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近贲
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1 中国农学通报 2014,30(5):23-27 Chinese Agricultural Science Bulletin 大肠杆菌生物膜的筛选及生长曲线测定喻华英, 李启峰 ( 塔里木大学动物科学学院, 新疆阿拉尔 ) 摘要 : 为探究犊牛腹泻病中大肠杆菌生物膜的形成过程本试验利用 96 孔微量板法, 对分离鉴别的犊牛腹泻粪便中的 60 株大肠杆菌进行生物膜的筛选和统计结果表明 : 得到了 9 株生物膜阳性大肠杆菌, 并测定出大肠杆菌生物膜阳性菌的生长曲线从而确定大肠杆菌生物膜形成的四个时期 : 初粘附粘附生物膜的成熟脱落等过程且不同大肠杆菌生物膜形成时间不尽相同为临床上治疗犊牛腹泻病提供了新的理论依据关键词 : 大肠杆菌 ; 生物膜 ; 筛选 ; 生长曲线中图分类号 :R Q735 文献标志码 :A 论文编号 : Screening Biofilm and Determination Growth Biofilm of Curve in Escherichia coli Yu Huaying, Li Qifeng (College Of Animal Science Tarim University, Alar Xinjiang ) Abstract: The biofilm explored the formation process of E. coli in the calf diarrhea. The experiment used the 96-well micro plate method screened and counted biofilm in 60 strains in E. coli from calf diarrhea fecal which were separated and identified in laboratory. The results showed that get nine positive biofilms in E. coli and determined the positive biofilm growth curve in E. coli. The test concluded and known the biofilm formation period contained four stages: initial adhesion, adhesion, mature biofilm and shedding processes, and then in different biofilm formation process varied in E. coli. The experiment was aimed of providing a new theoretical basis for the treatment against calves diarrhea in clinical. Key words: Escherichia coli; biofilm; screening; growth curve 0 引言细菌生物膜 (Biofilm,BF) 是相对于单个分散的浮游状态的细菌 (Planktonic Cells) 生存形式而言的一种独特的细菌生存形式生物被膜是细菌生长的一种保护模式, 保证细菌在恶劣环境下可以生存 [1] [2] 对于生物膜的研究,2002 年,Donlan 等认为 : 生物被膜是一种不可逆的粘附于非生物或生物表面的微生物细胞菌落, 包裹于细胞外多聚物基质 (Extracellular Polymeric Substances,EPS) 中 ( 主要是多聚糖 ), 生物膜中存在蛋白质多糖 DNA RNA 肽聚糖脂和磷脂等物质 [3] 生物膜是细菌在恶劣环境中的一种生长方式, 环境中的营养成分温度渗透压 ph 铁离子浓度氧化还原电位变化等对生物膜的形成具有重要作用 [4] 生物膜可由纯菌种形成, 也可以由多菌种组成 [5] 生物膜系统存在着通道系统, 保证养料酶代谢产物和排泄物运输畅通 [6] [7] 年,Costerton 等研究牙菌斑, 提出生物被膜的理论, 解释了微生物为何附着于有生命或无生命的物体表面及受益于这种小生境的机制他认为 : 生物被膜包括单个细胞和微生物菌落, 镶嵌在一种高度水合化, 主要携带负电荷的多聚物基质粘附于表面界面及相互之间, 在多孔基质孔隙中隐藏的细菌生物膜的感染性疾病大都是慢性和难治性的, 生物膜内的细菌几乎对所有的抗生素都不敏感, 表现出极强的耐药性 [7] 基金项目 : 国家自然基金新疆地区犊牛腹泻病中大肠杆菌基因型分型及 bfpa 基因生物学功能探讨 ( ) 第一作者简介 : 喻华英, 女,1967 年出生, 新疆人, 硕士, 教授, 现从事家畜病理学教学研究工作, 研究方向为细菌和细菌毒素的致病机制通信地址 : 新疆塔里木大学动科院,Tel: , aksyhy@126.com 收稿日期 : , 修回日期 :

个时期 : 初粘附粘附生物膜的成熟脱落等过程且不同大肠杆菌生物膜形成时间不尽相同为临床上治疗犊牛腹泻病提供了新的理论依据关键词 : 大肠杆菌 ; 生物膜 ; 筛选 ; 生长曲线中图分类号 :R3782+2 Q735 文献标志码 :A 论文编

2 24 中国农学通报生物膜的形成后, 细菌个体表现不同致病性特性, 某些细菌个体对宿主无危害, 有些细菌则可能对宿主有致命威胁生物膜中特有的物质如胞外多聚物和群体 [8-9] 感应信号因子都可能是使其抗性增强的原因大约 [10-12] 65% 的人类细菌性感染是细菌由生物膜引起的生 [13-14] 物膜形成后可引起机体严重的反复感染能形成生物膜的细菌有金黄色葡萄球菌副伤寒沙门氏菌铜绿假单胞菌枯草杆菌沙门杆菌志贺氏菌变形杆菌绿脓杆菌炭疽杆菌蜡样芽胞杆菌葡萄球菌等大肠杆菌形成生物膜与自身的结构如粘附因子毒力因子细胞坏死因子和铁载体等有关, 还与 [14-15] 细菌所生存的环境有关大肠杆菌能在口腔尿道生殖道肠道等器官表面形成生物膜, 导致疾病出 [16-17] 现反复感染在新疆地区, 养牛业出现快速迅猛发展并成为农牧民增收的主要手段之一犊牛腹泻病的危害在养牛业中危害越来越严重, 同时致犊牛腹泻病的大肠杆菌普遍存在对抗生素有较强的耐药性反复性感染不易根治和致病力强等特点本试验用的 96 孔微量板法, 对致犊牛腹泻病的大肠杆菌进行生物膜的筛选和分析, 并探究其生物膜的形成过程, 为临床上犊牛腹泻病的治疗提供新的思路 1 试验材料 1.1 试验材料试验病料是于 2012 年 10 月采自十团奶牛场中发生腹泻的犊牛粪便, 经试验室分离鉴定的 60 株大肠杆菌 1.2 试验所用培养基麦康凯琼脂培养基 LB 液体培养基 M9 培养基 1.3 试验试剂 1%PBS 缓冲溶液 1% 结晶紫 (Crystal Violet) 液, 33 % 冰乙酸, 甲醇 1.4 试验设备与仪器紫外线可见分光光度计 CODES 54; 全波长酶标仪 Power Wave XS 美国产 ; 进口 U 型 96 孔板 (3599) 购自 Corning Costar 产品 2 试验方法 2.1 大肠杆菌生物膜筛选 -96 孔微量板法细菌的活化和分离纯化 (1) 从 -70 冰箱中取出甘油保存的菌株, 待菌液在冰浴下溶解后, 取 100 μl 菌液接种于新鲜灭菌的 5 ml LB 液体培养基中, 置于 37 恒温摇箱中过夜培养 ;(2) 将菌液接种于麦康凯培养基中置于 37 恒温培养箱内培养 24 h;(3) 从麦康凯培养基中挑取红色单菌落, 接种到新鲜灭菌的 5 ml LB 液体培养基中, 于 37 恒温摇箱中摇 16 h;(4) 按 1:100 倍稀释 : 取培养的菌液 50 μl 于新鲜灭菌的 5 ml LB 试管液体培养基中, 于 37 恒温摇箱中摇 4.5 h, 保证细菌处于对数生长期菌液 OD 600nm 的测量及稀释 (1) 将紫外可见分光光度计预热半小时 ;(2) 取 2 ml 菌液于干净比色皿中, 同时取 2 ml LB 液体培养基作为空白对照 ;(3) 调整当前波长为 600 nm, 初始波长为 200 nm;(4) 测菌液 OD 600nm 值, 记录数据 ;(5) 用灭菌的 1 M9 液体培养基将所测 OD 600nm 值稀释至装板和培养取 200 μl 稀释至 0.01 的菌液加入 96 孔 U 型平底板中, 每个菌液接 2 列 6 孔, 用 1 M9 液体培养基 200 μl 接剩余 2 孔作为空白对照将板置于 37 恒温箱中培养 36~48 h 洗板 (1) 将培养好的 96 孔 U 型平底板从恒温箱中取出, 弃菌液 ; 用 1%PBS 缓冲液洗 96 孔 U 型平底板, 重复 3 次, 弃洗液, 拍干 ; 将甲醇放入 96 孔 U 型平底板中固定 15 min, 倒出并晾干 ; 将 1% 结晶紫溶液加入 96 孔 U 型平底板中, 水平晃动, 使生物膜染色均匀, 染色 (2) 将培养好的 96 孔 U 型平底板从恒温箱中取出, 弃菌液 ; 用 1%PBS 缓冲液洗 96 孔 U 型平底板, 重复 3 次, 弃洗液, 拍干 ; 将甲醇放入 96 孔 U 型平底板中固定 15 min, 倒出并晾干 ; 将 1% 结晶紫溶液加入 96 孔 U 型平底板中, 水平晃动, 使生物膜染色均匀, 染色溶解和测 OD 600nm 的值将 33% 的冰醋酸加于 96 孔 U 型平底板中, 待细菌生物膜完全溶解后, 用全波长酶标仪测定 OD 600nm 对试验所得数据进行处理, 基于临界值 ODc, 菌株生物膜可以分为 :OD ODc 为不粘附 (-);ODc<OD 2ODc 为弱粘附 (+ );2ODc< OD 3ODc 为中等粘附 (++ );OD>3ODc 强粘附 (+++) 2.2 大肠杆菌生物膜的生长曲线检测 -96 孔微量板法菌体的培养 (1) 从麦康凯培养基中挑出 9 株阳性大肠杆菌, 用接种环挑取红色单菌落, 接种到新鲜灭菌的 5 ml LB 液体培养基中, 于 37 恒温摇箱中摇 16 h (2) 按 1:100 倍稀释 : 取培养的菌液 50 μl 于新鲜灭菌的 5 ml LB 试管液体培养基中, 于 37 恒温摇箱中摇 4.5 h, 保证细菌处于对数生长期菌液 OD 600nm 的测量及稀释

类细菌性感染是细菌由生物膜引起的生 [13-14] 物膜形成后可引起机体严重的反复感染能形成生物膜的细菌有金黄色葡萄球菌副伤寒沙门氏菌铜绿假单胞菌枯草杆菌沙门杆菌志贺氏菌变形杆菌绿脓杆菌炭疽杆菌蜡样芽胞杆菌葡萄

3 喻华英等 : 大肠杆菌生物膜的筛选及生长曲线测定 25 (1) 将紫外可见分光光度计预热半小时 ;(2) 取 2 ml 菌液于干净比色皿中, 同时取 2 ml LB 液体培养基作为空白对照 ;(3) 调整当前波长为 600 nm, 初始波长为 200 nm;(4) 测菌液 OD 600nm 值, 记录数据 ;(5) 用灭菌的 1 M9 液体培养基将所测 OD 600nm 值稀释至装板和培养取 200 μl 稀释至 0.01 的菌液加入 96 孔 U 型板中, 每个菌液接 2 列 6 孔, 并用 1 M9 液体培养基 200 μl 接剩余的 2 孔, 作为空白对照将接 8 株弱阳性菌的 96 孔 U 型板置于 37 培养, 分别在 h 取板将接 1 株强阳性菌 96 孔 U 型板置于 37 培养, 分别在 h 取板洗板 (1) 将不同培养时间的 96 孔 U 型板取出, 弃菌液 ; (2) 用 1%PBS 缓冲液洗 96 孔 U 型平底板, 重复三次, 弃洗液, 拍干 ;(3) 将甲醇放入 96 孔 U 型平底板中固定 15 min, 倒出并晾干 ;(4) 将 1% 结晶紫溶液加入 96 孔 U 型平底板中, 水平晃动, 使生物膜染色均匀, 染色溶解和测 OD 600nm 的值将 33% 的冰醋酸加于 96 孔 U 型平底板中, 待细菌生物膜完全溶解后, 用全波长酶标仪测定 OD 600nm 对试验所得数据按照时间不同进行分析处理并绘制生长曲线 3 结果与分析 3.1 大肠杆菌生物膜筛选结果本次试验利用 96 孔微量板法, 经结晶紫染色, 冲洗晾干后, 在 96 孔 U 型平板底部, 可看到一层均匀淡紫色的薄膜, 初步判断为大肠杆菌形成的生物膜, 并且能够形成厚薄不同的生物膜 ( 见图 1) 从 60 株大肠杆菌进行了生物膜的筛选, 得到 9 株生物膜阳性菌, 阳性率为 15%, 其中 1 株大肠杆菌生物膜呈现出强阳性 3.2 大肠杆菌生物膜粘附性分析结果基于临界值 ODc, 菌株生物膜可以分为 :OD ODc 为不粘附 (-);ODc<OD 2ODc 为弱粘附 (+ ); 2ODc<OD 3ODc 为中等粘附 (++);OD>3ODc 强粘图 1 大肠杆菌形成的生物膜阳性结果表 1 9 株大肠杆菌生物膜粘附性分析结果菌株号测定值临界值附 (+++) 的判断标准进行数据处理 ( 见表 1) 在这 9 株大肠杆菌生物膜阳性菌中,1 株为强粘附性大肠杆菌为 18-3 号, 其余 8 株为中等粘附性大肠杆菌大肠杆菌生物膜的粘附性柱状图分析也可以看出生物膜形成的强弱不同 ( 见图 2) 9 株菌中仅 18-3 号菌为强粘附大肠杆菌,OD>3ODc, 强粘附 (+++), 其余 8 株 2ODc<OD 3ODc, 均为中等粘附大肠杆菌株大肠杆菌生物膜生长曲线图 3 可看出强粘附性大肠杆菌 18-3( 占 11.1%) 生物膜的形成是一个动态的过程, 可分为四个时期 : 初粘附粘附形成成熟的生物膜生物膜脱落, 与铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌禽沙门氏菌等形成周期一致同一株大肠杆菌在这四个过程中也存在时间上的差

01 的菌液加入 96 孔 U 型板中, 每个菌液接 2 列 6 孔, 并用 1 M9 液体培养基 200 μl 接剩余的 2 孔, 作为空白对照将接 8 株弱阳性菌的 96 孔 U 型板置于 37 培养, 分别在 12 24 36 48 60 72 h 取板将接 1 株强阳性菌 96 孔 U 型板置于

4 26 中国农学通报测定值临界值图 2 9 株大肠杆菌生物膜的粘附性分析结果测定值菌株号图 3 大肠杆菌 (18-3) 生物膜生长曲线结果异,18-3 号菌在 37 恒温箱中培养 2 h 后完成初粘附, 4 h 形成了粘附, 在 8 h 形成了成熟的生物膜, 在 8~12 h 这个时间段, 成熟的生物膜开始脱落, 在 12 h 以后, 该大肠杆菌进入下一个生长周期, 随着营养物质的大量消耗, 大量代谢产物聚集, 可导致细菌在形成下一个生长周期生物膜的生长能力比前一个生物膜的能力减弱, 生长曲线峰值出现减弱的现象图 4~5 可看出 : 八株菌均为中等粘附性大肠杆菌 ( 占 88.9%), 其中, 七株菌在 12 h 形成初粘附,36 h 完成粘附,48 h 形成了成熟的生物膜,48~60 h 生物膜脱落,60 h 以后进入下一个生长周期 23-7 菌在 12 h 时形成初粘附,24 h 完成粘附,36 h 形成成熟的生物膜,36~60 h 生物膜脱落,60 h 后进入下一个生长周期 4 结论本次试验成功地利用 96 孔微量板法, 从 60 株大肠杆菌筛选得到 9 株生物膜阳性菌在 9 株生物膜阳性菌中, 生物膜形成的能力表现出强弱之分由大肠杆图 4 4 株中等粘附大肠杆菌生物膜生长曲线结果图 5 4 株中等粘附大肠杆菌生物膜生长曲线结果菌生物膜生长曲线上可以看出 : 大肠杆菌生物膜形成过程也是一个动态的过程, 可分为四个时期 : 初粘附粘附形成成熟的生物膜生物膜脱落与铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌禽沙门氏菌等形成周期一致但在这四个过程中同种大肠杆菌形成成熟的生物膜的时

时间段, 成熟的生物膜开始脱落, 在 12 h 以后, 该大肠杆菌进入下一个生长周期, 随着营养物质的大量消耗, 大量代谢产物聚集, 可导致细菌在形成下一个生长周期生物膜的生长能力比前一个生物膜的能力减弱, 生长曲线峰值出现减弱

5 喻华英等 : 大肠杆菌生物膜的筛选及生长曲线测定 27 间上也存在差异 5 讨论 5.1 新疆地区犊牛腹泻病的临床特点近年来, 在新疆地区, 养牛业出现快速迅猛的发展, 成为农牧民增收的主要手段之一, 但是犊牛腹泻病的危害在养牛业中危害也越来越严重, 同时不同地区的致犊牛腹泻病的大肠杆菌普遍存在对抗生素有较强的耐药性反复性感染不易根治和致病力强等特点 5.2 大肠杆菌生物膜的形成与犊牛腹泻病的关系大肠杆菌能在口腔尿道呼吸道生殖道肠道等管状器官表面形成生物膜, 来对抗不利的环境, 这是细菌所具有的一种非常特殊而重要的适应环境的机制本次试验利用 96 孔微量板法, 从 60 株大肠杆菌进行了生物膜的筛选, 得到 9 株生物膜阳性菌, 阳性率为 15%, 表明 : 在新疆地区致犊牛腹泻病的大肠杆菌普遍存在对抗生素有较强的耐药性反复性感染不易根治和致病力强可能与大肠杆菌生物膜形成有关同时由 9 株大肠杆菌形成生物膜能力强弱不同及生物膜生长曲线时间也不尽相同, 这进一步为临床上大肠杆菌出现反复感染致病力增强对抗生素耐药升高不易根治等提供了一定的理论佐证本试验通过利用 96 孔微量板法和提供一种寡营养的培养基 M9, 模拟肠道内大肠杆菌的生活环境, 对犊牛腹泻病中大肠杆菌阳性菌生物膜生长曲线进行测定分析, 为临床治疗和预防犊牛腹泻病提供了新的思路参考文献 [1] 唐童画, 刘国生, 谢志雄, 等. 细菌生物膜的结构及形成机制研究进展 [J]. 氨基酸和生物资源,2006,28(3): [2] 李学如, 贾文祥. 细菌生物膜的形成及其相关感染与防治 [M]. 中国抗生素杂志,2003,8(1): [3] 陈静, 刘显军, 边连全, 等. 细菌生物膜及细菌群体感应系统的研究进展 [J]. 江苏农业科学,2010(5): [4] Stewart P S. Mechanisms of antibiotic Resistance in bacterial biofilms [J].Intentional Joual of Medical Mich.Biology,2002,292: [5] 王丽英. 生物膜的形成与控制 [J]. 食品工业科技,1998(6): [6] 唐俊妮, 史贤明, 王红宁, 等. 细菌生物膜的形成与调控机制 [M]. 生物学杂志,2009,26(2): [7] Costerton J W, Stewart P S, Green berg E P. Bacteriological: A common cause of persistent infection [J].science,1999,21:284 (5418): [8] 梁宇寰, 刘新. 细菌生物膜耐药机制研究 [J]. 沈阳医学院学报,2007, 9(3): [9] 宋志军, 吴红,Givskov M. 细菌生物膜与抗生素耐药 [J]. 自然科学进展,2003(10): [10] 陈维贤, 张丽萍. 细菌生物被膜的研究进展 [J]. 微生物学杂志,2004 (1): [11] 李京宝, 韩峰, 于文功. 细菌生物膜研究技术 [J]. 微生物学报,2007,47 (3): [12] 丁进亚, 黄前, 曹军皓. 细菌生物膜的防治进展 [J]. 医学综述,2011,17 (3): [13] Yasmeen T, Farhan E, Faisal A. Study on biofilm-forming properties of clinical isolates of Staphylococcus aureus [J].Infect Dev Ctries,2012,5(6): [14] 屈常林, 高洪, 赵宝洪, 等. 细菌生物被膜与抗生素耐药机制研究进展 [J]. 动物医学进展,2008,29(3): [15] Kaplan J B. Biofilm dispersal: mechanisms, clinical implications, and potential therapeutic uses [J].Dent Res,2010,89(3): [16] Cotter J, Casey E. Rapid depletion of dissolved oxygen in 96 well microtiter plate Staphylococcus epidermidis biofilm assays promotes biofilm development and is influenced byinoculum cell concentration[j].biotechnol Bioeng,2009,15(8): [17] Wimpenny J, Manz W, Szewzy U. Heterogeneity in biofilm. FEMS Microbiol Rew[J]. Reproduction,2004,24:

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2月5期aa 中国农学通报 212,28():2-27 Chinese Agricultural cience Bulletin 血清 11 型鸭疫里默氏菌的分离鉴定 1,2 2, 2, 2, 2, 2, 2, 杨晓辉, 程龙飞, 陈红梅, 施少华, 傅光华, 万春和, 黄瑜 ( 1 福建省农业科学院畜牧兽医研究所, 福州