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1 应用新型扫描型四极杆的DIA法进行系统生物学研究的方法优化 Chris Hughes Keith Richardson Jason Wildgoose Johannes PC Vissers 和 James I Langridge 沃特世公司(英国威姆斯洛) 概述 简介 优化了SONAR 扫描型四极杆DIA的系统方 SONAR是一种新型DIA操作模式 可同时提供定性和定量信息 被应 将这一新型DIA采集方法的定性和定量性能特 然后介绍了如何通过优化分析参数(例如上样量 扫描四极杆分离窗 法和参数 用于混合型四极杆/飞行时间(Q-ToF) MS 本文阐释了其采集原理 异性和选择性相关的参数进行了表征 包括分 口 扫描速度和依赖m/z范围的碰撞能量梯度)在复杂蛋白质组学样品 介绍了可在最宽的定量动态范围内提供更高覆 细研究了这些参数对定性和定量性能的影响 我们采用发现和靶向信息 作为母离子m/z和保留时间的函数进行了优 复杂蛋白质酶解样品 析速度(梯度) 柱上进样量和扫描时间 的分析中获得最佳的定性和定量覆盖率 此外还从样品消耗量的角度详 盖率的扩展型多步SONAR (将碰撞能量梯度 学工具分析和评估了来自大肠杆菌(E.coli) 血浆和两个人类细胞系的 化) 图.Xevo G-XS QTof 质谱仪示意图 如需下载此海报纪要副本 请访问

2 方法 样品制备 采用含四种蛋白质酶解物的混合标准品(沃特世公司) 大肠杆菌胰蛋白酶酶解物样品(沃特世公司) Hela 细胞裂解物的酶解物样品(Pierce)以及K56细胞系样品(Promega)进行方法优化和评估 血浆样品购自 Innovative Research Inc LC-MS条件 采用无标记LC-MS方法进行肽的定性和定量分析 实验条件如下 采用乙腈(含.%甲酸)从%升至 4%的多种反相梯度 流速 nl/min 使用M-Class系统(沃特世公司)和HSS.8 µm 75 µm 5 cm纳升级lc色谱柱 此外 在7 µl/min的流速下使用csh µm cm色谱柱进行分析 如图所示的Xevo G-XS QToF(沃特世公司)在SONAR模式下运行 进行肽分析时采用的优化四极杆 窗口和其它参数如图所示 使用连续扫描四极杆采集质谱数据 该四极杆可在oa-ToF之前选择特定的 m/z范围 交替的MS扫描能够分别包含母离子和CID产物离子 生物信息学分析 SONAR DIA数据使用Scaffold (Proteome Sciences) Progenesis QI for Proteomics (PQIp Nonlinear Dynamics)和ProteinLynx GlobalSERVER(沃特世公司) 采用经过优化的阈值和搜索参数 进行数据处理 靶向定量分析由Skyline(华盛顿大学) 使用源自PQIp和PLGS蛋白质数据库搜索的结果 作为谱图库分析 多维数据进行可视化利用DriftScope(沃特世公司)或其他第三方软件 碰撞能量 (C) (A) 分离周期 = ToF cycle time ToFcycles /bin 约- ms 四极杆质量数 Final Nested Quad TOF数据集 m/z 四极杆入口 不同m/z 的共 洗脱肽 图.SONAR TM DIA方法和采集参数 展示了(A) ADC采集时间刻度 (B)四极杆扫描以及(C)采集方法(CE随着四极杆m/z的增加逐渐升高) 四极杆m/z 传 输窗口 T Trans 四极杆出口 (B) 不同m/z 的共洗脱肽 时间或四极杆设置质量数

3 结果 特异性 该方法的特异性如图至图5所示 图中显示了母离子与碎片离子之间 的联系 以及特异性增益与宽带DIA(MSE)的对比 图是以三维视角 展示的数据 由图可见 碎片离子很容易鉴别 因为它们驻留在与其 四极杆质量数 (Da) Quad Window (Da) 初始母离子相同的m/z bin处 图4也能证明此结论 图中显示了一种 全部选中 MSE 保留时间 (min) 胰蛋白酶肽的母离子(上图)和碎片离子(下图)四极杆扫描谱图 图5还 详细展示了净化之后的谱图 图中比较了SONAR DIA的子离子谱图 MSE 与宽带DIA (MSE)谱图 图5.SONAR TM DIA的特异性改善 图中显示了一小块包括种共洗脱肽 的产物离子区域(左上方) 可从该区域中提取出单独的谱图(右图下方的 条迹线)以及DIA (MS E)等效谱图(右图顶部的谱图) 左下方的谱图显示 了一个存在两个相近的同量异位碎片m/z(488 amu)的小区域 使用 SONAR可以分离它们并去除干扰 四极杆质谱 图.SONAR DIA ToF和四极杆m/z数据 显示了在 min的时间窗口内 洗脱的肽的产物离子(垂直带)和四极杆扫描数据(对角线) TM 分离窗口 梯度和工作周期 我们考察和优化的分析参数包括柱上进样量 四极杆分离窗口 多 步m/z采集模式和施加的碰撞能量 该评估的结果如图6至图8所 示. 蛋白质鉴定结果的相对数量 图4.4种蛋白质酶解混合物的SONAR DIA ToF数据对四极杆m/z母离子 (A)和碎片离子(B)数据所作的二维图 以及肽段VIELQGIAGTSAAR(来自 RBSB_ECOLI (P95))的重构四极杆谱图 5 5 上样量(ng) 5 图6.在不同的扫描四极杆传输窗口(蓝色= Da 红色= Da 且绿色 =8 Da)下 SONAR DIA Hela细胞蛋白质鉴定结果对上样量所作的 图 分析复杂程度各异的其它样品(包括血浆样品和大肠杆菌裂解物样品) 时得到的最佳结果也与此类似

4 图6和图7所示的结果展示了灵敏度和选择性之间的平衡 二者将定 多步SONAR DIA 性搜索结果和离子流分别作为蛋白质酶解物上样量和四极杆分离窗 图9至图展示了将碰撞能量按照母离子m/z和保留时间进行优化 口的通道 在较小的分离窗口内 灵敏度和工作周期是关键因素 以实现最高覆盖率的可能性 图9显示了不同的保留时间区域 这 而在过宽的四极杆窗口内 特异性又成为了限制数据库搜索的因 些区域具有不同的m/z范围和碰撞能量(即根据疏水性分区) 本研 素 在后一种情况下 我们首选靶向数据分析方法 如图7中的结果 究评估的碰撞能量梯度汇总于图中 结果概览如图所示 结 所示 当通量增加时 缩短扫描时间变得非常关键 不仅从精度的 果表明 多步方法能够将覆盖率及后续的定量精度提高%以上 角度来看如此 对于定性鉴定而言也不例外 工作周期延长 选择性提高 图8.SONAR DIA大肠杆菌蛋白质鉴定率(灰色)和总离子流值(蓝 色)对蛋白质上样量和四极杆分离窗口(分格)所作的图 图9.6 µg K56细胞系样品的SONAR DIA分析结果 以鉴定出的母离 子m/z(仅 +)对LC保留时间(内径 µm 梯度45 min)作图 该图 中显示了5个还可进一步优化m/z和CE的区域 四极杆扫描(Da) 碰撞能量(V) B C D E 区域 A 蛋白质鉴定结果的相对数量.%.% 8.% 6.% min gradient 图. SONAR DIA多步实验设计 多步SONAR DIA允许采用不同 的质量数范围以及不同的碰撞能量 所有其它参数(即TOF质量数范围 积分时间和四极杆分离宽度)都与单步实验保持一致 45 min gradient 4.%.%.% ToF积分时间(s) 图7.采用极快的LC梯度(考虑到Hela细胞样品的复杂性)所得的 SONAR DIA Hela蛋白质鉴定结果对ToF积分时间所作的图 我们预计鉴定结果与图6所示的数据相比应相对减少 但是在45 min(红色)和 min(蓝色)梯度的.5 s处均出现了最高值 这 表明将峰宽与扫描时间相匹配对于后处理和定量测定很重要(即欠 采样) 4

5 结论 SONAR DIA采集可提供多维数据集 相较于其它DIA方 法具有更高的特异性 组学实验的SONAR 采集参数(即四极杆分离窗口与柱上进 相对丰度(%) 样量 扫描和梯度时间)以及多步实验均可轻松确定 有助于 5 A B C D 实现最佳的定性和定量性能 E SONAR DIA可应用于发现和靶向组学研究 包括代谢组 学 脂类组学和蛋白质组学 后续研究将包括旨在考察研究靶向离子提取获得最大覆盖 率 以及定量精度和通量研究 时间 (min) 图.经多步SONAR DIA(m/z 碰撞能量)优化的重构XIC 插图显示 了多步方法鉴定出的肽数量与单步方法相比的相对增加量(%) 开源信息学工具 图显示了使用Skyline对SONAR DIA数据进行定量分析的结 参考文献. JL Wildgoose, K Richardson and M Green, Two Dimensional MS-MS on a Q-Tof Utilising a Scanning Quadrupole Mass Filter and an Ultra Fast Data Acquisition System, ASMS 5, poster WOx 476 果 按顺时针方向分别显示了碎片离子XIC 搜索数据得到的相应谱 库条目 产物离子的多维提取图(y轴为四极杆 x轴为tof m/z)以及 动态范围涵盖个数量级的5点校准曲线 展示了定量性能 图.靶向分析 将4种蛋白质的酶解混合物加标至大肠杆菌基质中并连续 稀释 对所得样品进行分析得到的保留时间 四极杆m/z(母离子)和ToF m/z(产物离子)离子提取和检测结果 6年 沃特世公司 5

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