实验 样品描述 七种脂溶性维生素 : 视黄醇乙酸盐 ( 维生素 A 乙酸盐 ) 视黄醇棕榈酸盐 ( 维生素 A 棕榈酸盐 ) α- 生育酚 ( 维生素 E) α- 生育酚乙酸盐 ( 维生素 E 乙酸盐 ) 麦角骨化醇 ( 维生素 D2) 维生素 K1 维生素 K2 (MK-4); 及两种胡萝卜素 :

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1 Rui Chen Jinchuan Yang 和 John McCauley 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势 同时分离九种脂溶性维生素及胡萝卜 素, 可避免使用多种 HPLC 方法, 并且可减少在对膳食补充剂和营养强化食品中的脂溶性维生素进行定性与定量分析时所需要进行的实验步骤 快速分离疏水性维生素及胡萝卜素可 显著提升样品通量以及减少实验花费, 因而可满足日益增加的法规依从性需求, 以监测大量的分析工作 引言脂溶性维生素 (FSV) 包括维生素 A D E K 及类胡萝卜素 ( 例如 β- 胡萝卜素 ) 脂溶性维生素参与许多与重要生理功能相关的复杂代谢反应, 例如视力 ( 维生素 A) 钙吸收( 维生素 D) 细胞膜的抗氧化( 维生素 E) 及血液凝固( 维生素 K) 1 β- 胡萝卜素是维生素 A 的前体, 且在人体内具有 100% 维生素 A 活性 番茄红素不是人体的必需营养素, 但它的抗氧化性能使它广受欢迎, 越来越多地与其他成分一起被添加到某些膳食补充剂中 几种脂溶性维生素的化学结构如图 1 所示 H 维生素 A 乙酸盐 LogP=4.92 维生素 D2 LogP=7.04 维生素 A 棕榈酸盐 LogP=11.0 H 维生素 E,LogP=9.98 维生素 E 乙酸盐 LogP=9.95 沃特世提供的解决方案 配备光电二极管阵列 (PDA) 检测器的 ACQUITY UPC 2 系统 胡萝卜素,LogP=10.68 维生素 K1 LogP=8.72 Empower 3 软件 ACQUITY UPLC HSS C 18 色谱柱 番茄红素,LogP=11.11 维生素 K2(MK-4) LogP=7.30 图 1 本研究中所使用的脂溶性维生素的化学结构以及 LogP 值 关键词维生素 胡萝卜素 脂溶性 维生素 A 乙酸盐 维生素 A 棕榈酸盐 维生素 D 2 α- 生育酚 维生素 E 乙酸盐 维生素 K 1 维生素 K 2 番茄红素 β- 胡萝卜素 合相色谱分离术 UPC 2 维生素及营养补充剂是一个价值几十亿的市场 预计在未来的五到十年, 这一市场仍将继续增长 2 这是由于全世界的消费者越来越追求更好以及更健康的生活方式, 以及越来越注重健康以及饮食习惯 然而, 人们也越来越关注从营养补充剂以及营养强化食品中所摄取的脂溶性维生素的安全性问题, 特别是维生素 A 及 D, 若过量食用, 也会带来严重的健康风险 3 由于在许多国家, 许多 1

2 实验 样品描述 七种脂溶性维生素 : 视黄醇乙酸盐 ( 维生素 A 乙酸盐 ) 视黄醇棕榈酸盐 ( 维生素 A 棕榈酸盐 ) α- 生育酚 ( 维生素 E) α- 生育酚乙酸盐 ( 维生素 E 乙酸盐 ) 麦角骨化醇 ( 维生素 D2) 维生素 K1 维生素 K2 (MK-4); 及两种胡萝卜素 : 番茄红素及 β- 胡萝卜素均购自西格玛公司 (Sigma Aldrich), 并且未经处理直接使用 将所有样品以约 0.1 mg/ml 的溶解到甲基第三丁基醚 (MTBE) 中, 并转移到进样瓶中, 准备进行分析 UPC 2 条件 系统 : 配备 PDA 检测器的 ACQUITY UPC 2 流速 : 1 ml/min 流动相 A: C2 流动相 B: 乙腈 色谱柱 : ACQUITY UPLC HSS C x 100 mm,1.8 m 背压 : 2500 psi 柱度 : 30 C 样品稀释剂 : MTBE 进样量 : 1 L 样品瓶 : 沃特世玻璃瓶 12 x 32 mm 螺 纹颈瓶,2 ml PDA 扫描范围 : nm 数据管理 : Empower 3 软件 梯度 : 针对营养强化食品及膳食补充剂中所添加微量元素的合规性的法律正在拟定或制定中, 因此, 市场上必然对能够快速 准确地分析不同产品中的脂溶性维生素含量的分析方法有更高的需求 目前, 在进行 FSV 分离时, 最常使用的是液相色谱 (LC) 方法, 反向 (RP) 与正向 (NP) 方法均有 1,3-5 虽然有 AAC 法可用于对食品及营养补充剂当中的各种脂溶性维生素分别进行定性与定量分析, 但却缺少一种可对维生素预混物中的脂溶性维生素以及类胡萝卜素同时进行分析的方法 3 由于超高效合相色谱 (UPC 2 ) 分离速度快 经济耐用, 因此可考虑将其用于对含有多种脂溶性维生素的药物制剂进行快速分析 6 在本应用纪要中, 我们阐述了一种单次进样方法, 它可在四分钟时间内同时分离九种脂溶性维生素 优化后的方法在保留时间以及峰面积方面具有良好的重现性, 且可用于进行高通量定量分析 结果与讨论已有大量文献阐述了利用 NPLC 及 RPLC 分离脂溶性维生素以及类胡萝卜素的方法 1,3-5 由于在分析脂溶性维生素时, 通常需要使用低极性有机溶剂来溶解样本, 因此 NPLC 由于其与有机溶剂的相容性而具有一定优势, 可允许直接进样脂溶性维生素或脂溶性维生素萃取物, 而不需要进行蒸发步骤 RPLC 法的色谱分离效率虽然高于 NPLC, 7 但由于以下几点原因, 阻碍了其在进行 FSV 分析上的应用 :1) 分析物在流动相中溶解度较低,2) 对 FSV 的保留力强, 导致运行时间过长 最终, 人们选择使用半水性流动相 ( 甲醇或乙腈与水的混合物 ) 或非水性流动相 ; 后者也称为非水性反相 (NARP) LC 7-8 UPC 2, 虽然常作为正相分离技术, 但也同样适用于分离极性较低的分析物 UPC 2 的主流动相 C2 不仅是低极性分析物的良好溶剂 ( 与己烷的极性相近 ), 也可与在样品分离过程中用于溶解这些分析物的有机溶剂 ( 例如本研究中所使用的 MTBE) 相同 此外,C2 的低极性也可促进分析物与流动相之间的非极性相互作用, 从而缩短保留时间和运行时间 时间 (min) B%

3 在进行方法开发时, 共选用了六种色谱柱 :ACQUITY UPLC HSS T3 ACQUITY UPLC HSS C18 ACQUITY UPC 2 HSS SB ACQUITY UPC 2 CSH 氟苯基 ACQUITY UPC 2 2- 乙基吡啶 及 ACQUITY UPC 2 BEH, 以及四种溶剂, 包括 : 异丙醇 (IPA) 乙腈(ACN) 乙醇 及 IPA/ACN 的 1:1 混合液 只有使用 ACQUITY UPLC HSS C18 色谱柱以及 ACN 的方法才可将非常相似的维生素 K1 以及 K2 分离 采用较低的柱温,30 C, 原因如下 : 首先, 为了提高 K1 与 K2 的选择性 ; 其次, 为了最大限度地减少胡萝卜素在色谱柱上的降解, 因为胡萝卜素非常容易氧化 经方法优化后所得的每种成分的色谱图以及 UV 谱分别如图 2 及 3 所示 大体上, 九种脂溶性维生素的洗脱顺序与它们的 LogP 值排序相同 利用低乙腈含量 (2%) 的流动相就可将七种维生素全部洗脱出来, 而两种胡萝卜素则需要使用含 20% 乙腈的流动相才可洗脱出来 这一现象, 可由分析物的结构以及它们与流动相 / 固定相之间的相互作用来解释 在九种分析物中, 均存在 C2 与脂溶性维生素亲脂性基团之间的非极性相互作用, 而七种维生素中的氧原子 ( 呈羰基或羧基的形式 ) 使得分析物与流动相中的乙腈之间产生极性相互作用, 这样就减少了溶离时间 而两种胡萝卜素分子不含有杂原子, 且分子中的非极性十八烷基碳链更容易与固定相形成较强的相互作用, 因而其溶离时间更长 维生素 A 乙酸盐 维生素 E 乙酸盐 K 2 K 1 E D 2 维生素 A 棕榈酸盐 番茄红素 β- 胡萝卜素 分钟 图 2. 其中脂溶性维生素与两种类胡萝卜素的 UPC 2 /UV 谱图 3

4 nm 图 3. 其中脂溶性维生素以及两种类胡萝卜素的 UV 谱图 ( 按照其溶离时间从上到下分别出示 ): 维生素 A 乙酸盐 维生素 E 乙酸盐 维生素 K2 K1 E D2 维生素 A 棕榈酸盐 番茄红素 及 β- 胡萝卜素 4

5 为了测试本方法的重现性, 将九种脂溶性维生素分别进行六次进样, 如图 4 所示 重现性统计数据已概括在表 1 中 保留时间的相对标准差 (RSDs) 小于 0.25% 在峰面积方面, 九种脂溶性维生素中, 有七种的 RSDs 小于 1% 第一个峰( 维生素 A 乙酸盐 ) 的 RSD 稍大, 这是因为随着进样次数的增加, 基线有所上升 不管怎样, 重现性都应满足质量监测的要求, 其通常要求某一测试方法的重现性公差为 ±20% 分钟 图 4. 六次进样所得 UPC 2 /UV 谱图的叠加图 维生素 A 维生素 E 维生素 A 乙酸盐醋酸酯 K 2 K 1 E D 2 棕榈酸盐 番茄红素 β- 胡萝卜素 保留时间 0.239% 0.199% 7% 0.178% 0.217% 0.249% 0.192% 0.115% 0.141% 峰面积 2.7% 1.0% 0.7% 0.6% 0.9% 0.6% 0.8% 1.8% 0.9% 表 1. 七种脂溶性维生素与两种类胡萝卜素的保留时间以及 UV 峰面积的 %RSD (n=6) 5

6 结论在本应用纪要中, 我们阐述了利用单次进样 UPC 2 法, 在四分钟内, 将九种脂溶性维生素同时分离的方法 经过六次重复进样得知, 九种物质的保留时间的 RSD 均小于 0.25%, 峰面积的 RSD 均小于 3%( 在大多数情况下 <1%) 使用 UPC 2 方法, 只需进行一次进样就可将混合物中的各种脂溶性维生素分析完毕, 而不需要像 LC 法那样进行多次操作, 从而极大地减少了实验室的工作量 UPC 2 方法所需时间是传统分析方法的四分之一至十分之一 由于 UPC 2 分析法分析速度较快, 因此适于食品企业 / 营养补充剂企业等分析量通常较大的法规依从性监测 参考文献 1. Santos J, Mendiola JA, liveira MBPP, Ibanez E, Herrero M. Sequential determination of fat- and water-soluble vitamins in green leafy vegetables during storage. J. Chromatogr. A. 2012; 1261: Blake CJ. Status of Methodology for the Determination of Fat-Soluble Vitamins in Foods, Dietary Supplements, and Vitamin Premixes, J. AAC Inter. 2007; 90(4): Gomis DB, Fernandez MP, Gutierrez Alvarez MD. Simultaneous determination of fat-soluble vitamins and provitamins in milk by microcolumn liquid chromatography, J. Chromatogr. A. 2000; 891: Salo-Vaananen P, llilainen V, Mattila P, Lehikoinen K, Salmela-Molsa E, Piironen V. Simultaneous HPLC analysis of fat-soluble vitamins in selected animal products after small-scale extraction, Food Chem. 2000;71: Aubin A. Analysis of fat-soluble vitamin capsules using UltraPerformance Convergence Chromatography. Waters Application Note en June. 7. Nelis HJCF, De Roose J, Vandenbaviere J, De Leenheer AP. Non-aqueous reversed-phase liquid chromatography and fluorimetry compared for determination of retinol in serum. Clin. Chem. 1983; 29(7): Parris NA. Non-aqueous reversed phase liquid chromatography: a neglected approach to the analysis of low-polarity samples. J Chromatogr. 1978; 157: Waters ACQUITY UPLC 和 Empower 是沃特世公司的注册商标 UltraPerformance Convergence Chromatography ACQUITY UPC 2 UPC 2 及 The Science of What s Possible 是沃特世公司的商标 其他所有商标均归各自所有者所有 2013 年沃特世公司中国印制 2013 年 1 月 ZH AG-PDF (400)

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ZH Jacquelyn Runco, Lakshmi Subbarao, 和 Rui Chen 沃特世公司, 美国马萨诸塞州米尔福德 应用优势 利用 UPC 快速分离三种最常见的类 胡萝卜素的方法, 可最大限度地减少类胡萝卜素的降解 UPC 方法所需分离时间仅为传统分 析方法的四分之一, 因此有机溶剂使用量可减少 85% 在进行目标分析时, 可将在甲基叔 丁基醚中萃取的 β- 胡萝卜素直接进样 ACQUITY

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