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1 液质联用技术在生物毒素检测中的应用 浙江省疾病预防控制中心任一平 生物毒素检测方法的趋势 前处理简单 低成本 高通量 高灵敏度 高选择性 高效率 提供分子结构信息 什么样的仪器设备才能达到上述要求? 只有质谱! 通用型的选择性检测器 提供分子结构信息, 可以得到确证结果 SIM MRM 都具有高灵敏度 抗干扰能力强 色谱分离已经不是最主要问题 质谱仪的类型和离子化的方式 质谱的类型 :MS MSMS MS n TF Q-TF SECTR FT-ICR-MS 等 离子化方式 :EI NCI PCI APCI ESI APPI( 大气压光质解析电离源 ) MALDI( 基值辅助激光解析离子化 ) 可以与 GC LC IC CE 等联接 用于多残留检测的主要有 GC-MS GC-MSMS GC-MS n LC-MSMS GC(LC)- TF 单四极质谱 DCRF 为一个常量 离子通过改变四极杆的 DCRF 电压而被扫描

2 离子阱质谱 飞行时间质谱 原理与四极杆的非常相似, 离子被存储在 RF 和 DC 场中, 扫描出精确 mz 的离子, 可以做多极质谱, 称为时间串联质谱 所有离子同时启动 小的离子移动速度快 测量已知距离下的速度 ( 飞行时间 ) 磁质谱 SECTR 用质谱检测的目的是什么? 未知化合物 化合物的鉴定与确认 谱图检索 已知化合物 高效 高灵敏度分析 结构确认 定量 离子通过变化的磁场和电场被传输主要用于 Dioxins,PCB,PBB,PBDE 等检测 分子量信息 电子轰击源, 化学源 大气压电喷雾源 7ev 的轰击能量, 硬电离方式, 可以进行谱库检索化学源是在离子源中加入缓冲气, 达到软电离的目的

3 大气压化学电离源 串接四极质谱仪 碰撞诱导解离室 ( 碰撞池 CID) 三级四极杆工作模式 ( 一 ) MS 模式这种模式用于分析未解离的离子质量 扫描 M CID 中没有引入裂解气体,M2 为射频电场模式 也可以使 M 处于射频模式, 扫描 M2 电场实现质量测定 MS 扫描采集 MS Ion Scan MS Scanning Collision Cell MS2 Rf only, pass all masses 在第一个四极杆做选择范围的 Scanning 碰撞室和第二个四极杆设置为让所有的离子都通过到达检测器 三级四极杆工作模式 ( 二 ) 前体离子 ( 母离子 ) 扫描 (precursorparent ion scanning) 此模式是 : 扫描 M 电压,M2 设定为只传输某一特定质荷比离子,CID 为碰撞室 与中性丢失扫描相似, 前体离子扫描检测离子混合物中在 CID 碰撞室丢失特定基团的离子 与中性丢失扫描不同的是前体离子扫描模式直接检测断裂的基因 ( 报告离子, reporter ion) 检测器检测到报告离子时, 已知 M 的电压, 所以可以确定产生这一特定碎片的前体离子的质量 因此前体离子扫描模式可以被用来检测肽混合物中某些含有特定结构特征的肽段

4 母离子扫描 Collision MS Cell MS2 Scanning CID Static Monitor specific fragment ion 三级四极杆工作模式 ( 三 ) MSMS 模式 ( 也称为子离子扫描法,product ion scan) 在一个给定的时间点,M 设定为仅传输某一选定质荷比的离子, 此离子进入 CID 后, 经碰撞诱导解离, 产生的碎片离子通过扫描 M2 进行检测 这样得到与 M 选择的初始离子相关的碎片离子质谱图 M 选择母离子, 在 CID 内进行诱导碰撞,M2 分析碎片离子, 这一分析过程不断循环, 用以选择分析不同质量的离子 实际上, 可以设定程序自动在 MS 和 MSMS 模式间切换, 将 MS 检测到的离子进行 CID 分析, 并记录碎片离子的谱图, 整个过程不需要用户介入这一过程称为数据依赖的 CID(data-deperkdent CID) 子离子扫描 三级四极杆工作模式 ( 四 ) MS CollCell ision MS2 中性丢失扫描模式 (neutral loss scan mode) Static Product Ion Scans to produce MS-MS spectra for confirmation and structural elucidation Scanning 此模式中 Q 和 Q3 的电压同步扫描, 但保持一个特定 mz 值的电压差 (off set) Q2 是碰撞室,Q 和 Q3 的电压差值与 Q2 内碰撞消除的一个特定中性分子的质量一致 因此, 在离子混合物中, 只有碰撞裂解后能丢失这一特定基团的离子才会被 Q3 传输到检测器 中性丢失 三重四极 MSMS MRM 检测方式 ( 五 ) MS Collision Cell MS2 MS Collision Cell MS2 Scanning CID Scanning Static CID Static Neutral LossGain to monitor loss or gain of specific moiety 多离子反应监测 Multiple Reaction Monitoring (MRM) minimises matrix interference high sensitivity accurate and reproducible quantitation

5 例一质谱测定 : Progesterone 孕酮 CH 3 CH 3 CH 3 [M+H] 子离子扫描 MS Product Ion Scan Collision Cell Argon gas MS2 Products Precursor 36. Static (mz 35.) Scanning mz 全扫描 (MZ2-4) 第一个四极杆让固定 Static 荷 质比的母离子通过, 而第二个四极杆选择一个合适的质量范围作扫描 Scanning 六极杆碰撞室 孕酮的子离子产物 母离子 CH 3 CH 3 CH 3 氩气 CH 2 H 3 C CH 2 子离子 CH 3 CH3 35. Mass Spectrum from MS mz 在碰撞室里, 离子的动能转换成内能 碰撞条件 ( 断裂 ) 可通过控制加以改变 : 碰撞能量 ( 离子进入碰撞室的速度 ) 碰撞的的机遇 ( 碰撞气的压力 ) Product ion spectrum from MS mz 多离子反应检测 (MRM) MS Collision Cell Argon gas MS2 MRM 子离子检测图孕酮 mz 35. > Precursor(s) Product(s) ngml Progesterone Static (mz 35.) Static (mz 9.) 第一和第二四极杆质量分析器均固定质量 电菏比 Static 第一四极杆只让母离子通过, 第二四极杆让子离子通过 Time

6 欧盟 238EC 法规 欧盟法规 根据欧盟规定, 动物用药分为两类 : Group A 为禁用为药物 (Banned Drugs) 為不得检出且完全禁止使用, 法規对于这类药物的检验方法有 : 最低检出极限要求 (Minimum Required Performance Limit,MRPL) 如 : 硝基呋喃 氯霉素 孔雀绿 兴奋剂等 Group B 为合法可使用的兽药 (Legal Medicine) 对于不同的药物规定有不同的最大允許殘留量 ( Maximum ResidueLimit, MRL) 如 : 四环素类 ( 种 ) 磺胺类 (2 种 ) 喹诺酮类 (2 种 ) 等 各种离子的鉴别点数 关于鉴别点 (intentification piont) 鉴别点数的规定欧盟 22657EC 法规 ( 质量控制 )

7 准确度测定的规定 准确度 : 重复分析标准物质, 测定的含量 ( 经回收率校正后 ) 平均值与真值的偏差指导范围如下 : 真实浓度 (µgkg) 小于等于 - 大于 范 围 没有标准物质 (CRM) 时, 准确度可以通过测定空白基质中加入已知量分析物的回收率获得 分析过程的质量控制精密度 ( 变异系数 ) 在重现性条件下, 对参考标准或加标样重复分析的实验室间变异系数 (CV), 不得超出 Horwitz 方程计算的水平 该方程如下 : CV=2xE(-.5logC) 质量分数 µgkg µgkg µgkg µgkg 重现性 45* 32* 23 6 在重复性条件下, 实验室内 CV 通常在上述数值的一半到三份之二之间 在实验室内重现性条件下进行的分析, 其实验室内 CV 不应大于上述重现性 CV 质量分数低于 μgkg 时, 用 Horwitz 方程给出无法接受的高值 因此, 浓度低于 μgkg 的 CV 应尽可能低. CV 分析过程的质量控制对质谱确证方法的要求 对于每个诊断离子, 信噪比 >3: 测定至少一对离子丰度比 相对离子丰度最大容许偏差不能超过下表 关于微囊藻分类 微囊藻 (Micocystis) 是蓝藻门 蓝藻纲 色球藻目 色球藻科 微囊藻属 相对丰度 ( 基峰 ) >5 >2 到 5 > 到 2 EI-GC-MS ( 相对 ) ± ±5 ±2 ±5 CI-GC-MS GC-MS n LC-MS LC-MS n ( 相对 ) ±2 ±25 ±3 ±5 微囊藻包括 : 假丝微囊藻铜绿微囊藻具缘微囊藻不定微囊藻水华微囊藻等 关于微囊藻毒素 Micocystis 结构图 Name R R 2 RR L-Arg L-Arg 微囊藻 (Micocystis) 其中多数会产生毒素 : MC-RR -LR -YR -LW -LF LA LY 七十多种 基本结构 : 七环肽, 包括 5 个 D- 型氨基酸和 2 个可变的 L- 型氨基酸组成 两种 L- 型氨基酸的不同组合构成了微囊藻毒素的不同异构体 MC-RR 和 MC-LR 是其中毒性最大的两种异构体 YR LR LA LY LW LF L-Tyr L-Arg L-Leu L-Arg L-Leu L-Ala L-Leu L-Tyr L-Leu L-Try L-Leu L-Phen ADDA H CH H H 3 H CH 3 CH 3 H 3C H H D-Glu H CH CH 3 N HN H 3C NH H CH H 3 H H [R 2] N [R ] H CH D-β-Me-Asp Mdha CH 2 NH D-Ala

8 检测方法 酶联免疫法 ( 国标 GBT 初筛法 ) 目前国内已建立检出限 :.ngml 以下, 易出现假阳性 2 高效液相色谱法 ( 国标 GBT 定量法 ) 目前国内已建立检出限 :.ugml 3 液质联用法 ( 确认与定量法 ) 目前国内未建立检出限 :.ngml 以下 酶标板 ELISA 板最常用的材料是聚苯乙烯 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能, 抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性, 加之它的价格低廉, 所以被普遍采用 聚苯乙烯 ELISA 板由于原料的不同和制作工艺的差别, 各种产品的质量差异很大, 良好的 ELISA 板应该是吸附性能好, 空白值低, 孔底透明度高, 各板之间 同一板各孔之间性能相近 加 样 在 ELISA 中一般有 3 次加样步骤, 即加标本, 加酶结合物, 加底物 加样时应将所加物加在 ELISA 板孔的底部, 避免加在孔壁上部, 并注意不可溅出, 不可产生气泡 ; 2 每次加标本应更换吸嘴, 以免发生交叉污染 ; 3 酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器, 使加液过程迅速完成 保温 温育常采用的温度有 37 室温和 4 等 37 是实验室中常用的保温温度, 也是大多数抗原抗体结合的合适温度 在建立 ELISA 方法作反应动力学研究, 实验表明, 两次抗原抗体反应一般在 37 经 -2 小时, 产物的生成可达顶峰 室温较 37 可避免蒸发, 为加速反应, 可辅以摇床振荡 抗原抗体反应在 4 过夜反应更为彻底 洗涤 ( 决定实验的成败 ) 显 色 ELSIA 靠洗涤来分离游离的和结合的酶标记物 通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质, 以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质 可以说在 ELISA 操作中, 洗涤是最主要的关键技术, 应引起操作者的高度重视, 操作者应严格按要求洗涤, 不得马虎 HRP - TMB 显色系统受光照的影响不大, 可在室温中置于操作台上, 边反应观察结果 但为保证实验结果的稳定性, 宜在规定的适当时间阅读结果 TMB 经 HRP 作用后, 约 4 分钟显色达顶峰, 随即逐渐减弱, 至 2 小时后即可完全消退至无色 各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色, 此时可用特定的波长 (45nm) 测读吸光值

9 常用实验试剂 包被液 : 磷酸盐缓冲液 (PBS ph=7.4), Tris-HCl (ph=7.8), 缓冲液或碳酸盐缓冲溶液 (ph=9.6),4 保存洗涤液 : ph7.4 PBS-Tween--2 封闭液 : 含 BSA 的 PBS 缓冲液,4 保存终止液 ::mollh 2 S4 标准曲线的绘制 计算每个标准或样品的平均 D45 值, 并按以下公式算出 B B = D D 标准或样品 阴性对照 根据标准样品的 B 值与对应微囊藻毒素浓度的对数之间的关系做出标准曲线 根据标准曲线选取 S 曲线中的直线部分 : y = D 标准 样品 D 阴性对照 x 表示微囊藻毒素浓度的 LG 值, 再求其反对数得到相应的微囊藻毒素浓度 (ngml) 结果的计算 B B log(c) y = x log(c) 高效液相色谱 (High Performance Liquid Chromatography HPLC) 仪器与设备 高效液相色谱仪( 带梯度洗脱泵,UV 检测器, 柱温箱 ) 2 色谱分离柱 DS C-8 5um,4.6 5mm 3 超声波细胞破碎机 4 离心机(4, 转 分, 可分离.5mL 离心管 ) 5 固相萃取小柱 DS C-8 Waters PN 6 旋转蒸发仪 7 其他玻璃仪器 水样样品预处理 5mL 水样 GFC 滤膜 2.45μm 醋酸纤维酯滤膜 3 直接测定或 -2 保存 SPE 小柱富集纯化 9 甲醇洗脱, 浓缩 H P L C 分析

10 AU AU Channel A Name M in u te s Channel A Name M in u te s AU AU 藻类样品预处理 分离纯化 5-mg 藻样 SPE 小柱再生 超声破碎 ( 适当程度 ) ml 甲醇 ml 水 抽干 上 样 甲醇三次萃取 浓缩 将样液循一次 SPE 小柱富集纯化 9 甲醇洗脱, 浓缩 H P L C 分析 6mL9 甲醇溶液洗脱 氮气吹干至 ml 内 流动相定容至 2mL 离心进样 色谱条件 C8 柱 (4.6x25mm) 流动柱温 4, 流速.mLmin, 流动相 :A 5 mm 磷酸缓冲液,pH3.,B 甲醇 AB(46) 进样量 :2uL 次 检测波长 : 238nm HPLC 方法的操作要点 藻类样品的细胞壁破碎应使用超声波细胞破碎法 2 萃取液可在 5 的醋酸溶液或 甲醇溶液两者之间选择 3 藻类样品必须萃取三次 4 固相萃取的柱必须严格再生 5 过 SPE 柱可重复过两遍, 有利藻类毒素的充分吸附 色谱图 色谱图 LR.2 Channel A Name LR LR AU.6.6 AU Minutes

11 结果计算 X = X RR + X YR + X LR C V X XR = W 式中 : X 水华样品中三种微囊藻毒素异构体的总含量 mgg X XR 水华样品中单个微囊藻毒素异构体的含量 mgg C HPLC 测得浓度 mgml V 试样定容体积 ml W 试样称重 mg LC-MSMS 法 分离纯化 色谱条件 由于该方法对所有的毒素灵敏度均大于国家标准的限量值 (ugl), 所以可以将加内标后的水样, 通过.22 um 微孔滤膜过滤后, 直接进样分析 无须同 HPLC 法进行大容量的富集, 这无疑大大地提高了实验效率 强洗脱溶剂比例 () 洗脱梯度 时间 (min) Acquity UPLC BHE3 C8 柱 (2. mm 粒径.7 μm), 柱温 : 3 ; 样品温度 : 室温, 进样体积 :ul, 流速 :.3mLmin, 强洗脱溶剂的选择 乙腈 甲醇 (64) 甲醇 五种 MCYST 在不同流动相对离子化的影响 流动相 MCYST-RR 峰面积 MCYST-YR 峰面积 MCYST-LR 峰面积 MCYST-LW 峰面积 MCYST-LF 峰面积 不含有添加剂 TFA 甲酸 甲酸 mM 醋酸铵 甲酸 + 2mM 醋酸铵 甲酸 + 2mM 醋酸铵

12 mcyst Sm (Mn, 2x2) mcyst Sm (Mn, 2x2) MRM of 6 Channels ES+ TIC 5.74e mcyst Sm (Mn, 2x2) MRM of 6 Channels ES+ TIC 4.44e mcyst Sm (Mn, 2x2) MRM of 6 Channels ES+ TIC 6.9e5 MRM of 6 Channels ES+ TIC 6.2e Time 五种 MCYST 在不同类型色谱柱的比较 质谱条件 a b c d STD acquity a symmetry3 C8 (4.6*75mm i.d. particle size 3.5um pore size 3 A) b symmetry3 C8 (2.*mm i.d. particle size 3.5um pore size 3 A) c acquity UPLC BEH3 C8 (2.*mm i.d. particle size.7um pore size 3 A) 效果最好 d acquity UPLC BEH C8 (2.*mm particle size.7um pore size A) 离子源参数 : 电喷雾 : 正离子 毛细管电压 :3.5kV 锥孔电压 :4V 离子源温度 :2 质量分析器参数 : 低端分辨率 LF Lens:2.V 高端分辨率 HM Lens:2.V; 入口透镜电压 :V 碰撞梯度 :.5 锥孔反吹气流量 :55 Lhr 出口电压 :2V; 脱溶剂气温度 :35 低端分辨率 LF Lens2:2.V 脱溶剂气流量 :6Lhr 高端分辨率 HM Lens2:2.V MCYST 的碎片机理 (LR YR LA LY LW LF) RR 的特征离子和碎片机理 名 称 亮氨酸脑腓肽 MCYST-RR MCYST-YR MCYST-LR MCYST-LA MCYST-LY MCYST-LW MCYST-LF 分子量 质量条件参数 准分子离子 [M+] a a a 9.9 a 2.3 a 25.8 a a [M+2] 2+ 离子 N.D. 52. a N.D. N.D. N.D. N.D. 35. b b b b b b 23.3 注 :a: 所选择的母离子 b: 所选择的定量子离子 N.D 特征离子 b b 62. 碰撞能量 (ev) 标准品的总离子流色谱图

13 Compound name: LA Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve:.3939 * x type: Internal Std ( Ref ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Curve type: Linear, rigin: Exclude, Weighting: x, Axis trans: None Conc Compound name: LW Correlation coefficient: r =.99664, r^2 = Calibration curve:.2739 * x type: Internal Std ( Ref ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Curve type: Linear, rigin: Exclude, Weighting: x, Axis trans: None Conc Compound name: LY Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x type: Internal Std ( Ref ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Curve type: Linear, rigin: Exclude, Weighting: x, Axis trans: None Conc Compound name: LF Correlation coefficient: r =.99427, r^2 = Calibration curve: * x type: Internal Std ( Ref ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Curve type: Linear, rigin: Exclude, Weighting: x, Axis trans: None Conc Compound name: RR Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x type: Internal Std ( Ref ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Curve type: Linear, rigin: Exclude, Weighting: x, Axis trans: None Conc Compound name: LR Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve:.38 * x type: Internal Std ( Ref ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Curve type: Linear, rigin: Exclude, Weighting: x, Axis trans: None Compound name: YR Correlation coefficient: r =.99978, r^2 = Calibration curve:.377 * x type: Internal Std ( Ref ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Curve type: Linear, rigin: Exclude, Weighting: x, Axis trans: None Conc Conc 标准品定量离子色谱图 定量检出限 各标准品浓度均为 ugl 其 LQ 均在.2ugL 左右 空白水样检测结果 标准曲线 标准曲线 标准曲线 标准品 标准曲线 相关系数 r MCYST -RR y = x MCYST -YR MCYST -LR y =.377 x y =.38 x MCYST -LA MCYST -LY y =.3939 x y = x MCYST -LW y =.2739 x MCYST -LF y = x

14 日内 ( 表 ) 和日间 ( 表 2) 精密度 方法回收率试验 (n=3) 表 (n=) 名称 加标量 (ugl) 回收率 名称 加标量 (ugl) 回收率 Conc.(ugL) RR 2. YR.6 LR.67 LA.84 LY.37 LW 2.5 LF.87 RR ± ±7.42 LA ± ± ±4.6 RSD() 表 2(n=7) Conc.(ugL) RSD() 5.79 RR YR LR LA LY LW LF YR LR ± ± ± ± ± ± ±5.28 LY LW LF ± ± ± ± ± ± ± ± ±5.59 微囊藻检测总离子流图 慈溪梅湖水样总离子流图 慈溪梅湖水样定性定量离子流图 无锡太湖南泉水样测定结果

15 无锡太湖南泉水样定性定量离子流图 LC-MSMS 和 ELISA 两种方法比对结果 ELISA 法 LC-MSMS 法测定结果 (μgl) n=3 测定结果 (μgl) 序号 MCYST-RR MCYST-LR MCYST-LW MCYST-LF TTAL TTAL N.D. N.D N.D. N.D N.D. N.D N.D. N.D N.D. N.D N.D. N.D N.D. N.D N.D. N.D N.D. N.D N.D. N.D LC-MSMS 和 HPLC 两种方法比对结果 LC-MSMS (µgl) n=3 HPLC (µgl) n=3 水样序号 RR LR RR LR 不同时期污染的水体的检测结果 Conc RR LR total April.29 May.7 June.2 June.2 July.5 结论 选用 LC-MSMS 法的 MRM 方式检测水体样品中的 MCYST, 灵敏度高, 不须经过复杂的富集萃取过程, 实验效率明显提高 采用了 UPLC 分离技术, 利用甲醇 乙腈 水为流动相, 能在 8 分钟内分离 7 种 MCYST 采用三重四极杆质谱的多离子反应监测 (MRM) 方式, 分别确定 7 种 MCYST 的 [M+] 或 [M+2] 为母离子, 经碰撞能量优化试验, 确定特征子离子, 可获得极高的检测灵敏度, 方法检出定量限 (LQ) 均低于 μgl 的限量 5 倍以上, 满足了低含量 MCYST 样品的检测要求 方法学验证表明, 本方法精密度高, 回收率稳定, 适宜作为在自然水体中监测 MCYST 含量的方法 霉菌污染的农作物

16 什么是霉菌毒素? Myco : 霉菌 toxin : 毒素由霉菌产生的具有生物毒性的次级代谢产物 ; 由多种霉菌产生 ; 几乎所有的农作物都可能被污染 ; 已知的霉菌毒素多达 3 种以上 ; 化学性质稳定 ; 耐高温 ; 耐持久 ; 耐加工过程中的各种处理 霉菌产生毒素及其毒性 曲霉菌属 黄曲霉毒素 肝毒素, 致癌物质 赭曲霉素 肾毒素, 致癌物质 柄曲霉素 致癌物质 镰刀菌属 T-2 毒素 皮肤坏疽, 出血 呕吐毒素 引起呕吐反应 雪腐镰刀菌烯醇 皮肤坏疽, 出血 玉米赤霉烯酮 雌激素综合征 伏马毒素 致癌物质 青霉菌属 橘青霉素 肾毒素 展青霉素 有毒物质, 致癌物质 Rubratoxins 肝毒素 Penitrems 颤栗 Penicillic acid 致癌物质 各种农作物中易污染的霉菌毒素 玉米 黄曲霉毒素, 桔霉素, 呕吐毒素, 伏马毒素, T-2 毒素, 玉米赤霉烯酮 小麦 桔霉素, 伏马毒素, Moniliformin, T-2 毒素, 玉米赤霉烯酮 大麦 桔霉素, 呕吐毒素, 赭曲霉素, T-2 毒素, 玉米赤霉烯酮 豆制品 赭曲霉素 咖啡 赭曲霉素 棉籽 黄曲霉毒素 水果 赭曲霉素, 棒曲霉素 花生 黄曲霉毒素, Cyclopiazonic acid 稻米 桔霉素, 伏马毒素, T-2 毒素 树籽 黄曲霉毒素, Tremorgens 高粱黄豆大麦 葵花子 燕麦 香料 玉米 小麦 菜籽 Pictures from Internet 霉菌毒素致病特点 人 畜禽食用有霉菌毒素的食物或饲料会发生急性中毒 慢性中毒及致癌作用. 季节性 区域性. 由于霉菌毒素是小分子有机化合物, 不是复杂的蛋白质分子, 所以在机体中无法产生抗体, 也不能免疫 Pictures from Internet

17 霉菌毒素的致癌机理 霉菌毒素与细胞大分子结合, 如 DNA, RNA 在体内进行活化的部位是细胞的微粒体, 催化这种反应的酶主要是微粒体中的混合功能氧化酶. 与 DNA 或 RNA 大分子结合, 导致基因结构或表达上的异常, 从而使正常的细胞转为癌细胞毒素与大分子特别是 DNA 结合的活性越高, 结合量越大, 则其致癌性及致突变性就越强, Aflatoxin B 抑制生物体的免疫功能 伴随着毒素的产生可将基质中的某些成分转化为致癌物质的前体, 或将无致癌性物质转化为致癌物. 从霉变的玉米面饼中可检出致癌性亚硝胺的前体物质二级胺, 亚硝酸盐和硝酸盐 ZZ 美国 欧盟和中国主要食品霉菌毒素的限量 毒素名称 总黄曲霉毒素黄曲霉毒素 B 黄曲霉毒素 M 赭曲霉毒素 A DN ZN 毒素名称 总黄曲霉毒素黄曲霉毒素 B 黄曲霉毒素 M 赭曲霉毒素 A DN ZN 所有食品 2 美国 玉米 花生及其制品 (ppb) 婴幼儿食牛奶品乳制品 中国.5 大米 植物油 ( 除玉米油 花生油 ) 欧盟 (ppb) 牛奶 农产品 婴幼儿食品 乳制品 (ppb) 其他粮食 豆类 发酵食品 5 婴幼儿食品 5 鲜乳乳制品.5 霉菌毒素的实验室检测方法 霉菌毒素理想的检测方法, 应该是先进 快速 灵敏 准确 经济 简单 安全的 霉菌毒素的实验室检测方法一般分为两类 : 快速筛选法 2 定量法 3 确证法 TLC 霉菌毒素检测方法类型 Fluorometry... frequency of techniques ELISA LCGC-MS GC LC 定性 半定量 薄层色谱法酶联免疫学方法荧光法 定量 HPLCGCLC- MSGC-MS 酶联免疫学法荧光检测法 确认仲裁 TLC HPLC LC-MSMS 国标测定方法 薄层色谱法 (GBT 第一法 ) 微柱筛选法 (GBT 第二法 ) 液相色谱法 (GBT 第三法 ) 液相色谱 - 质谱联用法. 快速筛选法 目前, 国际上使用较为普遍的霉菌毒素快速筛选法有荧光光度计法和酶联免疫法 前者常常结合免疫亲和柱净化使用, 是美国 AAC 的标准检测方法, 以黄曲霉毒素检测为例, 它可以检测黄曲霉毒素总量达到 2ppb 以下, 符合欧盟的指令要求 缺点 : 假阳性率高

18 幻灯片 97 ZZ 例如, 在霉变的玉米面饼中可以检测到致癌性亚硝胺的前提物质二级胺, 亚硝酸盐和硝酸盐. ZHANGZHE, 24--

19 微柱筛选法原理 GBT 第二法 试样提取液通过由氧化铝与硅镁吸附剂组成的微柱层析管, 杂志被氧化铝吸附, 黄曲霉毒素被硅镁吸附剂吸附, 在 265 nm 紫外线下呈蓝紫色荧光, 其荧光强度在一定范围内与黄曲霉毒素的含量成正比 本方法只能检测黄曲霉毒素的总量 2. 定量法 霉菌毒素定量法一般有高效液相色谱法 (HPLC) 气相色谱法(GC) 以及经典的薄层色谱扫描法 (TLC) 等 其中, 高效液相色谱结合荧光或紫外检测器法 (HPLC) 因其灵敏度高 检测限低 自动化程度高等优点在国际上得到了最为广泛的使用 薄层色谱法 GBT 第二法 原理 : 样品经过提取 浓缩 薄层分离后, 在 365nm 紫外光下, 黄曲霉毒素 B B2 产生蓝紫色荧光, 黄曲霉毒素 G G2 产生黄绿色荧光 HPLC 法 GBT 第三法 试样经乙腈 - 水提取, 提取液过滤后, 经装有反相离子交换吸附剂的多功能净化柱, 去除脂肪 蛋白质 色素及碳水化合物等干扰物 净化液中的黄曲霉毒素与三氟乙酸衍生, 用带有荧光检测器的液相色谱系统分析, 外标法定量 仪器与设备 高效液相色谱仪- 荧光检测器 2 反相色谱柱 C8 3 反相离子交换净化柱 4 电动震荡器 5 旋涡混合器 6 烘干箱 7 离心机 8 氮气吹干机 样品预处理样品用乙腈 水 (846) 提取 提取液在 SPE 柱中富集净化 净化液吹干后用正己烷和三氟乙酸衍生化 衍生物吹干 用水 乙腈 (855) 溶解上清液进样分析

20 色谱条件 梯度洗脱 C8 柱 (2.5 X 2.mm, 5um) 流动柱温 3, 流速.5 mlmin, 流动相 : 乙腈 水 时间 (min) 6 乙腈 () 5 7 水 () 进样量 :25 ul 次 激发波长 :36nm 发射波长 :44nm 标准品色谱图 花生酱阳性样品色谱图 6 EU AF G AF G AF B AF B EU AF B Minutes Minutes 阴性样品色谱图 结果计算 A V c = m f EU Minutes 式中 : c 试样中每种黄曲霉毒素的浓度,ugkg A 试样按外标法在标准曲线中对应的浓度,ugkg V 试样提取过程中, 提取液的体积 ml m 试样取样量 g f 试样溶液衍生后较衍生前的浓缩倍数

21 3. 最新的确证法 应用超高压液相色谱 - 电喷雾串联四极杆质谱联用技术 UPLC-MSMS, 在多反应离子检测方式下 (MRM) 对食品中 7(22) 种曲霉 青霉和镰刀菌等霉菌毒素污染进行检测 经方法学研究验证 : 在 ESI + 电离方式下 种霉菌毒素的最低定量限 LQ 范围为.~.2 μgkg, 均低于欧盟 美国和其它各国对饲料 食品 ( 包括儿童食品 ) 中各种霉菌毒素的最低限量 在 ESI - 电离方式下 7 种霉菌毒素的最低定量限 LQ 范围为.2 ~.5 μg kg;7 种霉菌毒素在各自线性定量范围内, 相关系数 r 2 均大于.999; 低 中 高浓度添加回收率范围为 7.6 ~ 9. 该方法具有预处理简单 检测速度快 灵敏度高的优点, 可适用于复杂基质样品中多组分霉菌毒素的确认和准确定量检测, 能满足各国对上述霉菌毒素的最低检出要求 色谱条件 色 谱 柱 :Waters ACQUITY UPLC BEH,C8 柱 2. mm 粒径.7 um 柱 温 :35. 时 间 流 速 A B 梯度变化 样品温度 :25 进样体积 :5µL min mlmin 流 速 :.3mLmin 运行时间 : mins 流动相 A: (ESI+) mm 醋酸铵溶液 (ESI-). 氨水溶液 流动相 B: 甲 醇 质谱条件 毒素名称 AFB 母离子 33. 质谱参数 定量子离子 24.* 碰撞能量 (ev) 32 定性子离子 285. 碰撞能量 (ev) 23 离子源 ESI+ 离子源 :ESI+; 毛细管电压 :3.6kV; 锥孔电压 :45V; 离子源温度 :2 ;RF 透镜 :4.; 光圈 :.;RF 透镜 2:.; 锥孔反吹气流量 :5 Lhr; 脱溶剂气温度 : 35 ; 脱溶剂气流量 :5Lhr; 碰撞池压力 :3. -3 mbar 质量分析器 : 低端分辨率 LF Lens: 2.5V; 高端分辨率 HM Lens:2.5V; 离子能量 :.3; 入口透镜电压 : V; 碰撞梯度 :.; 出口电压 :2V; 低端分辨率 LF Lens2: 2.5V; 高端分辨率 HM Lens2: 2.5V; 离子能量 2:.6 ev; 质量条件参数详见表 AFB2 AFG AFG2 AFM T2 HT2 Verrulogen Citrinin Sterigmatocystin TA 3-ADN 5-ADN ZN FX NIV DN ZAN+IS * 242.9* 245.2* 34.9* 245.2* 345.3* 392.2* 232.9* 3.* 358.* 37.* 49.9* 74.9* 263.* 28.* 265.* 33.4* ESI+ ESI+ ESI+ ESI+ ESI+ ESI+ ESI+ ESI+ ESI+ ESI- ESI- ESI- ESI- ESI- ESI- ESI- ESI+ ZAN-IS * ESI- UPLC 和 HPLC 不同类型柱子 不同色谱柱对阳离子的分离选择 a 柱 柱 :Waters Sunfire C8 (2. 5 mm 粒径 5 μm) b 柱 柱 2:Waters Antilants C8 (2. 5 mm 粒径 5 μm) 柱 3:Waters ACQUITY UPLC BEH C8(2. mm 粒径.7 μm) c 柱 柱 4:Watera ACQUITY UPLC BEH C8(2. mm 粒径.7 μm) d 柱

22 C olu mn 3# C olu mn 3# C olu mn 3# 不同流动相的选择 ZN 不同色谱柱对阴离子的分离选择 ZN Sterigmatocystin TA Column# 2& &8 5&6 相对丰度 AFG2 T-2 Ⅰ Ⅱ 相对丰度 Ⅰ Ⅱ DN 相对丰度 2 Column2# 7&8 Column3# 2 5&6 5&6 3& &6 7&8 时间 min 时间 min Column4# 正离子 负离子 7 种霉菌毒素的检测总离子流图 种阳离子的定量离子流图 9 8 相对丰度 4 & 2 3 7&8 5& 相对丰度 时间 mins 图中.NIV, 2.DN, 3.FX,4.TA, 5.3-ADN& 6.5-ADN 7.AFG2&8.AFM,9.AFG,.ZN&. 内标 ZAN-,2.AFB2,3.AFB,4.Citrinin,5.HT-2,6.T-2,7. 内标 ZAN+, 8.Sterigmatocystin,9.Verrulogen 5 种霉菌毒素总离子流图 (ESI+) 种霉菌毒素定量离子监测通道图 Fig.. The total ion chromatogram (TIC) of 5 mycotoxins positive ions: () AFM2; (2) AFG2; (3) AFM; (4) AFG; (5) AFB2; (6) AFB; (7) MY; (8) DAS; (9)CTN; () HT-2; ()T2; (2) SMC; (3)CHA; (4)VCG; (5)PEN. The UPLC conditions were described in P Fig. 2. Ion chromatograms of 5 kinds of [M +H]+ : () AFM2; (2) AFG2; (3) AFM; (4) AFG; (5) AFB2; (6) AFB; (7) MY; (8) DAS; (9)CTN; () HT-2; ()T2; (2) SMC; (3)CHA; (4)VCG; (5)PEN.The MSMS conditions were described in P35. The concentrations of 5 positive ions were ng ml, respectively.

23 黄曲霉毒素 G2 与 M 的通道干扰检测 五种黄曲霉毒素 AFLG2 AFLM AFLM AFLG ZAN AFLB2 AFLB2 AFLB AFLB 样品中 AFLM AFLG2 其他关注点. 由于实验过程在花生酱样品中发现黄曲霉 M, 而根据现有的研究, 都认定其为体内代谢的产物, 常存在于牛奶等乳制品中. 从 LC-MSMS 确证的角度看, 可以认定我们在花生酱样品中发现的为黄曲霉 M. 在此前还未发现有报道在除乳制品外的食品中有发现 M. 所以这将是一个新的探索. AFLM AFLM 2. 橘青霉素是存在于发酵的酒类产品中, 例如红曲中就存在橘青霉素的可能. 但由于红曲本身比较复杂, 加之橘青霉素极易受基质影响抑制其在质谱检测中的信号, 所以对前处理要求非常高. 到目前为止还未见报道有很好的前处理方法. 所以本实验还将对此进行研究. 七种霉菌毒素的总离子流图 (ESI-) 7 7 种霉菌毒素 ESI- 定量离子监测通道 ()NIV;(2)DN;(3)FX;(4)TA(5)5-ADN;(6)3-ADN;(7)ZN(The MSMS conditions were described in P35. The concentrations of 7 negative ions were ng ml, respectively Fig. 2. Ion chromatograms of 7 kinds of [M +H] - : ()NIV;(2)DN;(3)FX;(4)TA (5)5-ADN;(6)3-ADN;(7)ZN(The MSMS conditions were described in P35. The concentrations of 7 negative ions were ng ml, respectively

24 3-ADN 与 5-ADN 的通道干扰测 内标的选择 H H Zearalanone(ZAN ZAN,2,4- 二羟基 -6(- 羟基 -6- oxoundecyl) ) 苯甲酸 u- 内酯 ), 纯度 :99: 99,( 购自 SIGMA 公司 Missouri USA) 内标名称 母离子 定量子离子 碰撞能量 (ev) 定性子离子 离子化碰撞能量方 (ev) 式 ZAN + IS ESI+ ZAN - IS ESI- ZN 与 ZAN(Zearalanone) 通道干扰检测 内标在样品中的干扰验证 相对丰度 相对丰度 时 间 mins 时 间 mins 时 间 mins 时 间 mins 萃取过程 目的将样品中的真菌毒素转移于溶剂中部分的除去样品中的干扰物浓缩毒素使用甲醇 水或乙腈 水混合液萃取研磨样品使用搅拌机 (3-5 Minutes) 或震荡仪 (3-8 Minutes) 震荡萃取液. 分析物的极性越强, 所需水越多 e.g. 伏马毒素应使用 55 乙腈 水萃取玉米赤霉烯酮使用 846 乙腈 水萃取样品液数量与溶剂数量存在最佳比例 注意所使用的有毒溶剂对健康的损害及污染 分析程序 纯化 目的 : 去处基质中可干扰分析过程的化合物, 例如脂肪 蛋白质等 纯化方法及工具 : 加入金属 - 盐类免疫亲和柱 (IAC) 固相萃取柱 Mycosep 多功能清洗柱其他

25 免疫亲和柱的清洗过程 : 优点 特异性强 可浓缩样品液 缺点耗时 只针对单一毒素 价格昂贵 固相萃取柱清洗过程 : 优点 可浓缩样品萃取液 较长的保质期缺点非特异性耗时特点 SPE 用木炭,c 盐, 硅胶, 硅藻土 ( 混合物 ) 进行固相萃取通过运用亲脂性和带电荷的材料, 可去除所有的干扰物 Mycosep226 清洗柱清洗过程 : 本实验样品预处理方法 优点 使用简便且快速 较长的保质期 多种毒素分析方法 缺点 无浓缩作用 易受基质影响 准确称取 ~2g 样品于 ml 的锥形瓶中, 加入 ml (8 ngml) 的内标, 再加入 4 ml ( 乙睛 84 水 6), 均质 3 mins, 用滤纸过滤. 滤液过 226 净化柱, 取其中的 ml 净化液于玻璃试管中, 用氮吹仪在 5 下吹干 然后用甲醇 水 (55) 定容至 ml 涡旋 3 s, 用滤膜过滤, 进样 ESI+ 空白与样品比较 ESI- 空白与样品比较

26 Compound name: ZN Correlation coefficient: r =.99959, r^2 =.9998 Calibration curve: * x Res ponse type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Curve type: Linear, rigin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans : None ngml Compound name: CIT Correlation coefficient: r =.99962, r^2 = Calibration curve: * x type: Internal Std ( Ref 3 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Curve type: Linear, rigin: Include, Weighting: x, Axis trans: None ngml Compound name: M Correlation coefficient: r =.99977, r^2 = Calibration curve:.83 * x type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) ngml Compound name: NIV Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) ngml Compound name: B2 Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) ngml Compound name: DN Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Compound name: STER Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x type: Internal Std ( Ref 3 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Curve type: Linear, rigin: Include, Weighting: x, Axis trans: None ngml ngml Compound name: 3-ADN Correlation coefficient: r =.99963, r^2 = Calibration curve: * x type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) ngml Compound name: G Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Compound name: 5-ADN Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) ngml Compound name: TA Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve:.6372 * x type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Compound name: B Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve:.4829 * x type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) ngml Compound name: FX Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve:.8483 * x type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) 种霉菌毒素的标准曲线 Compound name: VERR Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Compound name: T2 Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Compound name: HT2 Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve:.784 * x type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ) Compound name: G2 ngml Correlation. coefficient:. 2. r =.99985, r^2 = Calibration curve:.3845 * x type: Internal Std ( Ref 9 ), Area * ( IS Conc. IS Area ). ngml ngml ngml ngml ngml ngml 各种霉菌毒素的线性关系和检出限 毒素名称 Calibration equation R 2 LD (ngml) LQ (ngml) AFB y =.4822x AFB2 AFG AFG2 y =.9943x-.84 y =2.979x-.7 y =.385x AFM T-2 y =.8x-.74 y =2.394x HT-2 y =.78x Verrulogen Sterigmatocystin Citrinin y =3.375x-.363 y =3.8844x-.563 y =.6739x TA 3-ADN 5-ADN y =.632x y =.699x-.76 y =.347x FX y =.848x ZN NIV y =.4653x-.686 y =.3857x DN y =.359x 玉米粉样品中 (M+)+ 离子和负离子霉菌毒素的 MRM 方式检测 花生酱中 (M+)+ 离子和负离子霉菌毒素的 MRM 方式检测 VERR TA T-2 VERR TA HT-2 FX T-2 AFG2 3-ADN HT-2 FX 相对强度 AFM AFG SMC ZAN + ( IS) AFB2 相对强度 5-ADN ZAN -( IS) ZN NIV 相对强度 AFG2 AFM AFG SMC ZAN + ( IS) AFB2 相对强度 3-ADN 5-ADN ZAN -( IS) ZN NIV AFB DN AFB DN CTN CTN

27 花生酱样品 (μgkg) 玉米样品检测结果 ( μgkg ) 样品编号 AFBI AFB2 AFG AFG2 AFM T-2 HT-2 Verrulogen Sterigmatocystin Citrinin TA FX 3-ADN 5-ADN NIV ZN DN # 2# # # # # # # # # 样品编号 AFBI AFB2 AFG AFG2 AFM T-2 HT-2 Verrulogen Sterigmatocystin Citrinin TA FX 3-ADN 5-ADN NIV ZN DN # # # # # # # # # # 浙江省省部分样品霉菌毒素的检测结果 (μgkg) 花生酱宁波邱隘 花生酱宁波海曙 花生酱绍兴仁昌 花生酱宁波甘源小 花生酱宁波甘源大 花生酱宁波高塘 霉豆腐咸亨辣味 霉豆腐红方 黄酒块曲 AFB AFB AFG AFG2.6. AFM.8 T-2 HT-2 VERR SMT CIT TA FX ADN ADN.3 DN ZN 3.36 NIV 3.46 霉豆腐咸亨臭豆腐 样品下一步的工作重点 海洋贝类毒素:PSP DSP 的多组分检测平台 ; 2 极性有机农药多组分残留检测平台; 3 各类水体中多组分有机物残留检测平台; 4 环境空气中各类有机物残留检测平台; 5 生物样品中无机有害元素的检测平台 我们的研究内容 食品中色素的测定方法 : 同位素内标法测定食品中的苏丹红 (LC-MSMS 法 )25 年 2 LC-MSMS 法测定食品中的碱性橙等工业染料 25 年 3 LC-MSMS 法测定食品中的酸性橙等工业染料 25 年 4 LC-MSMS 法测定食品中的碱性嫩黄等工业染料 25 年麻醉品 5 LC-MSMS 法测定火锅底料及卤味中的罂粟碱等违禁添加物 25 年 6 保健食品化学合成违禁药物 - 减肥药的检测 (LC-MSMS 法 ) 26 年 7 保健食品化学合成违禁药物 - 降糖类药物的检测 (LC-MSMS 法 )26 年 8 保健食品化学合成违禁药物 - 伟哥等药物的检测 (LC-MSMS 法 )26 年生物毒素 9 水体中微量微囊藻毒素的检测 (LC-MSMS 法 ) 26 年 食品及饲料中多种霉菌毒素的检测 (LC-MSMS 法 )27 年药物残留 水产品中孔雀石绿 结晶紫残留检测 (LC-MSMS 法 )26 年 2 牛奶中多种青霉素类抗生素残留检测 (LC-MSMS 法 )26 年 3 动物组织中的多种四环素类抗生素残留检测 (LC-MSMS 法 )27 年 4 奶及动物组织中多种磺胺类抗生素的残留检测 (LC-MSMS 法 )27 年 5 水产品中多种硝基呋喃类抗生素残留的检测 (LC-MSMS 法 )25 年 6 动物组织中多种喹诺酮类抗生素残留的检测 (LC-MSMS 法 )27 年 7 动物组织中多种 β- 兴奋剂残留的检测 (LC-MSMS 法 )27 年 8 动物组织及蜂蜜中氯霉素类药物的残留检测 (LC-MSMS 法 )25 年 9 焙烤和油炸食品中丙烯酰胺的含量检测 (LC-MSMS 法 )26 年 2 食品 饲料中三聚氰胺含量检测 (LC-MSMS 法 )27 年 2 中毒事件中鼠药的确证检测 (LC-MSMS 法 )27 年再见!

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