1130 WORLDCHINESEMEDICINE August2015,Vol.10,No.8 醇 和 咖 啡 因 的 世 界 第 四 大 嗜 好 物 品 [8] 然 而, 槟 榔 属 于 热 带 植 物, 性 喜 高 温, 其 生 长 环 境 雨 量 充 沛 空 气 潮 湿, 温 度 和 湿 度

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1 世界中医药 年 月第 卷第 期 中药资源与大健康产业发展专题 响应面分析用于槟榔储藏条件考察的研究 刘洪美 孔维军 胡一晨 杨美华 北京协和医学院中国医学科学院药用植物研究所北京 北京协和医学院中国医学科学院 药用植物研究所海南分所万宁 摘要 探寻 A 菌株在槟榔原药材中生长及产黄曲霉毒素 AFBAFBAFG 和 AFG 的规律分析槟榔药材的最 佳储藏条件 采用响应面分析法 R S A RS A 结合 C m 设计通过测定染菌后的槟榔中 水分含量及总黄曲霉毒素的变化考察温度 T m 和湿度 H m 两个环境因子对药材上 A 菌株产毒的影响分析该菌株的最适产毒条件 结果发现储藏后的槟榔水分含量发生了显著的增加 当湿度范围为 温度高于 时A 菌株在槟榔中生长较快并产生大量黄曲霉毒素 研究表明当储存条件为湿度小于 温度低于 槟榔药材在储藏过程中不易霉变产毒为槟榔储藏规范的制定及降低真菌毒素污染的概率提供了 较好的依据 关键词 槟榔 A 菌株 黄曲霉毒素 响应面分析 储藏 A R S A I S C A L H m K W HY Y M I M P D m C A m M S P U M C B C H B I M P D m C A m M S P U M C W C A T w w w A AFBAFBAFG AFG wa m A Tw m m m m H m w m A m T m w RS A m w C m m T w m A w W m w m w A wq m A T w A w m w m w m m w T m m m m K W A A A R S 中图分类号 R 文献标识码 A 槟榔 A L 为棕榈科槟榔属植物 用槟榔位居我国四大南药 槟榔 益智 砂仁 巴戟 主产于我国海南岛 台湾 云南河口及西双版纳热带 天 之首其种子 果皮 花等均可入药在临床上常 雨林广西 广东及福建仅有少量的分布 槟榔 用于驱虫消积主治人体肠道寄生虫 食积腹痛 水 含有多种人体所需的营养元素和有益物质同时也 肿胀满等 而在东南亚 南太平洋诸岛及周边地 含有槟榔碱 鞣质和油脂等多种药理活性成分 区包括我国的台湾 海南 湖南等省嚼食槟榔已成 当前对槟榔的利用主要有药用和食用两种方式 药 了重要的习俗 目前槟榔已成为仅次于尼古丁 乙 基金项目 十二五国家科技重大专项重大新药创制 中药质量安全检测和风险控制技术平台 编号 ZX 海南省重大科 技项目 南药 黎药产业化关键技术研究 分课题 道地南药益智 槟榔产业化关键技术研究 编号 ZDZX 作者简介 刘洪美 女山东临沂博士研究生研究方向 药物分析E m m m m 通信作者 杨美华 女江西南昌博士研究生研究员研究方向 中药质量分析和安全性研究电话 E m m m m

2 1130 WORLDCHINESEMEDICINE August2015,Vol.10,No.8 醇 和 咖 啡 因 的 世 界 第 四 大 嗜 好 物 品 [8] 然 而, 槟 榔 属 于 热 带 植 物, 性 喜 高 温, 其 生 长 环 境 雨 量 充 沛 空 气 潮 湿, 温 度 和 湿 度 均 非 常 适 合 霉 菌 生 长 及 真 菌 毒 素 的 产 生 [9 11] 如 果 存 放 或 储 存 不 适 当, 槟 榔 易 发 生 霉 变 而 污 染 黄 曲 霉 毒 素, 对 药 材 质 量 和 使 用 者 的 身 体 健 康 和 生 命 安 全 造 成 潜 在 威 胁 因 此, 防 止 真 菌 污 染 和 真 菌 毒 素 的 产 生 是 保 障 槟 榔 质 量 的 最 关 键 问 题 黄 曲 霉 毒 素 (Aflatoxins,AFs) 是 由 真 菌 黄 曲 霉 AspergilusflavusLink 和 寄 生 曲 霉 A parasiticus Speare 等 产 生 的 一 类 有 毒 次 生 代 谢 产 物, 依 据 其 产 生 的 衍 生 物 化 学 结 构 的 不 同 分 为 20 余 种, 其 中 最 主 要 有 AFB 1 AFB2 AFG 1 和 AFG 2 4 种 [12], 发 现 于 1960 年 在 各 类 真 菌 毒 素 中,AF 是 最 常 见 的 一 类, 其 毒 性 为 氰 化 钾 的 10 倍, 砒 霜 的 68 倍 [13] 大 量 资 料 证 实,AF 对 人 及 动 物 的 肝 脏 组 织 有 很 强 的 毒 害 作 用, 严 重 时 可 导 致 肝 癌, 甚 至 死 亡 [14] 1993 年 世 界 卫 生 组 织 癌 症 研 究 机 构 (IARC), 将 其 中 毒 性 较 大 且 与 人 类 生 活 密 切 相 关 易 污 染 谷 物 和 粮 食 的 AFB 1 定 为 第 一 类 致 癌 物 [15] AF 不 仅 易 对 粮 食 和 饲 料 造 成 污 染, 在 以 植 物 为 基 源 的 中 药 中 也 同 样 可 检 测 出 [16] AF 张 雪 辉 检 测 了 当 归 党 参 黄 芪 等 30 余 种 中 药 材, 发 现 杏 仁 秦 艽 生 建 曲 生 麦 芽 和 前 胡 中 均 含 [17] 有 AF Yang 等 检 测 了 19 种 中 药, 其 中 有 3 种 含 有 AF, 有 的 质 量 分 数 甚 至 高 达 28μg kg -1 Wen [18] 等 对 生 姜 及 其 相 关 产 品 中 4 种 黄 曲 霉 毒 素 进 行 了 检 测, 其 中,5 批 生 姜 产 品 含 有 AFB 1 刘 书 宇 [19] 等 检 测 了 20 批 莲 子 样 品, 有 14 批 样 品 的 黄 曲 霉 毒 素 的 检 测 结 果 呈 阳 性, 其 中 黄 曲 霉 毒 素 B 1 的 污 染 水 平 为 0 40~586μg kg -1, 黄 曲 霉 毒 素 总 量 (B 1 + B 2 +G 1 +G 2 ) 的 污 染 水 平 为 0 40~586μg kg -1, 并 且 5 批 样 品 中 AF 总 量 超 过 了 中 华 人 民 共 和 国 药 典 ( 以 下 简 称 中 国 药 典 ) 对 中 药 材 中 AF 总 量 的 限 量 标 准,6 批 样 品 中 AFB 1 的 含 量 超 出 了 中 国 药 典 对 中 药 材 中 AFB 1 的 限 量 标 准 然 而, 目 前 对 毒 素 产 生 菌 的 产 毒 机 制 和 产 毒 条 件 缺 乏 相 关 了 解, 缺 少 可 用 于 指 导 防 控 实 践 的 理 论 依 据 本 研 究 以 AFs 的 主 要 产 毒 菌 株 Asp flavus 为 模 型 菌 株, 将 槟 榔 药 材 浸 染 该 菌 株 后 进 行 储 藏, 采 用 响 应 面 分 析 (ResponseSurfaceAnalysis, RSA) 法 结 合 CentralComposite 设 计, 设 定 槟 榔 储 藏 的 不 同 温 度 和 湿 度 条 件, 研 究 该 菌 株 在 药 材 上 的 的 生 长 及 产 毒 情 况 并 采 用 超 高 效 液 相 色 谱 串 联 质 谱 法 (UFLC ESI MS/MS 法 ) [20] 对 储 藏 后 的 槟 榔 药 材 中 4 种 黄 曲 霉 毒 素 (AFB 1,AFB 2,AFG 1 和 AFG 2 ) 进 行 测 定, 分 析 黄 曲 霉 毒 素 的 产 生 与 储 藏 环 境 的 温 度 和 湿 度 条 件 的 关 系, 探 讨 槟 榔 不 易 霉 变 产 毒 的 环 境 条 件, 为 其 最 佳 储 藏 规 范 的 制 定 及 降 低 真 菌 毒 素 污 染 的 概 率 提 供 理 论 及 数 据 支 持 依 据 1 材 料 与 方 法 1 1 供 试 菌 株 及 培 养 基 黄 曲 霉 菌 株 冻 干 粉 (As pergilusflavus,cgmcc3 4410) 购 买 于 中 国 普 通 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 察 氏 培 养 基, 购 自 北 京 奥 博 星 生 物 技 术 有 限 责 任 公 司 1 2 仪 器 和 材 料 LC 30AT 超 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 日 本 岛 津 公 司 );QTRAP 质 谱 仪 (ABSCIEX 公 司 ); KQ 500 超 声 仪 ( 昆 山 市 超 声 仪 器 有 限 公 司 );MJX 智 能 型 霉 菌 培 养 箱 ( 宁 波 江 南 一 仪 器 厂 ); 电 热 恒 温 鼓 风 干 燥 箱 ( 北 京 利 康 达 圣 科 技 发 展 有 限 公 司 ); 黄 曲 霉 毒 素 G 2 G 1 B 2 和 B 1 混 合 标 准 品 溶 液 ( 黄 曲 霉 毒 素 G 2 G 1 B 2 B 1 浓 度 分 别 为 μg ml -1, 新 加 坡 Pribolab 公 司 ),4 种 黄 曲 霉 毒 素 的 结 构 见 图 1; 槟 榔 药 材 购 自 河 北 安 国 药 材 市 场, 经 中 国 医 学 科 学 院 药 用 植 物 研 究 所 林 余 霖 教 授 鉴 定 ; 甲 醇 和 乙 腈 ( 色 谱 纯, 美 国 Honeywel 公 司 ); 娃 哈 哈 饮 用 纯 净 水 ( 杭 州 娃 哈 哈 集 团 有 限 公 司 ), 吐 温 20( 分 析 纯, 西 陇 化 工 股 份 有 限 公 司 ) 图 1 四 种 黄 曲 霉 毒 素 的 结 构 图 1 3 实 验 方 法 A flavus 菌 株 的 培 养 A flavus 菌 株 的 复 苏 将 A flavus(3, 4410) 冻 干 菌 种 管 外 壁 用 75% 乙 醇 棉 擦 净, 待 干 点 燃 酒 精 灯, 将 菌 种 管 的 封 口 一 端 在 火 焰 上 烧 灼 红 热, 用 灭 菌 毛 细 滴 管 吸 取 适 量 无 菌 水, 滴 在 灼 热 的 菌 种 管 封 口 一 端, 使 骤 冷 而 炸 裂 ; 然 后 在 火 焰 旁, 用 灭 菌 后 的 镊 子 将 炸 裂 的 管 口 打 开, 另 取 1 支 灭 菌 毛 细

3 世 界 中 医 药 2015 年 8 月 第 10 卷 第 8 期 1131 滴 管, 在 火 焰 旁 吸 取 液 体 察 氏 培 养 基 少 许, 加 至 菌 种 管 底 部, 充 分 搅 动 溶 解, 随 即 吸 出 管 内 菌 液, 接 种 至 PDA 斜 面 培 养 基 内, 编 号 标 记 后 移 入 恒 温 培 养 箱,28, 培 养 7d 孢 子 混 悬 液 的 制 备 A flavus 菌 株 复 苏 后 接 种 于 察 氏 培 养 基, 待 孢 子 萌 发 后, 加 入 适 量 无 菌 的 1% 吐 温 20 溶 液, 用 无 菌 接 种 环 将 琼 脂 表 面 的 孢 子 轻 轻 刮 下, 将 悬 浮 液 置 于 已 灭 菌 的 三 角 瓶 ( 内 置 无 菌 玻 璃 球 ), 充 分 振 摇 然 后 用 灭 菌 脱 脂 棉 过 滤, 并 用 1% 吐 温 20 溶 液 清 洗 滤 渣 2 ~3 次, 得 孢 子 悬 浮 液 继 续 将 悬 浮 液 稀 释, 并 吸 取 适 量 的 稀 释 液 小 心 置 于 血 球 计 数 板 (25 16) 的 计 数 室 内, 盖 上 盖 玻 片, 静 置 5min, 在 显 微 镜 下 计 数 调 节 浓 度 至 10 6 CUF ml -1 (CUF:ColonyUnitForm ing, 菌 落 数 ), 得 浓 度 为 10 6 孢 子 /ml 的 A flavus(cg MCC3 4410) 孢 子 混 悬 液 色 谱 和 质 谱 条 件 色 谱 柱 为 SHISEIDOCap celcorec 18 (50mm 2 1mm,2 7μm) 柱 ; 流 动 相 为 乙 腈 含 0 1% 甲 酸 (A 相 ) 0 1% 甲 酸 水 (B 相 ), 梯 度 洗 脱 程 序 如 下 :0 1 5min,A 相 从 15% 升 至 20%; min,A 相 从 20% 升 至 95%, min,A 相 保 持 90%; min,A 相 瞬 间 回 到 15% 的 起 始 浓 度 并 保 持 2min 柱 温 :30 ; 进 样 量 :2μL; 流 速 :0 30mL min -1 以 三 重 四 级 杆 质 谱 仪 作 为 检 测 器, 检 测 方 式 为 多 反 应 监 测 (MRM), 正 离 子 模 式 电 喷 雾 离 子 源 (ESI), 源 温 度 为 550, 离 子 喷 雾 电 压 为 5500V; 气 帘 气 (CUR) 为 35psi;; 雾 化 气 (GS 1 ) 为 55psi; 辅 助 加 热 气 (GS 2 ) 为 55psi; 碰 撞 气 (CAD) 为 Medium 各 真 菌 毒 素 的 监 测 离 子 对 (m/z) 和 其 他 详 细 参 数 见 表 1 表 1 4 种 黄 曲 霉 毒 素 的 UFLC ESI MS/MS 检 测 参 数 Analyte Retention Precursor Molecular Product time(min) ion(m/z) ion ions a (m/z) DPb EP b CE b CXP b AFG [M+H] (Q) (q) AFG [M+H] (Q) (q) AFB [M+H] (Q) (q) AFB [M+H] (Q) (q) 注 : a Productions:(Q)transitionusedforquantification,(q)transitionem ployedtoconfirm; b DeclusteringPotential(DP),EntrancePotential(EP),Colision Energy(CE)andColisionCelExitPotential(CXP) AlexpresedinV 样 品 制 备 精 密 称 取 2 00g 槟 榔 样 品 粉 末, 精 确 至 0 01g, 置 于 10mL 离 心 管 中, 精 密 加 入 5mL 甲 醇 水 (80 20,v/v), 涡 旋 3min 后,12000r/min 离 心 5min, 准 确 吸 取 2 5mL 上 清 液, 然 后 加 入 甲 醇 水 (50 50,v/v) 定 容 至 5mL, 过 0 22μm 有 机 滤 膜, 转 入 进 样 瓶, 进 样 2 0μL 按 项 下 条 件 进 行 检 测 基 质 校 正 的 标 准 曲 线 的 建 立 选 取 不 含 真 菌 毒 素 的 槟 榔 作 为 空 白 样 品, 按 样 品 制 备 方 法 制 备 空 白 基 质 溶 液, 添 加 不 同 量 的 黄 曲 霉 毒 素 G 2 G 1 B 2 和 B 1 混 合 标 准 品 溶 液, 配 制 成 一 系 列 浓 度 的 混 合 对 照 品 溶 液 (AFG 1 AFB 1 的 质 量 浓 度 为 0 5,1,2,5,10,20,40,50ng/mL;AFG 2 AFB 2 的 质 量 浓 度 为 0 125,0 25,0 5,1 25,2 5,5,10,12 5ng/ ml), 分 别 进 样 2μL, 记 录 峰 面 积, 以 待 测 化 合 物 色 谱 峰 峰 面 积 (Y) 为 纵 坐 标, 进 样 浓 度 (X,ng ml -1 ) 进 行 线 性 回 归, 计 算 得 到 回 归 方 程 Design Expert 实 验 设 计 采 用 Design Expert V8 0 6 软 件 结 合 CentralComposite 设 计, 同 时 考 察 温 度 和 湿 度 两 个 环 境 因 子 对 槟 榔 储 藏 的 影 响, 因 素 水 平 设 计 见 表 2 将 槟 榔 样 品 按 项 处 理, 然 后 按 项 下 色 谱 和 质 谱 条 件 进 行 检 测, 确 定 槟 榔 样 品 为 阴 性 ( 即 不 含 AFs) 每 个 培 养 皿 里 选 取 约 50g 槟 榔 平 铺 于 培 养 板 底 部, 紫 外 (265nm) 照 射 灭 菌 1h 后 准 确 加 入 1 0mL 浓 度 为 10 6 孢 子 /ml 的 A flavus(cgm CC3 4410) 孢 子 悬 液 然 后 将 样 品 按 表 2 设 置 的 条 件, 置 于 霉 菌 培 养 箱 中 培 养 10d, 定 时 观 察 霉 菌 生 长 情 况 10d 后 取 出, 将 培 养 皿 置 于 超 净 台 中 紫 外 灭 菌 1h 后 取 出 槟 榔 药 材 收 集 于 自 封 袋 中, 备 用 表 2 CentralComposite 设 计 对 温 度 和 湿 度 的 设 置 表 Tests Factor1A:Tem Factor2B:Hum 水 分 的 测 定 按 照 中 国 药 典 (2010 版 一 部 ) 附 录 Ⅸ H 水 分 测 定 法 第 一 法 ( 烘 干 法 ), 对 槟 榔 原 药 材 和 培 养 后 的 槟 榔 药 材 进 行 水 分 的 测 定, 记 录

4 WORLDCHI NES EMEDI CI NE A V N 槟榔药材培养后水分含量的变化 与峰面积呈现良好的线性回归方程及相关系数如 样品前处理及 AF测定 将培养后的槟榔 相 关 系 数 为 下 AFB 药材按 项 对 样 品 进 行 处 理然 后 按 AFB 相关系数为 项下色谱和质谱条件对 AF AFB AFB AFG 相关系数为 AFG 和 AFG 进行检测依据 建立的基质 AFG 相关系数 校正的标准曲线计算不同条件下培养后的槟榔药材 为 其中 浓度 ml 峰面积 中 AF的总量 不同储藏环境下 A 菌株与总黄曲霉毒 结果与讨论 素的 量 间 关 系 将 培 养 并 收 集 的 槟 榔 样 品 按 响 应 面 法 研 究 A 菌 株 产 毒 情 况 将 项下色谱和质谱条件对 AF AFB AFB A CGMCC 孢 子 接 种 于 槟 榔 药 材 表 AFG 和 AFG 进行检测依据建立的基质校正的回 面在表 设计的条件下进行培养观察 A 菌 归方程计算不同条件下 AF的总量 以测得的黄曲 株在槟榔药材上的生长情况 在温度 湿度 值绘制响应面曲线和等高 霉毒素总量为 R 条件下培养 和 后A 生长情况 线图如图 结果可见湿度对 A 菌株产生 如图 所示 结果可见培养 后药材逐渐转 黄曲霉毒素的影响大于温度当湿度范围为 变成墨绿色同时丰富的菌丝将槟榔样品紧紧包裹 温度高于 时A 菌株在槟榔中生长 孢子在槟榔基质中迅速的生长繁殖 表明 A 较快并产生大量黄曲霉毒素 在相同湿度条件下 储藏温度越低药材中黄曲霉毒素含量越低 而温度 越高A 菌株产生黄曲霉毒素所需的湿度条件 越低 因此我们建议槟榔药材的储存条件为湿度 小于 温度低于 图 A 菌株接种并在温度 湿度 条件 培养 和 后的槟榔药材图 储藏期间槟榔水分变化 如图 所示不同储 藏条件下培养后的槟榔药材水分含量较室温下储藏 的原药材都有明显的增加且受温度和湿度两个因 素的综合影响 相同温度条件下培养过程中湿度 高者水分含量高 相同湿度条件下培养过程中温度 高者水分含量较低原因可能为高温使槟榔中水分 挥发但湿度对药材中水分含量变化的影响更为显 著 而据文献报道 水分含量是影响真菌生长 及产毒的最关键因素之一因此建议将槟榔储藏在 较低的湿度中降低药材水分含量从而抑制真菌的 生长及产毒 图 不同储藏环境的响应面曲线图和等高线图 小结 真菌毒素污染问题是中药储藏过程中一个亟需 解决的问题通过控制储藏环境条件来控制产毒菌 的生长和产毒是一个高效易行的方法 本研究表 明槟榔中 A 菌株的生长和产毒受环境中的 温度和湿度的双重影响而湿度对 A 菌株生 长产毒的影响较温度大 较低的温度和湿度可显著 降低 AF的含量 本研究所用的响应面法是目前较 为先进的实验设计及分析方法实验测定及数据分 析表明应用该方法研究真菌产毒条件是科学可行 的为控制真菌毒素造成的中药材污染提供了一个 新的思路 参考文献 牟肖男杨文强王文婧等槟榔的化学成分 暨南 大 学 学 图 不同储藏环境中槟榔水分含量的变化 基质校正的回归方程 各黄曲霉毒素的浓度 报 自然科学与医学版 下接第 页

5 WORLDCHI NES EMEDI CI NE A V N 王彦涵张寿州高建平等从叶绿体 DNA L序列分析探讨 复旦学报 自然科学版 五味子科的系统发育 Sm ACT m I S S N TF MJ F E m S 孙成仁五味子科植物花粉形态及其系统学意义 植物分类 学报 孙成仁五味子科植物种子表面微形态及其系统学意义 植 S m B M 林祁杨志荣五味子属 五味子科 分类系统的初步修订 植物研究 杨志荣林祁刘长江等五味子属种子形态及其分类学意义 云南植物研究 文香英林祁曾庆文等中国五味子属植物叶表皮研究 生命科学研究 S RM KM K S S m B M 林祁南五味子属 五味子科 一些种类的分类学订正 植物 研究 物分类学报 收稿 责任编辑 洪志强 S RM KM S S 上接第 页 L mdyk mi SA m m A P m S 中华本草 第八册 M上海 上海科学技术出版社 C Y S RSU UAE A L m m m I F S Em A 李峻媛万丽杨美华真菌毒素限量标准及其在中药中的研究 进展 中草药 宫春波姜连芳张永翠黄曲霉毒素在食品中的危害及去除方 法 食品研究与开发 陈丽星真 菌毒 素 研究 进 展 河 北 工业 科 技 张雪辉中药中黄曲霉毒素检测方法研究及模式识别在中药领 域的应用 D北京 中国协和医科大学 Y MHC J MZ XHI mm m B AMK ADV w NS P q m w m mm C m C m A L F C mt 国家药典委员会中华人民共和国药典 一部 S北京 中国 医药科技出版社 W J K WJ HYC M m UHPLC FLR LC MS MS m F C H PLC CWL TYE A L 刘书宇仇峰杨美华免疫亲和柱净化 在线柱后光化学衍生 HPLC FLD检测莲子中黄曲霉毒素 BBGG 及其液质确 F C mt 郑锦星李忠海袁列江等槟榔生理效应研究进展 食品科 技 刘峰良赵志辉谢晶谷物中真菌毒素的研究进展 广东农 业科学 蔡静平黄淑霞张晓云等仪器法快速检测储粮霉菌的可靠 性研究 粮食储藏 李瑶瑶杨相政李喜宏不同贮藏条件对槟榔品质的影响 中国果菜 D MDB SDB P Q m m m m m m m q m m m m m JC m 证 中国中药杂志 L QTK W J G WY M m A q m w mm m JC m B M KS M M NR w m m w m m w F m F A C m K M K NT E T P A 收稿 责任编辑 洪志强

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