 在 提 取 用 于 HBV-DNA 检 测 的 血 清 核 酸 标 本 时, 由 于 HBV-DNA 的 长 负 链 5' 末 端 共 价 结 合 有 蛋 白 质, HBV-DNA 难 以 从 Se 颗 粒 上 洗 脱 下 来

83 Y/D 方 案 该 方 案 与 上 述 方 案 基 本 相 同, 所 不 同 的 是 使 用 颗 粒 较 大 的 D 取 代 Se, 以 提 取 相 对 量 多 (10~20 μg) 的 细 胞 基 因 组 核 酸, 因 为 如 使 用 Se, 由 于 DNA 分 子 多, 一 个 Se 颗 粒 可 与 数 个 DNA 分 子 结 合, 从 而 在 Se 颗 粒 和 DNA 分 子 之 间 形 成 密 实 的 网 状 结 构, 而 成 为 聚 集 物, 即 使 是 高 速 旋 转 也 难 以 使 其 散 开, 使 得 核 酸 提 取 的 后 续 步 骤 无 法 进 行 而 D 颗 粒 较 Se 颗 粒 大 得 多, 在 D 和 核 酸 分 子 之 间 不 会 形 成 密 实 的 结 构, 经 旋 转 很 容 易 散 开

84 4 微 量 全 血 核 酸 提 取 法 一 般 用 于 全 血 核 酸 提 取 的 方 法 常 需 较 大 量 的 血 液 标 本, 难 以 适 于 患 儿, 为 此 Loparev 等 于 1991 年 提 出 了 一 个 使 用 NaI 的 微 量 全 血 核 酸 提 取 法 该 法 可 在 30min 内 即 在 一 个 微 量 离 心 管 中 即 可 完 成 整 个 过 程, 从 每 ml 血 液 中 可 提 取 40-50μg 核 酸 抗 凝 全 血 (10-100μl) 加 入 等 体 积 6mol/L NaI, 旋 转 秒 ; 加 入 等 体 积 氯 仿 : 异 戊 醇, 旋 转 秒 离 心 5min, 取 出 水 相 加 入 0.6 体 积 异 丙 醇, 混 匀,3min 后 离 心 用 37% 异 丙 醇 洗 涤 核 酸 沉 淀 物 用 μl TE 缓 冲 溶 液 溶 解 沉 淀

85 5 基 因 释 放 剂 提 取 法 此 方 法 是 Bio Ventures 公 司 的 专 利 产 品, 主 要 是 一 种 亲 水 多 聚 体, 可 帮 助 细 胞 裂 解, 并 可 作 为 沉 淀 与 吸 附 蛋 白 质 的 成 核 位 点 多 聚 体 亦 有 一 定 的 螯 合 性, 对 脂 类 和 多 糖 类 有 亲 和 性, 而 对 核 酸 的 亲 合 性 很 低 试 剂 组 成 :0.1mol/L Tris-Hcl 0.5mol/L Kcl 10%DMSO ph 的 水 溶 液 中 含 有 20% 专 利 的 活 性 亲 水 性 多 聚 体

86 6 核 酸 提 取 自 动 化 仪 器 的 使 用 近 年 一 些 用 于 核 酸 提 取 的 仪 器 正 在 进 入 基 因 检 测 的 检 验 领 域, 如 Roche 的 MagNa Pure LC 全 自 动 核 酸 提 取 仪 美 国 ABI 公 司 的 ABI PRISM TM 6700 及 ABI PRISM TM 6100 自 动 核 酸 提 取 仪 等 等 这 些 仪 器 的 应 用 为 不 仅 降 低 了 核 酸 提 取 的 劳 动 强 度, 而 且 减 少 了 核 酸 手 工 提 取 中 容 易 出 现 的 操 作 失 误, 增 加 核 酸 提 取 的 一 致 性 和 重 复 性

87 MagNA Pure LC- 实 现 核 酸 的 全 自 动 提 纯

88 磁 珠 法 核 酸 分 离 纯 化 原 理 Sample Additionof LysisBuffer Additionof ProteinaseK Additionof Magnetic Magnetic Separation GlassParticles Washing Magnetic Separation Elution

89 MagNA Pure LC 内 部 工 作 平 面 图 前 处 理 单 元 处 理 单 元 洗 脱 和 后 洗 脱 单 元

90 ABI 6100 ABI 分 钟 内 提 取 96 个 样 品 中 的 RNA 发 现 新 病 源 体 / 已 知 病 原 体 分 型

91 DNA RNA 的 浓 度 和 纯 度 测 定 及 保 存 1 紫 外 分 光 光 度 法 此 法 准 确 快 速, 且 不 损 坏 样 品 可 测 出 浓 度 低 于 2.5ug/ml 的 核 酸 测 定 时 将 样 品 作 适 度 的 稀 释 用 紫 外 分 光 光 度 仪 检 测, 记 录 280nm 和 260nm 处 的 吸 光 度 280nm 为 蛋 白 吸 收 峰,260nm 为 核 酸 吸 收 峰 其 中 260nm 处 读 数 用 来 计 算 样 品 的 核 酸 浓 度

92 1 0D/A260nm=50ug/ml 双 链 DNA 1 0D/A260nm=33ug/ml 单 链 DNA 1 0D/A260nm=40ug/ml RNA DNA 总 产 量 (ug)= OD (A260nm) 50ug 稀 释 倍 数 样 品 总 体 积 DNA 浓 度 (ug/ml)= OD 值 (A260nm) 50 稀 释 倍 数 提 取 RNA 总 产 量 (ug)= OD 值 (A260nm) 40ug 稀 释 倍 数 样 品 总 体 积 RNA 浓 度 (ug/ml)= OD 值 (A260nm) 40 稀 释 倍 数

93 2 琼 脂 糖 凝 胶 微 型 电 泳 法 未 知 浓 度 的 微 量 DNA 片 段 可 与 已 知 浓 度 的 DNA 同 时 电 泳, 根 据 其 结 合 的 溴 乙 锭 荧 光 强 度 其 含 量 电 泳 时 各 DNA 的 体 积 要 准, 否 则 会 有 误 差

94 3 纯 度 检 查 天 然 DNA 的 吸 光 度 比 值 为 A260nm:A230nm A230nm: A280nm=1.0:0.450:0.515 纯 DNA 液 的 A260:A280: 应 为 如 比 值 低 于 1.6 时, 这 提 示 有 蛋 白 质 和 酚 的 污 染, 应 进 一 步 纯 化

95 4 RNA 完 整 性 检 查 常 用 变 性 的 琼 脂 糖 电 泳 法 检 查, 常 用 的 变 性 剂 为 甲 醛 乙 二 醛 和 羟 甲 基 汞 完 整 的 RNA 经 变 性 电 泳 后 能 分 离 出 核 糖 体 RNA 中 的 28S 和 18S, 且 EB 的 显 色 强 度 应 为 2:1 左 右 如 28S 带 降 低 而 18S 带 增 加 则 表 示 RNA 标 本 有 所 降 解

96 5 DNA RNA 的 保 存 4 是 DNA 保 存 的 最 佳 和 最 简 单 的 条 件 之 一 -70 可 能 是 长 期 保 存 的 良 好 温 度 但 解 冻 时 DNA 可 产 生 缺 口, 因 此 不 宜 反 复 冻 融 DNA 在 TE 缓 冲 液 中 (10mmol/L Tris-Hcl,1mmol/L EDTA,PH 8.0), 4 储 存 6 个 月 以 上, 其 中 EDTA 还 可 抑 制 微 生 物 生 长 RNA 容 易 降 解, 操 作 和 储 存 中 要 防 止 RNA 酶 的 污 染 所 用 器 皿 高 压 灭 菌 后 用, 重 蒸 水 配 制 或 用 焦 碳 酸 二 乙 酯 (DEPC) 处 理 过 的 蒸 馏 水 溶 解 RNA,RNA 溶 液 中 加 入 RNA 酶 抑 制 剂 (RNasin), 终 浓 度 为 2U/10μl, 置 -20 保 存 备 用

97 ( 方 ) 法 方 法 学 的 有 效 性 依 据 SOP 的 合 理 性 生 搬 硬 套 分 区 操 作 的 协 调 性 流 程 合 理 质 控 点 的 安 排 提 取 效 率 扩 增 效 率 基 线 的 调 整 CT 值 本 底 荧 光 值

98 一 技 术 背 景 基 因 诊 断 技 术 的 发 展 : 核 酸 分 子 杂 交 (Southern Nouthern) ( 检 测 10 3 ~10 4 拷 贝 靶 分 子 ) 靶 序 列 扩 增 探 针 扩 增 信 号 放 大 PCR Qβ 复 制 酶 系 统 b-dna TMA 3SR ( 可 检 测 1~10 拷 贝 靶 分 子 ) LCR

99

100

101 NASBA

102 一 技 术 背 景 聚 合 酶 链 式 反 应 :Polymerase Chain Reaction 简 称 PCR,1985 年 由 美 国 Centus 公 司 人 类 遗 传 室 的 科 学 家 Kary Mullis 创 立 (1993 年 获 诺 贝 尔 化 学 奖 ) 特 点 : 灵 敏 度 高 简 便 快 速 \ 应 用 广 泛 错 配 \ 假 阳 性 \ 假 阴 性

103 一 技 术 背 景 PCR 产 物 分 析 方 法 方 法 原 理 定 量 时 间 费 用 凝 胶 电 泳 辨 别 电 泳 条 带 否 6-8h $5 杂 交 印 迹 \ 斑 点 \ 原 位 否 8-24h $5-10 ELADA AMPLICOR(COBAS) 否 / 半 4h $35 RFLP 限 制 酶 切 多 态 分 析 否 8-10h $5 SSCP 单 链 配 对 多 态 分 析 否 2 天 $4 序 列 分 析 核 苷 酸 排 列 分 析 部 分 1-2 天 $10 HDP 异 构 双 倍 体 分 析 否 8-12h $5 CFLP 裂 解 片 段 多 态 分 析 否 1 天 $20 NIRCA 非 同 位 素 RNA 酶 裂 解 分 析 否 1 天 $50 LiPA 线 形 产 物 分 析 部 分 8h $80 实 时 分 析 荧 光 定 量 是 0.5-1h $15

104

105 一 技 术 背 景 实 时 检 测 PCR(Real-Time PCR) TaqMan 技 术 : 合 成 一 段 在 5 端 和 3 端 分 别 带 有 荧 光 报 告 基 团 (R) 和 淬 灭 基 团 (Q) 的 特 异 性 探 针, 当 PCR 扩 增 时, 探 针 与 模 板 序 列 杂 交 ; 而 当 上 游 引 物 延 伸 至 探 针 结 合 位 置 时, 探 针 被 具 有 5 外 切 酶 活 性 的 Taq 酶 解 离, R 和 Q 基 团 分 离, 能 量 转 移 关 系 不 复 存 在,R 基 团 发 出 荧 光 荧 光 强 度 随 PCR 扩 增 过 程 而 动 态 性 增 加

106

107 核 酸 检 测 要 点 灵 敏 度,<50copy/ml 特 异 性 分 型 突 变 定 量 的 一 致 性

108 定 量 PCR 技 术

109 标 准 品 (Panel) SDA: 参 照 WHO HBV Standard 英 国 NIBSC (97/746) Adw 10 6 IU/ml 等 于 拷 贝 / 毫 升 Panel No: L0 L1 L2 L3 L4 L5 CNCCL: HBV DNA1 Panel No: 1,2,3,4,5 国 家 标 准 局 基 质 问 题 : 基 质 (Matrix) 真 实 血 样 : 样 品 纯 度 和 抑 制 剂

110 PCR 定 量 方 法 的 比 较 实 时 法 Taqman 终 点 法 Taqman 终 点 酶 标 或 芯 片 法 7000,96 孔, 四 波 长 I-cycler,96 孔, 四 波 长 Light-cycler,32 孔, 三 波 长 外 标 法 cut off 值 104/ml 用 于 定 量 的 必 要 条 件 : 1. 样 品 纯 度 高 2. CT 值 必 须 小 于 定 量 试 剂 的 生 产 文 号 内 标 法 COBAS-Taqman,4 24 孔, 四 波 长 cut off 值 50/ml 用 于 定 量 的 必 要 条 件 : 1. 终 点 循 环 数 必 须 小 于 定 量 试 剂 的 生 产 文 号 FX-990,FS-1000,FT-2000, DA 620 等 cut off 值 105/ml 用 于 定 量 的 必 要 件 : 1. 样 品 纯 度 高 2. 终 点 循 环 数 必 须 小 于 定 量 试 剂 的 生 产 文 号 酶 标 仪,96 孔, 手 动 检 测 Caliper 1000,12 孔, 自 动 检 测 Caliper AMS-90SE, 96 孔, 自 动 加 样, 自 动 检 测 COBAS-Amplicor,24 孔, 自 动 扩 增, 自 动 检 测 cut off 值 102/ml 用 于 定 量 必 要 条 件 : 1. 终 点 循 环 数 必 须 小 于 定 量 试 剂 的 生 产 文 号

111 ( 检 ) 测 室 内 质 控 的 SOP: 耗 品 质 检 试 剂 质 检 质 控 方 法 ( 纠 错 措 施 ) 质 控 图 室 间 质 评 的 SOP: 纠 偏 措 施

112 PCR 检 测 流 程 标 本 采 集 核 酸 提 取 基 因 扩 增 产 物 检 测 采 集 的 方 法 核 酸 的 稳 定 性 保 存 分 离 方 法 * 效 率 保 存 效 率 检 测 方 法 * 测 定 的 线 性 *

113 室 内 质 控 质 控 目 的 : 假 阴 性 假 阳 性, 准 确 性 精 密 度 质 控 点 : 样 本 质 量 模 板 提 取 扩 增 效 率 质 控 物 安 排 : 空 白 阴 对 弱 阳 对 标 准 品 控 制 范 围 : 空 白 阴 对 阴 性 弱 阳 对 阳 性 ( 上 下 一 次 方 ) 标 准 品 r 值 ( 二 个 9) 斜 率 ( ) 截 距 (-40 左 右 ) 点 间 CT 值 (3.3 左 右 )

114 如 何 确 定 CT 值 阈 值 (Threshold) 的 作 用 CT 标 准 偏 差 阈 值 高 度 阈 值 阈 值 = 基 线 信 号 的 标 准 偏 差 10

115 如 何 确 定 阈 值 基 线 的 作 用 (Baseline cycles ) 消 除 检 测 中 背 景 荧 光 信 号 的 影 响, 确 定 阈 值 基 线 的 范 围 : 仪 器 一 般 默 认 的 范 围 PE-5700 PE icycle 2-10 LightCycle 3-12 基 线 需 根 据 实 验 结 果 进 行 适 当 调 整 : 延 长 基 线 以 包 括 最 高 浓 度 样 本 扩 增 曲 线 起 跳 前 尽 可 能 多 的 循 环, 可 以 使 扩 增 曲 线 更 平 滑 数 据 也 得 到 一 定 改 善

116

117 荧 光 阈 值 线 的 调 整 阈 值 线 需 根 据 实 验 结 果 进 行 适 当 调 整 1 落 在 阴 性 对 照 线 最 高 点 上 方 2 外 标 准 扩 增 曲 线 的 均 一 位 置 ( 点 间 CT3.3 左 右 ) 3 尽 量 接 近 扩 增 曲 线 刚 真 正 进 入 指 数 扩 增 期 的 位 置 ( 避 免 弱 阳 性 漏 检 以 及 一 些 扩 增 反 应 影 响 因 素 在 指 数 期 的 放 大 )

118 1.0E E+9 1.0E+8 1.0E+7 1.0E+6 1.0E+5 1.0E+4 1.0E+3 1.0E+2 1.0E+1 H 2 O 9.522E E E E E E E E E E+1 H 2 O

119 Baseline cycles 2 Through 14 Threshold Position 20.8

120

121 标 准 曲 线 通 过 基 线 和 荧 光 域 值 线 的 调 整 应 达 到 : 相 关 系 数 ( r 值 ) 0.99 斜 率 截 距 -40±4 ( 这 些 参 数 根 据 仪 器 和 试 剂 有 所 不 同 )

122 室 内 质 控 由 实 验 室 工 作 人 员 采 用 一 系 列 统 计 学 的 方 法 连 续 地 评 价 检 测 工 作 的 可 靠 程 度, 判 断 检 验 报 告 是 否 可 以 发 出 的 过 程 目 的 是 控 制 本 实 验 室 测 定 工 作 的 精 密 度, 监 测 其 准 确 度 的 改 变, 提 高 常 规 检 验 工 作 的 批 间 批 内 标 本 检 测 结 果 的 一 致 性

123 质 控 血 清 人 血 清 基 质, 分 布 均 匀 ; 无 传 染 性 ; 添 加 剂 和 调 制 物 的 数 量 少 ; 瓶 间 变 异 小 ; 冻 干 品 其 复 溶 后 稳 定 ; 到 实 验 室 后 的 有 效 期 应 在 1 年 以 上 液 体 血 清 较 优 不 用 定 值 血 清, 而 推 荐 用 价 廉 的 未 定 值 血 清

124 质 控 血 清 质 控 品 的 复 溶 : 溶 剂 质 量 溶 剂 量 准 确 每 次 一 致 复 溶 过 程 严 格 按 要 求 进 行

125 即 刻 性 质 控 : 在 开 始 进 行 质 控 时, 只 需 要 有 3 个 质 控 血 清 测 定 值 即 可 进 行 质 控 当 这 组 数 据 扩 大 到 20 次 有 效 值 时 就 可 以 计 算 RCV 的 X,s 方 法 : (1) 先 将 测 定 值 从 小 到 大 排 列,X 1 最 小,X n 最 大 ; (2) 计 算 X 和 s; (3) 计 算 SI 上 限 值 和 下 限 值 SI 上 =(X 最 小 -X)/S, SI 下 =(X 最 大 -X)/S 对 照 SI 表, 检 查 是 否 出 控, SI 上 下 限 规 定 值, 在 控 ; SI 上 或 下 限 > 规 定 值, 失 控

126 SI 值 表 ( 即 刻 性 质 控 ) N N(3s) N (2s)

127 统 计 步 骤 设 定 靶 值 自 行 确 定 靶 值 ( 无 论 定 值 非 定 值 质 控 血 清 ) 暂 定 靶 值 首 月 : 20 或 更 多 独 立 批 至 少 20 个 测 定 结 果 的 均 值 第 1- 第 5 个 月 : 以 逐 月 累 积 常 用 靶 值 最 初 20 个 数 据 和 五 个 月 在 控 数 据 的 累 积 均 值

128 靶 值 设 定 实 验 室 应 对 新 批 号 的 质 控 品 的 各 个 测 定 项 目 自 行 确 定 靶 值, 靶 值 必 须 在 实 验 室 内 使 用 自 己 现 行 的 测 定 方 法 进 行 确 定 定 值 质 控 品 的 标 定 值 只 能 作 为 确 定 靶 值 的 参 考

129 设 定 控 制 限 对 新 批 号 的 质 控 品 应 确 定 控 制 限, 控 制 限 通 常 是 以 多 少 个 标 准 差 表 示, 即 以 标 准 差 的 倍 数 表 示 不 同 项 目 ( 定 量 测 定 ) 的 控 制 限 的 确 定 要 根 据 其 采 用 的 控 制 规 则 来 决 定 暂 定 标 准 差 和 常 用 标 准 差 的 设 定 方 法 同 暂 定 靶 值 和 常 用 靶 值 的 设 定

130 批 RUN 的 概 念 CLIA 88, (b) 定 义 : 测 试 系 统 的 准 确 性 精 密 度 保 持 稳 定 的 一 个 间 隔, 不 超 过 24 小 时 临 床 化 学 临 床 血 液 学 的 每 天 点 图 应 为 每 批 点 图, 有 失 控 点 后 重 测 的 数 据 为 另 一 批 的 质 控 点 临 床 免 疫 学 的 批 为 一 块 板 或 一 批 条 件 不 变 的 标 本, 以 此 为 质 控 点 点 图

131 质 控 图 Levey-Jennings 质 量 控 制 图 时 间 :1998 年 9 月 项 目 :TP 单 位 :g/l 浓 度 水 平 : 正 常 (Precinorm) 仪 器 : 日 立 7170A 方 法 : 双 缩 脲 法 血 清 来 源 :BM(194739) 靶 值 :56.4 SD:1.4

132 常 用 的 质 控 规 则 1 2s ; 一 个 质 控 结 果 超 过 X±2S, 此 为 警 告 规 则 ; 1 2.5s ; 一 个 质 控 结 果 超 过 X±2.5S, 提 示 存 在 随 机 误 差 ; 1 3s ; 一 个 质 控 结 果 超 过 X±3S, 提 示 存 在 随 机 误 差 ; R 4s ; 同 批 两 个 结 果 之 差 超 过 4S, 即 一 个 质 控 结 果 超 过 X+2S, 另 一 个 结 果 超 X-2S 提 示 存 在 随 机 差 ; 2 2s ; 两 个 连 续 质 控 结 果 同 时 超 过 X+2S 或 X-2S, 提 示 存 在 系 统 误 差 ; 4 1s ; 一 个 质 控 品 连 续 的 四 次 测 定 结 果 都 超 过 X+1S 或 X-1S, 两 个 质 控 品 连 续 两 次 测 定 都 超 过 X+1S X-1S, 提 示 存 在 系 统 误 差 ; 7 T ; 七 个 连 续 的 质 控 结 果 呈 现 出 向 上 或 向 下 的 趋 势, 提 示 存 在 系 统 误 差 ; 10 x ; 十 个 连 续 的 质 控 结 果 在 平 均 数 的 一 侧, 提 示 存 在 系 统 误 差

133 失 控 情 况 处 理 及 原 因 分 析 填 写 失 控 报 告 单 上 报 实 验 室 负 责 人, 由 负 责 人 作 出 是 否 发 报 告 的 决 定 分 析 失 控 原 因 完 成 失 控 报 告 单 重 做 同 一 质 控 物 ( 人 为 差 错 偶 然 误 差 ) 新 开 一 瓶 质 控 物 ( 质 控 物 使 用 保 管 ) 新 开 另 一 批 号 质 控 物 ( 质 控 物 使 用 保 管 ) 重 新 校 准 ( 校 准 错 误 ) 进 行 仪 器 维 护, 更 换 试 剂 ( 仪 器 试 剂 ) 请 专 家 帮 助

134 室 内 质 控 数 据 管 理 每 月 室 内 质 控 数 据 的 保 存 原 始 质 控 数 据 质 控 数 据 的 质 控 图 所 有 计 算 的 数 据 ( 均 值 标 准 差 变 异 系 数 偏 差 及 累 积 的 均 值 标 准 差 变 异 系 数 ) 失 控 报 告 单

135 室 内 质 控 数 据 管 理 室 内 质 控 数 据 的 周 期 性 评 价 室 内 质 控 数 据 (x, s, CV, Bias) 变 化 显 著? 修 改 质 控 图 的 x s 继 续 使 用 原 质 控 图

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138 室 间 质 评 利 用 实 验 室 间 比 对 了 解 实 验 室 的 检 测 能 力 作 用 : 评 价 实 验 室 是 否 有 能 力 从 事 其 检 验 工 作 识 别 实 验 室 的 准 确 度 提 高 实 验 室 间 检 测 结 果 的 可 比 性 确 定 新 的 检 测 方 法 的 有 效 性 增 加 临 床 医 生 患 者 和 政 府 有 关 部 门 的 信 任

139 组 织 者 工 作 质 控 物 组 织 发 放 : 尽 可 能 与 人 源 一 致 无 瓶 间 差 无 干 扰 因 子, 发 放 过 程 不 致 变 质 基 质 效 应 有 些 仪 器 / 方 法 结 合 的 性 能 会 受 到 PT 样 本 基 质 的 影 响 当 实 验 室 使 用 该 仪 器 / 方 法 时, 而 以 所 有 方 法 的 平 均 值 或 决 定 性 / 参 考 方 法 平 均 值 进 行 评 价 时, 这 就 可 能 导 致 不 满 意 的 结 果 非 均 匀 性 试 验 物 ( 装 液 的 变 异 性, 不 恰 当 的 混 匀, 或 冻 干 品 不 一 致 的 加 热 ) 细 菌 污 染 或 溶 血 ( 免 疫 血 液 学 血 液 学 ) 特 定 的 微 生 物 学 : 非 活 的 样 本, 样 本 没 有 代 表 性 ( 如 : 寄 生 虫 学 的 粪 便 样 本 ) 特 定 的 免 疫 血 液 学 :-- 反 应 性 抗 体 可 检 出, 但 不 能 识 别 假 阳 性, 异 体 抗 体 的 干 扰

140 组 织 者 工 作 靶 值 ( 赋 值 ): 靶 值 一 词 被 改 为 更 通 用 的 词 赋 值, 其 定 义 为 具 有 特 定 量 值, 对 于 给 定 的 目 的 具 有 适 当 的 不 确 定 度 定 量 试 验, 指 的 是 排 除 异 常 值 后 ( 排 除 平 均 数 加 减 三 倍 标 准 差 ) 所 有 参 加 结 果 的 平 均 数 或 用 决 定 性 或 参 考 方 法 建 立 的 参 考 值 定 性 试 验, 指 由 参 考 实 验 室 采 用 可 接 受 的 决 定 性 或 参 考 方 法 建 立 的 预 期 结 果 有 三 种 不 同 的 靶 值 类 型 : 方 法 组 (Peer Group) 平 均 值 其 它 组 平 均 值 或 所 有 结 果 的 平 均 值 外 部 来 源 导 出 的 值 ( 例 如, 参 考 实 验 室 公 认 值 或 决 定 性 / 参 考 方 法 )

141 组 织 者 工 作 统 计 评 价 : 各 单 位 的 测 定 结 果 如 落 在 规 定 的 可 接 受 范 围 内 为 可 接 受 结 果, 否 则 为 不 可 接 受 结 果 全 部 项 目 总 的 测 定 样 本 数 有 四 种 类 型 的 评 价 区 间 : 固 定 区 间 ( 例 如 : 靶 值 ±4mmol/L) 固 定 百 分 数 ( 例 如 : 靶 值 ±10%) 以 上 两 者 的 结 合 ( 例 如 : 靶 值 ±6mg/dL 或 ±10%, 取 较 大 的 值 ) 基 于 组 标 准 差 (SD)( 例 如 :±2SD) 合 格 标 准 : 单 项 目 得 分 大 于 80% 全 部 项 目 总 得 分 大 于 80%

142 实 验 室 工 作 文 件 准 备 : 制 定 书 面 的 程 序 可 最 大 限 度 地 降 低 技 术 或 书 写 误 差 的 可 能 性 PT 标 本 的 处 理 和 制 备 样 本 递 送 到 适 当 的 分 析 区 域 样 本 的 复 溶 ( 包 括 在 检 测 前 允 许 最 低 的 时 间 间 隔 ) 样 本 的 分 析, 报 告 格 式 上 结 果 的 记 录, 包 括 书 写 准 确 的 验 证, 评 价 回 报 的 分 析 等 为 了 使 实 验 室 从 PT 数 据 中 能 获 得 最 大 量 的 信 息,PT 标 本 应 与 病 人 标 本 一 样 的 方 式 进 行 检 测 重 要 的 是 实 验 室 应 保 留 发 送 给 PT 提 供 者 所 有 文 件 的 复 印 件

143 实 验 室 工 作 汇 报 审 核 : 所 有 的 文 件 ( 包 括 仪 器 打 印 结 果, 工 作 单 和 以 电 子 形 式 储 存 的 有 关 数 据 ) 处 理 或 测 试 标 本 以 及 抄 写 结 果 的 人 员 之 间 应 互 相 审 核 调 查 应 包 括 : 书 写 误 差 的 检 查 室 内 质 控 记 录, 校 准 状 况 及 仪 器 功 能 检 查 的 审 核 当 可 能 时, 重 新 分 析 和 计 算 如 果 没 有 保 留 原 样 本, 实 验 室 应 从 PT 提 供 者 申 请 额 外 的 等 份 物, 如 果 PT 提 供 者 有 此 物 品 提 供 时 评 价 该 分 析 物 实 验 室 的 历 史 性 能

144 实 验 室 工 作 理 解 PT 结 果 报 告 : 对 于 特 定 的 PT 样 本 ( 一 般 为 五 个 标 本 ), 评 价 性 能 的 最 简 单 方 式 绘 制 回 报 的 PT 结 果 与 靶 值 的 差 值 为 Y 轴, 靶 值 为 X 轴 的 图 形 血 糖 能 力 比 对 检 验 回 报 结 果 与 靶 值 的 差 值 差 值 靶 值 差 值 上 限 下 限

145 报 告 发 放 范 围 : 门 诊 病 区 外 单 位 发 放 方 式 : 保 密 电 子 邮 件 报 告 单 的 格 式 : 唯 一 编 号 检 测 下 限 实 验 室 申 明 审 核 : 标 准 不 合 格 报 告 的 处 理

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147 Tab-43 实 验 流 程 图 ( 附 表 ) 架 盘 序 号 样 本 号 样 本 唯 一 标 识 1 样 本 1 2 样 本 2 3 样 本 3 4 样 本 4 5 样 本 5 6 样 本 6 7 样 本 7 8 样 本 8 9 样 本 9 10 样 本 样 本 样 本 样 本 样 本 样 本 样 本 样 本 样 本 样 本 样 本 样 本 样 本 样 本 样 本 自 制 质 控 品 26 临 界 阳 性 对 照 27 阴 性 对 照 28 试 剂 空 白 对 照 29 阳 性 参 控 品 1 30 阳 性 参 控 品 2 31 阳 性 参 控 品 3

148 抱 怨 实 验 室 服 务 质 量 改 进 的 依 据 对 象 : 病 人 医 生 工 作 人 员 方 式 职 责 反 馈 记 录

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150 谢 谢! 祝 : 顺 利 通 过 技 术 验 收!

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