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Transcription

1 与耐药机制有关药敏试验 的规范化 卫生部北京医院陈东科

2 前言 细菌耐药已成为一个全球性问题, 已对人类健康构成严重威胁 耐药细菌感染导致病人住院时间延长 费用增加 死亡率增高, 同时也给临床医生抗感染治疗带来困难 因此, 检测细菌耐药机理是当今细菌学的一个最重要的课题, 也是正确指导临床医生合理使用抗生素的重要依据

3 在细菌耐药机理的检测方面, 包括分子生物学等许多实验方法被广泛应用 但这些方法的技术要求普遍较高, 大多数被用于基础研究 真正应用到临床微生物实验室的试验方法, 要求操作简便 重复性好, 结果准确 可靠, 试验成本不能太高

4 一 革兰阳性球菌耐药机制 实验室检测项目 (1) 青霉素酶的检测 (2)MRS ( 甲氧西林耐药葡萄球菌 ) (3) VISA / VRSA ( 万古霉素耐药金黄色葡萄球菌 ) (4) 肠球菌对青霉素和氨苄西林耐药 (5)HLAR ( 高水平氨基糖苷类耐药 ) (6)VRE ( 万古霉素耐药肠球菌 ) (7) PRSP ( 青霉素耐药肺炎链球菌 ) (8) 克林霉素诱导试验

5 ( 一 ) 青霉素酶的检测 检测青霉素酶方法有碘量法 酸量法和显色头孢菌素法等, 临床应用较多的是显色头孢菌素法 其原理是将受菌株与头孢硝噻吩 (Nitrocefin) 作用一定时间后, 如受试菌株产生青霉素酶, 则可水解头孢硝噻吩的 β- 内酰胺环, 产生由黄色向红色转变的颜色反应, 即为青霉素酶试验阳性

6 目前实验室多采用 BD(Becton Dickinson) 公司生产的非头孢硝噻吩显色头孢菌素 (Cefesone) 纸片 (Cefinase Plus) 进行 β- 内酰胺酶测试,Cefesone 效果稍好于头孢硝噻吩, 可降低金黄色葡萄球菌阳性结果的反应时间 测试时用 1 滴无菌水将 Cefinase 纸片湿润, 将受试菌直接涂于经湿润后的 Cefinase 纸片, 即可观察其颜色反应, 产生红色者为产酶阳性 ( 见图 (1)) 头孢硝噻吩法是目前检测嗜血杆菌属 淋病奈瑟菌 卡他莫拉菌和葡萄球菌属产生 β- 内酰胺酶的最好方法, 具有快速 灵敏和简便的特点, 但价格相对较昂贵

7 葡萄球菌可诱导 β- 内酰胺酶的检测 : 如果青霉素对葡萄球菌的 MIC 0.12μg/ml 或者抑菌环直径 29 mm, 应该对其进行可诱导 β- 内酰胺酶的检测 将待检细菌传代至 BAP 或者 MHA 琼脂平板上, 用 OX 或 FOX 纸片作为诱导剂 ( 具体方法同纸片药敏试验 ), 过夜培养, 检测抑菌圈周边细菌的产酶情况 用 Cefinase 纸片法进行测试 测试时用 1 滴无菌水将 Cefinase 纸片湿润, 将抑菌圈边缘的受试菌直接涂于经湿润后的 Cefinase 纸片,1h 内观察其颜色反应, 纸片变红色为诱导试验阳性, 不变色 ( 黄色 ) 为阴性 可诱导 β- 内酰胺酶检测阳性的菌株, 应报告对不耐酶青霉素耐药

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9 ( 二 ) 甲氧西林耐药葡萄球菌 (MRS) 检测 检测 meca 和其表达的青霉素结合蛋白 2a(PBP2a, 也称为 PBP2 ) 是预报葡萄球菌对甲氧西林耐药最准确的方法, 它也被用于证实从严重感染病人分离的葡萄球菌纸片扩散法药敏试验结果 携带 meca 基因或产 PBP2a(mecA 基因表达产物 ) 的葡萄球菌分离株, 应报告对苯唑西林 / 甲氧西林耐药 不携带 meca 或不产 PBP2a 菌株应报告对苯唑西林敏感 由于罕见非 meca 基因介导的苯唑西林耐药机制, 在纸片扩散法确定为苯唑西林耐药时, 应加测苯唑西林 MIC, 若 MIC 4μg/ml, 即使 meca 基因和 PBP 2a 检测为阴性, 也应报苯唑西林耐药 可用纸片扩散法检测这些菌株对头孢西丁的敏感性

10 1. 苯唑西林纸片筛选试验方法 : 使用含 1μg 苯唑西林纸片 ( 而不是甲氧西林或萘夫西林 ) 来检测葡萄球菌对甲氧西林的耐药性 用直接菌落悬液法制备的接种物 (0.5 麦氏比浊浓度菌液 ) 接种 MH 琼脂平板, 待琼脂表面的水份干后, 贴苯唑西林纸片, 于 孵育 24h, 测量抑菌圈直径 结果判断 : 按 NCCLS/CLSI 解释标准判断结果, 金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌抑菌圈直径 10mm 为耐药, 13mm 为敏感 除路邓葡萄球菌外的其它凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径 17mm 为耐药, 18mm 为敏感

11 注意事项 (1) 在透射光下仔细观察苯唑西林纸片周围抑菌圈内有无细小菌落或轻微弥漫生长, 如有说明耐药 (2) 试验温度超过 35 不能检测 MRS (3) 纸片扩散法结果如有疑问, 必须进行 meca 基因或 PBP2a 测定 头孢西丁纸片试验 苯唑西林 MIC 试验或苯唑西林盐琼脂筛选试验, 来确定是否为 MRS 菌株, 选择其中一种试验结果进行报告

12 2. 苯唑西林 - 盐琼脂筛选试验方法 : 试验用的 MH 琼脂中含苯唑西林 6μg/ml, 并添加有氯化钠 (4% W/V mol/l) 直接菌落悬液获得 0.5 麦氏浊度 进行试验时, 使用 1μl 接种环蘸取菌液, 在平板上涂成直径 10 到 15mm 斑点 替代方法, 用棉拭子蘸菌液涂成类似大小斑点或划满四分之一区 将琼脂平板置于 35, 孵育 24 小时后检查有无细菌生长, 任何生长都表示对苯唑西林耐药 ( 如图 ) 注意事项 : 为从凝固酶阴性葡萄球菌中检测出甲氧西林耐药菌株, 需要将琼脂平板孵育 48 小时

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14 3. 头孢西丁纸片法 方法 : 应用标准的纸片扩散法试验条件接种 MH 琼脂平板, 使用含 30μg 头孢西丁纸片, 35 孵育 24h ( 如耐药则在孵育 18h 后可报告结果 ) 使用反射光阅读头孢西丁纸片试验结果 结果判读 : 头孢西丁对金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌抑菌圈直径 21mm 时, 应报告对苯唑西林耐药, 22mm 应报告对苯唑西林敏感 除路邓葡萄球菌外凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径 24mm 时, 应报告对苯唑西林耐药, 25mm 应报告对苯唑西林敏感 注意事项 : 检测凝固酶阴性葡萄球菌对苯唑西林的耐药性, 头孢西丁纸片试验是首选方法 ( 因为头孢西丁较苯唑西林的敏感性高, 如图 )

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16 4. meca 基因及 PBP2a 测定 方法 : 可采用乳胶凝集或分子生物学等方法进行检测 ( 有成品试剂供应 ) 结果判断 :meca 基因或 PBP2a(mecA 基因表达产物 ) 检测阳性的葡萄球菌分离株, 应报告对苯唑西林 / 甲氧西林耐药 不携带 meca 或不产 PBP2a 菌株应报告对苯唑西林 / 甲氧西林敏感

17 5. 苯唑西林 MIC 试验 方法 : 可采用琼脂稀释法 肉汤稀释法或 Etest 等方法进行检测 结果判读 : 若苯唑西林 MIC 4μg/ml, 即使 meca 基因和 PBP 2a 检测为阴性, 也应报苯唑西林耐药 ( 罕见非 meca 基因介导的苯唑西林耐药机制 ) 可同时用纸片扩散法检测这些菌株对头孢西丁的敏感性

18 6. MRS 的临床报告 : 对于甲氧西林耐药的葡萄球菌 (MRS), 应报告对所有 β- 内酰胺类药物耐药, 而不考虑这些药物的体外试验结果是否敏感 因为大多数文献报告了 MRS 感染对 β- 内酰胺类治疗反应差或者因为还没有令人信服的临床数据证实这些药的临床效果

19 ( 三 ) 万古霉素耐药葡萄球菌的筛选 1. 纸片筛选法 方法 : 应用标准的纸片扩散法试验条件接种 MH 琼脂平板, 使用含 30μg 万古霉素纸片, 35 ±2 孵育 24h 结果判断 : 所有抑菌圈 14mm 的葡萄球菌均应用稀释法测其 MIC 值 注意事项 : 纸片扩散法不能区分万古霉素敏感 (MIC 范围 0.5~2μg/ml) 和万古霉素敏感性减低的菌株 (MICs 4~8μg/ml) 万古霉素耐药金黄色葡萄球菌 (VRSA)(MIC 16μg/ml), 在万古霉素纸片周围仅见轻微生长 用含 6μg/ml 万古霉素 BHI 琼脂筛选平板, 可提高检测万古霉素中介 (VI) 和万古霉素耐药 (VR) 金黄色葡萄球菌的敏感性

20 2. 琼脂筛选法方法 : 用含 6μg/mL 万古霉素 BHI 琼脂 ( 脑心浸液琼脂 ) 进行筛选试验, 直接菌落悬液获得 0.5 麦氏浊度 使用微量吸管取菌液 10μl, 点种琼脂平板表面 替代方法, 用棉拭子蘸菌液, 挤去多余菌液, 在平板上涂成直径 10 到 15mm 斑点或在部分区域划线接种, 35, 孵育 24h, 观察结果 结果判断 : 点种位置出现 1 个以上菌落, 推测菌株对万古霉素敏感性减低 注意事项 : 用含 6μg/ml 万古霉素 BHI 琼脂筛选平板, 可提高检测万古霉素中介和万古霉素耐药金黄色葡萄球菌的敏感性

21 3. MIC 确认试验 方法 : 可采用琼脂或肉汤稀释法或 Etest 等方法进行检测 结果判断 : MIC 2μg/ml 为敏感, MICs 4~8μg/ml 为敏感性降低 (VIS),MIC 16μg/ml 为耐药 (VRS) 注意事项 : 任何耐万古霉素葡萄球菌 (VISA /VRSA) 应送参考实验室进一步确证

22 ( 四 ) 肠球菌对青霉素 / 氨苄西林耐药性检测 肠球菌对青霉素和氨苄西林耐药是因为产生了低亲和力的青霉素结合蛋白 (PBPs), 个别菌株是产生 β- 内酰胺酶 纸片扩散法药敏试验可准确测定 PBPs 改变的菌株, 但对产 β- 内酰胺酶的菌株结果不可靠 此类菌株应测 β- 内酰胺酶

23 ( 五 ) 高水平氨基糖苷类耐药肠球菌检测 方法 : 用高浓度庆大霉素 (120μg) 或链霉素 (300μg) 纸片可以筛选出此类耐药性 结果判断 : 无抑菌圈为耐药, 抑菌圈直径 10mm 时表明为非高水平耐药 抑菌圈直径在 7-9mm 的菌株应使用稀释筛选试验进行检测 对于庆大霉素, 稀释法的 MIC>500μg/ml, 即为耐药 对于链霉素, 微量肉汤稀释法的 MIC>1000μg/ml, 琼脂稀释法的 MIC>2000μg/ml, 即为耐药

24 HLAR 的临床意义 : 对高浓度氨基糖苷类敏感, 表示氨基糖苷类与作用于细胞壁的抗菌药物 ( 如氨苄西林 青霉素 万古霉素 ) 联合用药时对该肠球菌菌株将具有协同作用, 也是敏感的 对氨基糖苷类高水平耐药 ( HLAR ) 表明当青霉素或糖肽类与一种氨基糖苷类抗生素联合用药时对该肠球菌菌株不会产生协同效果

25 ( 六 ) 万古霉素耐药肠球菌的检测要想使用纸片扩散法准确检测出耐万古霉素肠球菌 (VRE), 需要将平板孵育满 24h ( 而不是 16-18h), 借透射光仔细检查抑菌圈内有无小菌落或弥漫生长 纸片法结果为中介度时应测定 MIC 值 可采用琼脂或肉汤稀释法或 Etest 等方法进行 MIC 检测

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27 筛选试验 : 6μg/mL 万古霉素 BHI 琼脂 ( 脑心浸液琼脂 ) 筛选试验,35, 孵育 24h, 点种位置出现 1 个以上菌落, 推测菌株对万古霉素敏感性减低

28 ( 七 ) 青霉素耐药肺炎链球菌的检测 1. 肺炎链球菌的耐药机制青霉素耐药肺炎链球菌 (PRSP) 的耐药机制是肺炎链球菌有 6 种青霉素结合蛋白 (PBP) 发生改变, 改变后使 PBP( β- 内酰胺类抗生素的作用靶位 ) 与青霉素的结合力下降, 因而导致耐药

29 2. 纸片扩散法检测 方法 : 使用含 1μg 苯唑西林纸片而不是青霉素纸片, 来检测肺炎链球菌对青霉素的耐药性 培养基 :Mueller-Hinton 琼脂 +5% 羊血 接种物 : 直接菌落悬液法, 相当于 0.5 麦氏标准 孵育 : 35 ±2 ;5%CO 2 ;20-24 小时

30 结果判断 : 当苯唑西林抑菌环 20mm 时可报告肺炎球菌对青霉素敏感 并同时可报告氨苄西林 阿莫西林 阿莫西林 / 克拉维酸 头孢克罗 头孢地尼 头孢吡肟 头孢他美 头孢克肟 头孢噻肟 头孢丙烯 头孢曲松 头孢呋辛 头孢泊肟 头孢唑肟 亚胺培南 氯碳头孢和美罗培南敏感而不需要再测定这些药的敏感性 当苯唑西林的抑菌环 19mm 的菌株应当测定青霉素和头孢噻肟或头孢曲松及美洛培南的 MICs, 因为抑菌环 19mm, 可以发生在青霉素耐药 中介或敏感的某些菌株中, 不能仅仅根据苯唑西林的抑菌环 19mm, 就报告对青霉素耐药或中介

31 3. 稀释法检测 用 M-H 肉汤同时加 2%-5% 融血的马血做肺炎链球菌的稀释法药敏试验 青霉素的 MIC 0.06μg/ml 为敏感

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33 ( 八 ) 诱导性克林霉素耐药检测 1. 耐药机理 : 对大环内酯耐药的葡萄球菌 ( 或 β- 溶血链球菌 ) 可能存在有结构性 ( 天然 ) 或诱导性对克林霉素的耐药 [ 通过 erm 基因编码的 23S rrna 甲基化也称为 MLSB( 大环内酯 林可和 B 型链阳霉素 ) 耐药 ], 或只对大环内酯类耐药 ( 由 msra 基因编码的外排机制 )

34 2. 检测方法 : 培养基 :Mueller-Hinton 琼脂 +5% 羊血 接种物 : 直接菌悬液法, 相当于 0.5 麦氏标准 孵育 : 35 ±2 ;5%CO 2 ;20-24h 方法 : 诱导克林霉素耐药可使用 D 抑菌环试验, 纸片边缘相距 12mm, 可作为正常纸片扩散法一部分, 经 35 孵育 24h 结果判断 : 若靠近红霉素纸片 (15μg/ 片 ) 侧克林霉素 (2μg/ 片 ) 的抑菌环出现 截平 ( 称为 D 抑菌环 ), 则菌株存在克林霉素诱导耐药, 应报告对 克林霉素耐药 在报告单中可注明 经诱导克林霉素耐药试验推测此菌株对克林霉素耐药, 在某些病人中克林霉素可能仍有效 若无 截平 现象, 则应报告菌株对克林霉素敏感

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38 二 β- 内酰胺酶介导的革兰阴性细菌 耐药机制检测 革兰阴性细菌对 β- 内酰胺类抗生素的耐药机制 : (1) 产生 β- 内酰胺酶水解灭活药物 ; (2) 细菌外膜通透性下降 ; (3) 主动泵出药物 其中产生 β- 内酰胺酶是革兰阴性细菌对 β- 内酰胺类抗生素耐药的主要原因

39 临床上重要的 β- 内酰胺酶有以下几种 : (1) 超广谱 β- 内酰胺酶 (ESBLs); (2) 头孢菌素酶 (AmpC 酶 ); (3) 碳青霉烯酶 ( 包括 KPC 酶 )

40 ( 一 ) 超广谱 β- 内酰胺酶 (ESBLs) 的检测 1. 初筛试验 (1) 按常规标准纸片扩散法进行操作对肺炎克雷伯菌 产酸克雷伯菌和大肠埃希菌 : 头孢泊肟抑菌圈直径 17mm 头孢他啶 22mm 氨曲南 27mm 头孢曲松 25mm 或头孢噻肟 27mm 对奇异变形杆菌判断标准 : 头孢泊肟抑菌圈直径 22mm 头孢他啶 22mm 或头孢噻肟 27mm 上述抑菌圈直径 ( 任何一种药物 ), 提示菌株可能产 ESBLs (2) 按常规标准肉汤稀释法进行操作结果判断 : 头孢他啶 氨曲南 头孢曲松或头孢噻肟等任何一种药物对大肠埃希菌 肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌的 MIC 2.0μg/ml, 头孢泊肟 MIC 8.0μg/ml, 提示菌株可能产 ESBLs 对奇异变形杆菌判断标准 : 头孢泊肟 头孢他啶或头孢噻肟 MIC 2.0μg/ml

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42 2. 双纸片协同法 按常规纸片扩散法在 MHA 上涂布好受试菌, 先在琼脂平板中心贴上阿莫西林 / 克拉维酸 (20μg/10μg) 纸片, 然后在其上下左右贴 30μg/ 片头孢他啶 头孢曲松 头孢噻肟和氨曲南纸片, 各纸片中心距复合剂纸片中心距离 20-30mm,35, 孵育 18-20h 结果解释, 如周围 4 个药物纸片中有任何一个抑菌圈在靠近复合剂纸片一侧的边缘出现扩大或加强, 说明该菌株产 ESBLs

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45 3. 表型确证试验 (1) 纸片扩散法 : 使用每片含 30μg 头孢他啶 头孢噻肟纸片和头孢他啶 / 克拉维酸 (30μg/10μg) 头孢噻肟 / 克拉维酸 (30μg/10μg) 的复合剂纸片进行试验, 当任何一种复合剂纸片抑菌圈直径大于 ( 或等于 ) 其单独药敏纸片抑菌圈直径 5mm, 可确证该菌株产 ESBLs

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49 表型确证试验 (2) 琼脂稀释法 : 使用头孢他啶 ( μg/ml) 头孢他啶 / 克拉维酸 (0.25/4-128/4μg/ml) 头孢噻肟 ( μg/ml) 和头孢噻肟 / 克拉维酸 (0.25/4-64/4μg/ml) 进行 MIC 测试, 当与克拉维酸联合药物组的 MIC 小于或等于单独药物组 MIC 3 个倍比稀释度时 (8 倍浓度 ), 可确证该菌株产 ESBLs

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51 ( 二 )AmpC 酶的检测 对于 AmpC 酶,CLSI 目前还没有可供推荐的方法进行检测, 也没有相应的判断标准 目前用于 AmpC 酶定性的检测方法很多, 主要有以下几种

52 1. 单纸片扩散法 ( 初筛试验 ) 若抑菌环直径 CAZ 14mm CTX 14mm CRO 13mm ATM 15mm CPD 14mm FOX 14mm 且克拉维酸协同或增效试验阴性时可疑为产 AmpC 酶菌株

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54 2. 双纸片协同法 ( 初筛试验 ) 将 0.5 麦氏单位的待检菌液涂抹于 MH 琼脂平板上, 稍干后, 把含 200μg/ 片氯唑西林 (Cloxacillin, CLO) 纸片贴于 MH 平板中央, 于氯唑西林纸片周围分别贴上头孢西丁 (FOX) 纸片 ( 纸片中心距离 15-20mm ), 置 35 过夜培养, 观察有无协同现象, 氯唑西林与头孢西丁有协同现象者可疑为产 AmpC 酶菌株

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56 3. 双纸片增效试验将 0.5 麦氏单位的待检菌液涂抹于 MH 琼脂平板上, 稍干后, 在琼脂培养基上贴头孢西丁 / 氯唑西林 头孢他啶 / 氯唑西林 头孢噻肟 / 氯唑西林 头孢曲松 / 氯唑西林 氨曲南 / 氯唑西林 头孢泊肟 / 氯唑西林 头孢哌酮 / 氯唑西林纸片, 置 35 过夜培养 与单纸片平皿对照, 若加氯唑西林纸片 ( 200μg/ 片 ) 较未加氯唑西林纸片抑菌环直径 5mm( 非 CLSI 标准 ), 且对上述超广谱 β- 内酰胺类抗生素 (ESC) 耐药, 即为 AmpC 酶阳性

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58 4. 三维试验法 (1) 三维纸片法 ( 初筛试验 ) 将 0.5 麦氏标准浓度的标准大肠杆菌 ATCC 菌液涂抹于 MH 琼脂平板上, 稍干后, 贴一片头孢西丁 (FOX) 纸片于 MH 平板中央, 用无菌纸片沾取待检菌贴在距抗生素纸片 5mm 处, 置 35 过夜培养 出现失状菌苔者 为阳性 三维纸片法不能区分诱导或持续产酶

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60 (2) 三维沟槽法 三维 ( 沟槽 ) 实验是目前公认的测定质粒型或去阻遏 ( 持续高产型 )AmpC β- 内酰胺酶的经典方法, 是唯一能够鉴别 AmpC 酶和其它头霉素耐药机理 ( 如外膜通透性降低 ) 的方法

61 1) 三维沟槽试验方法 将 0.5 麦氏标准浓度的标准大肠杆菌 ATCC 菌液涂抹于 MH 琼脂平板上, 稍干后, 把含 30μg/ 片头孢西丁纸片 (Cefoxitin,FOX) 贴于 MH 平板中央, 分别在距头孢西丁纸片 5mm 处, 挖三个 ( 最多四个 )1 10 4mm 的槽, 槽内分别加入 40μl AmpC 阳性对照菌 ESBLs 阳性对照菌及待检菌的粗提酶液, 置 35 过夜培养

62 2) 三维试验法原理 标准大肠杆菌 ATCC 对头孢西丁是敏感的, 平皿上会出现 23~28mm 的抑菌环,AmpC 酶对照液加到槽中后, 由于 AmpC 酶扩散到周围琼脂中破坏了头孢西丁 (FOX), 因此槽周围会长出细菌, 抑菌环缺损, 形成一指向 FOX 的矢状菌苔, 即 AmpC 酶阳性 ; 而头孢西丁 ( 头霉素 ) 不会被 ESBLs 水解, 因此 ESBLs 对照槽周围抑菌环是完整的, 即 AmpC 酶阴性 ; 如果待检菌沟槽处出现抑菌环的缺损, 即为去阻遏 AmpC 酶阳性, 反之阴性

63 三维试验法原理 加样槽 酶扩散区 ATCC 抑菌环矢状菌苔 抗生素纸片

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65 3) 去阻遏型 ( 持续型 )AmpC 酶的确认 菌株对超广谱 β- 内酰胺类抗生素 (ESC) 耐药 ; 氯唑西林协同法和增效法阳性 ; 三维 ( 沟槽 ) 法阳性 符合上述条件的菌株可判定为持续高产 AmpC β- 内酰胺酶株

66 ( 三 ) 碳青霉烯酶的测定 碳青霉烯酶 : 指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类 β 内酰胺酶, 分别属于 Ambler 分子分类中的 A 类 B 类 D 类酶, 包括 KPC β 内酰胺酶和金属酶 CLSI 目前还没有可供推荐用于临床实验室检测金属酶的方法, 但是 2009 年的 CLSI 文件中 (M100-S19- Appendix G) 增加了对 KPC β 内酰胺酶的检测方法 ( 即改良的三维纸片法 --Modified Hodge test)

67 用于 KPC 酶定性的检测方法主要有以下几种 : (1) 改良三维试验法 ; (2) 分子生物学方法 用于金属酶定性的检测方法主要有以下几种 : (1)EDTA 双纸片协同及增效试验 ; (2) 三维试验法 ; (3) 分子生物学方法

68 纸片筛选法 : 选用厄他培南 美罗培南 亚胺培南不作为碳青霉烯酶筛选药物 改良 Hodge 试验是碳青霉烯酶的表型检测方法, 用于检测 KPC 的敏感性及特异性均大于 90%, 但检测其他碳青霉烯酶时, 敏感性及特异性变化较大

69 1.KPC 酶检测 2001 年首次报道从肺炎克雷伯菌中分离到 KPC-1, 它属于 Bush 分类法中的 A 类 2f 组, 克拉维酸对其活性有抑制作用 KPC β 内酰胺酶目前已有 4 种亚型, 包括 KPC-1 至 KPC-4, 他们之间只有个别氨基酸发生了突变 在多个菌属中都有报道 主要为质粒介导, 但在阴沟肠杆菌中可由染色体介导 国外报道, 产 KPC β 内酰胺酶菌株即可表现为对碳氢霉烯类抗生素耐药, 也可表现为中介或敏感, 并存在接种效应 ( 即 MIC 与细菌的接种菌量成正比 ), 这就增加了对其识别的难度

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71 150mm 平皿

72 质量控制 Test positive and negative QC organisms each day of testing. K. pneumoniae ATCC BAA-1705 modified Hodge test positive K. pneumoniae ATCC BAA-1706 modified Hodge test negativ

73 2. 金属酶 (MBL) 测定 定义 : 活性部位带金属离子的酶类称金属 β- 内酰胺酶 (Metallo-β-lactamase, MBL), 这类酶不仅能水解碳青霉烯类而且能够水解其他广谱内酰胺类抗生素 巯基化合物 (2- 巯基丙酸 ) 对金属 β- 内酰胺酶的抑制作用强于 EDTA, 但其毒性作用较强, 因此用 EDTA 进行检测更安全些

74 (1) 双纸片协同法 将 0.5 麦氏单位的待检菌液涂抹于 MH 琼脂平板上, 稍干后, 把含 10μg/ 片亚胺培南纸片 (Imipenem,IPM) 贴于 MH 平板中央, 于亚胺培南纸片周围分别贴上 EDTA-Na 2 (K 2 ) (100mmol/L,5μl) 或巯基化合物 (5μl) 纸片 ( 纸片中心距离为 24mm), 置 35 过夜培养, 有协同现象者为 MBL 阳性

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76 金属酶检测结果 2- 巯基丙酸金属酶筛选试验 ( 双纸片法 ): A 头孢他啶 2- 巯基丙酸 B A: 为阴性对照株, 未出现协同效应 B: 临床分离株, 靠近 2- 巯基丙酸一侧 CAZ 抑菌圈明显扩大

77 金属酶筛选结果 IMP 纸片 2- 巯基丙酸 EDTA EDTA 2- 巯基丙酸 IMP 纸片 阳性对照株结果 临床标本结果

78 (2) 双纸片增效法 将 0.5 麦氏单位的待检菌液涂抹于 MH 琼脂平板上, 稍干后, 在琼脂培养基上贴 IPM IPM/EDTA 纸片, 置 35 过夜培养 若加 EDTA 纸片较未加 EDTA 纸片抑菌环直径 5mm ( 非 CLSI 标准 ), 且对超广谱 β- 内酰胺类抗生素 (ESC) 耐药, 即为 MBL 阳性

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80 (3)Etest 法 将 0.5 麦氏单位的待检菌液涂抹于 MH 琼脂平板上, 稍干后, 在琼脂培养基上贴一端为 IPM 另一端为 IPM/EDTA 的 Etest 纸片, 置 35 过夜培养 若加 EDTA 一端 MIC 值较未加 EDTA 一端 MIC 值低 8 倍以上, 即为 MBL 阳性

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82 (4) 三维试验法 方法 : 将 0.5 麦氏单位的标准大肠杆菌 ATCC 菌液涂抹于 MH 琼脂平板上, 稍干后, 把含 10μg/ 片亚胺培南 (IPM) 贴于 MH 平板中央, 分别在距亚胺培南纸片边缘 5mm 处, 挖四个 1 10mm 的槽, 将待检菌的粗提酶液加入槽内, 置 35 过夜培养, 观察有无水解现象 结果观察 : 槽周围抑菌环是完整的, 即 MBL 阴性 ; 如果待检菌沟槽处出现抑菌环的缺损, 即为 MBL 阳性

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84 (5) 酶抑制试验 在三维法试验中, 以 1:10 比例将 100mmol L -1 的酶抑制剂 EDTA 与待检菌的粗提酶液混匀后加入槽内, 置 35 过夜培养, 观察有无抑制现象 如果加 EDTA 后, 酶活性被抑制, 即 MBL 检测阳性

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86 三 BLNAR 流感嗜血杆菌的检测 流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药的主要机制是产生 β- 内酰胺酶, 以质粒介导的 TEM-1 型酶为主, 少部分产 ROB-1 型酶 BLNAR(β-lactamase Negative Ampicillin Resistant), 意为 β- 内酰胺酶阴性氨苄西林耐药 BLNAR 流感嗜血杆菌的耐药机制主要是由于染色体介导的青霉素结合蛋白的改变和外膜蛋白通透性下降所致 对于 BLNAR 流感嗜血杆菌的检测, 常规实验室一般采用氨苄西林 (10 μg/ 片 ) 和阿莫西林 / 克拉维酸 (30 μg/ 片,20/10 μg) 双纸片结合的方式, 如果 K-B 药敏结果显示氨苄西林和阿莫西林 / 克拉维酸均耐药, 提示该菌可能为 BLNAR 流感嗜血杆菌菌株 国外学者 Pauliina Kärpänoja 等研究发现, 相对于常规检测方法, 低浓度含量的氨苄西林和阿莫西林 / 克拉维酸纸片检测 BLNAR 流感嗜血杆菌菌株的效果可能会更好 U1

87 幻灯片 86 U1 User,

88 我国卫生部于 1997 年规定 : 我国药敏试验暂按 CLSI 历年颁布的所有微生物药敏试验文件作为部颁标准, 此决定至今未改变

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材料 方法 生物技术通报 陆敏 许黎明 吴宏宇 张继恩 李国栋 黄青山 溶葡萄球菌酶 是一种能高效裂解葡萄球菌细胞壁的肽链内切酶 已有研究表明其能够有效预防和去除奶牛乳腺中葡萄球菌的感染 但该酶在牛奶中的性质研究还缺少详细的研究数据 现对重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的一些性质进行研究 检测了加入溶葡萄球菌酶后牛奶性状的变化和重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的酶活的稳定性以及溶葡萄球菌酶在牛奶中的抑 杀菌活性 结果显示 重组溶葡萄球菌酶未改变牛奶的外观性状

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