革兰阴性杆菌耐药性检测进展
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- 生 云
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1 革 兰 阴 性 杆 菌 耐 药 性 检 测 进 展 华 鑫 科 技 有 限 公 司 技 术 部 吕 苏 成
2 前 言 革 兰 阴 杆 菌 是 院 内 感 染 的 重 要 病 原 菌, 在 感 染 中 常 居 首 位, 由 于 其 具 有 多 重 耐 药, 而 且 耐 药 率 高, 特 别 是 对 第 三 代 头 孢 菌 素 和 单 环 酰 胺 类 等 新 的 广 谱 菌 药 耐 药, 给 临 床 治 疗 带 来 很 大 困 难, 为 止 引 起 了 国 内 外 学 者 的 高 度 关 注, 他 们 在 研 究 简 便 快 速 检 出 方 法 及 其 耐 药 机 理 和 选 择 治 疗 用 药 等 方 面 取 得 了 很 大 进 展, 并 已 不 少 报 道
3 一 G-b 的 耐 药 机 理 1. 细 菌 产 生 ß- 内 酰 胺 酶 可 水 解 ß- 内 酰 胺 酶 类 抗 生 素, 这 是 最 重 要 和 最 常 见 的 耐 药 机 制 细 菌 产 生 氨 基 糖 苷 类 钝 化 酶 对 氨 基 糖 苷 类 如 庆 大 酶 素 耐 药, 喹 诺 酮 类 耐 药 是 由 于 DNA 旋 转 酶 改 变 或 药 物 渗 透 性 改 变
4 2. 抗 生 素 的 渗 透 障 碍 : 由 于 细 胞 壁 障 碍 或 细 胞 膜 通 透 性 改 变 抗 生 素 无 法 进 入 菌 体 内 发 挥 抗 菌 作 用, 当 细 菌 外 膜 微 孔 蛋 白 缺 失 后 抗 生 素 也 不 能 进 入 菌 体
5 3. 外 膜 存 在 着 药 物 泵 出 系 统 (Tet 膜 蛋 白 介 导 ) 使 进 入 菌 体 内 的 药 物 主 动 泵 出 导 致 菌 体 内 药 物 浓 度 降 低, 如 对 四 环 素 类 和 喹 诺 酮 类 耐 药 等
6 4. 靶 位 的 改 变 : ß- 内 酰 胺 酶 类 抗 生 素 通 过 与 青 霉 素 结 合 蛋 白 (PBPs) 结 合 而 抑 制 细 菌 生 长, 当 靶 位 改 变 后 抗 菌 药 物 不 能 与 其 结 合 而 失 去 作 用 对 磺 胺 耐 药 是 由 于 细 菌 改 变 体 内 二 氢 叶 酸 和 合 成 酶, 与 磺 胺 药 的 亲 和 力 降 低 引 起 的
7 5. 非 水 解 屏 障 机 制 : 主 要 是 染 色 体 介 导 的 1 型 ß- 内 酰 胺 酶 细 菌 如 绿 脓 杆 菌, 肠 杆 菌 等 对 头 孢 类 抗 生 素 耐 药 并 非 抗 生 素 的 ß- 内 酰 胺 环 水 解, 而 是 由 于 非 水 解 屏 障 的 形 成, 由 于 ß- 内 酰 胺 酶 类 药 物 与 质 周 空 间 诱 导 产 生 的 ß- 内 酰 胺 酶 结 合 成 无 生 物 活 性 的 复 合 物 而 不 能 进 入 靶 位 发 挥 抗 菌 作 用
8 细 菌 同 时 具 有 以 上 两 种 以 上 耐 药 机 制 就 产 生 了 对 多 种 抗 生 素 的 耐 药 性
9 二 新 型 ß- 内 酰 胺 酶 的 产 生 传 播, 增 加 了 G- 杆 菌 的 耐 药 性
10 1.60 年 代 初 期 从 大 肠 杆 菌 中 首 次 发 现 质 粒 介 导 的 tem-1 ß- 内 酰 胺 酶, 随 后 在 全 球 转 播 并 在 许 多 不 同 菌 株 中 发 现 如 肠 杆 菌 科, 铜 绿 假 单 胞 菌 等
11 2.70 年 代 开 始, 一 些 新 的 ß- 内 酰 胺 类 抗 生 素 应 用 于 临 床, 试 图 来 治 疗 一 些 革 兰 阴 性 杆 菌 引 起 的 感 染, 因 为 这 些 细 菌 已 对 同 类 旧 的 一 代 抗 生 素 产 生 了 耐 药 性 这 些 新 的 药 物 包 括 第 二 三 代 的 头 孢 抗 生 素, 如 头 孢 呋 新 (cefuroxime) 头 孢 孟 多 (cefamandole) 头 孢 噻 肟 (cefofaxime) 和 头 孢 他 啶 (ceftazidime), 以 及 单 酰 胺 菌 素 胺 曲 南 在 新 的 ß- 内 酰 胺 类 抗 生 素 广 泛 使 用 后, 出 现 了 耐 授 这 些 新 药 的 肺 炎 克 雷 伯 菌 由 这 些 异 常 耐 药 菌 株 所 造 成 的 感 染 也 随 之 出 现
12 这 种 耐 药 性 也 播 散 到 大 肠 埃 希 菌 的 某 些 菌 株, 还 有 少 数 其 它 革 兰 阴 性 杆 菌 对 这 种 耐 药 性 产 生 机 制 的 调 查 结 果 显 示, 由 旧 质 粒 介 导 的 TEM 和 SHVß- 内 酰 胺 中 还 存 在 新 型 式 的 酶 旧 酶 的 结 构 基 因 编 码 发 生 突 变, 产 生 比 亲 代 酶 具 有 更 广 谱 底 物 的 衍 生 物 这 些 具 有 超 广 谱 作 用 底 物 的 新 的 酶 包 括 第 二 三 代 头 孢 类 抗 生 素 和 胺 曲 南 因 此 它 们 被 命 名 为 超 广 谱 ß- 内 酰 胺 酶 (ESBLs)
13 随 着 80 年 代 初 期 发 现 产 ESBL 菌 株 在 80 年 代 后 期 由 于 ß- 内 酰 胺 类 抗 生 素 与 ß- 内 酰 胺 酶 抑 制 剂 联 合 应 用 不 断 增 加, 出 现 了 耐 抑 制 剂 ß- 内 酰 胺 酶 (Inhibitor-resistantß- Lactamases), 研 究 发 现 耐 克 拉 维 酸 的 ß- 内 酰 胺 酶 核 酸 序 列 是 TEM-1 或 TEM-2 的 变 种, 称 为 IRT(Inhibitor resistant TEM ß-Lactamases)
14 以 后 用 数 字 来 表 示 如 TEM-30 为 IRT-2, TEM-31 为 IRT-1,TEM-2 为 IRT-3 等, 共 有 IRT-23 种 ; 还 有 SHV-1 的 变 种 和 相 关 的 酶 耐 抑 制 剂 ß- 内 酰 胺 酶 菌 株 有 大 肠 埃 希 菌, 肺 炎 克 雷 伯 菌, 产 酸 克 雷 伯 菌, 奇 异 变 形 杆 菌 和 弗 劳 地 枸 橼 酸 杆 菌 这 些 细 菌 对 阿 莫 西 林 / 克 拉 维 酸, 替 卡 西 林 / 克 拉 维 酸 和 氨 苄 西 林 / 舒 巴 坦 耐 药
15 90 年 代 初 期 因 头 霉 素 如 头 孢 西 丁 应 用 增 多 出 现 了 质 粒 介 导 的 AmpC 酶, 对 头 霉 素 耐 药 90 年 代 后 期 因 碳 青 霉 稀 酶, 对 碳 青 酶 稀 类 抗 生 素 耐 药 新 酶 的 产 生 导 致 了 G- 杆 菌 耐 药 谱 的 变 化, 并 对 多 种 超 广 谱 抗 生 素 耐 药
16 一 超 广 谱 ß- 内 酰 胺 酶 (ESBLs) ESBLs(Extended Spectrumß-lactamases) 特 性 : ESBLs 是 丝 氨 酸 蛋 白 酶 的 衍 生 物 能 于 ß- 内 酰 胺 环 的 羧 基 共 价 结 合 使 酰 胺 键 水 解, 可 水 解 青 霉 素 类, 头 菌 孢 素 和 单 环 酰 类 抗 生 素, 特 别 是 能 水 解 第 三 代, 如 头 孢 他 啶 头 孢 噻 肟 等 和 水 解 单 环 酰 胺 类, 如 氨 曲 南 等 并 对 四 代 头 菌 孢 素 如 马 斯 平 也 能 部 分 水 解 ESBLs 是 质 粒 介 导 的 能 被 克 拉 维 酸 抑 制, 不 被 EDTA 抑 制
17 二 ESBLs 产 生 机 制 ESBLs 的 产 生 是 由 于 第 三 代 头 孢 菌 素 的 广 泛 应 用, 药 物 选 择 性 压 力 导 致 广 谱 ß- 内 酰 胺 酶 TEM- 1,-2 或 SHV-1 基 因 突 变 1982 年 英 国 报 道 一 株 产 TEM-1 产 酸 克 雷 伯 菌 最 初 庆 大 耐 药, 对 孢 头 他 啶 敏 感, 使 用 孢 头 他 啶 后 对 其 耐 药, 基 因 分 析 发 现 TEM-1 结 构 中 第 164 位 上 精 氨 酸 变 为 丝 氨 酸, 命 名 为 TEM 年 德 国 首 例 报 道 的 产 ESBLs 臭 鼻 伯 菌 在 SHV-1 第 238 位 上 的 甘 氨 酸 变 成 了 丝 氨 酸,SHV-2 总 之 ESBLs 是 在 TEM-1,-2 或 SHV-1 结 构 中 的 少 数 位 点 1-4 个 氨 基 酸 发 生 基 因 突 变, 使 其 产 生 ESBLs 表 型
18 三 ESBLs 在 ß- 内 酰 胺 酶 中 的 位 置 根 据 Bush,Rasussen 和 Ambler 等 提 出 的 ß- 内 酰 胺 酶 的 分 类 法 具 体 见 下 表 :
19 功 能 表 分 子 分 类 ß- 内 酰 胺 酶 种 类 作 用 最 佳 底 物 棒 酸 被 抑 制 EDTA 代 表 酶 1 C AmpC 型 ß- 内 酰 胺 酶 头 孢 菌 素 类 + 诱 导 酶 来 自 肠 杆 菌 枸 缘 酸 杆 菌 沙 雷 菌 和 假 单 胞 菌 质 粒 介 导 的 酶 ACT-1 CMY 型 FOX 型 2a A G+ 青 霉 素 酶 青 霉 素 类 + 金 葡 菌 PCI 青 霉 素 酶 2b A 广 谱 酶 青 霉 素 和 窄 谱 头 孢 菌 素 + TeM-1-2 SHV-1 OHIO-1 2be A 超 广 谱 ß- 内 酰 胺 酶 青 霉 素, 所 有 头 孢 菌 素 和 单 环 酰 胺 类 + TEM 其 他 TEM;SHV 其 他 SHV;CTX-M-1CTX- M-9, 产 酸 克 雷 伯 K1 2br A 耐 ß- 内 酰 胺 酶 抑 制 剂 青 霉 素 和 窄 谱 头 孢 菌 素 类 TEM-30 到 TEM-36, 其 他 SHV;SHV-10 2c A 水 解 羧 苄 西 林, ß- 内 酰 胺 酶 青 霉 素, 包 括 羧 苄 青 霉 素 + PSE-1,PSE-3,PSE-4; 气 单 胞 AER-1;CARB-3-4
20 功 能 表 分 子 分 类 ß- 内 酰 胺 酶 种 类 作 用 最 佳 底 物 被 抑 制 棒 酸 EDTA 代 表 酶 2d D 水 解 苯 唑 青 霉 素,ß- 内 酰 胺 酶 青 霉 素 类 包 括 氯 唑 西 林 ± OXA-1 到 OXA-30 2e A 被 棒 酸 抑 制 的 头 孢 菌 素 酶 头 孢 菌 素 类 + 脆 弱 类 杆 菌 CepA, 变 形 杆 菌 FPM-1, 嗜 麦 芽 窄 食 单 胞 菌 L2 2f A 非 金 属 碳 青 酶 稀 酶 3a B 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 青 霉 素 头 孢 菌 素 类 和 碳 青 酶 稀 类 青 霉 素 类, 头 孢 菌 素 类, 碳 青 酶 稀 类 + IMI-1,NMC-ASme-1 + 腊 样 芽 孢 杆 菌 11,CcrA IMP-1 L1 VIM-1 VIM-2 3b B 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 碳 青 酶 稀 类 + Cph AsbM1 ASA-1 ImiS 3c B 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 头 孢 菌 素 类 碳 青 酶 稀 类 + ß- 内 酰 胺 酶 来 自 高 曼 军 团 菌 4 ND 不 被 棒 酸 抑 制 青 霉 素 类 ß- 内 酰 胺 酶 来 自 洋 葱 伯 克
21 ß- 内 酰 胺 酶 的 命 名 根 据 作 用 的 底 物 如 CARB IMP OXA CAI CTX 等 ; 根 据 生 化 特 性 如 SHV; 根 据 基 因 如 Amp CepA; 根 据 细 菌 如 AER PSE; 根 据 患 者 名 如 TEM ROB; 根 据 医 院 如 MIR RHH 州 名 (OHIO) 等 命 名
22 ( 四 )ESBLs 种 类 ESBLs 现 有 TEM SHV CTX 酶,CTX 酶 为 一 种 新 型 酶 1 TEM 酶 有 90 多 种 其 中 ESBLs63 种, IRT23 种, 有 些 TEM 酶 有 替 代 名 称, 如 TEM-5 为 CAZ-1,TEM-8 为 CAZ-2, TEM-16 为 CAZ-7,TEM-25 为 CTX-2, TEM-35 为 IRT-4 等
23 2 SHV 酶 有 30 种, 其 中 ESBLs24 种,4 种 还 未 报 道 3 CTX 酶 为 一 种 新 型 酶,CTX-M-1 到 CTX-M-9, 这 些 酶 与 TEM 和 SHV 酶 没 有 密 切 关 系, CTX-M-2 为 最 常 见 流 行 的 ESBL
24 OXA( 苯 唑 西 林 ) 酶 中 发 现 有 几 个 型 是 ESBLs, OXA 酶 属 于 Bush 分 类 D 组 2d 型 OXA-11,-14,-16 和 -17 是 OXA-10 的 衍 生 物, OXA-2 是 OXA-2 的 衍 生 物 这 组 ESBLs 菌 株 对 头 孢 菌 素 弱 耐 药
25 ( 五 ) 产 ESBL 菌 株 1 肺 炎 克 雷 伯 菌 和 大 肠 埃 希 菌 是 最 常 见 ESBLs 菌 株, 从 产 酸 克 雷 伯 菌, 阴 沟 肠 杆 菌, 产 气 肠 杆 菌, 沙 雷 菌 和 奇 异 变 形 杆 菌 等 肠 杆 菌 科 细 菌 分 离 出 产 ESBLs 菌 株 2 出 产 ESBLs 菌 株 在 全 球 传 播 不 同 国 家 和 地 区 都 有 不 同 报 道, 如 产 ESBLs 肺 炎 克 雷 伯 菌 在 美 国 的 发 生 率 为 3% 左 右, 但 有 的 地 区 高 达 25% 荷 兰 16%, 比 利 时 31%, 葡 萄 牙 49%, 土 耳 其 9%, 韩 国 23%, 国 内 报 道 6%-57%, 在 大 肠 埃 希 菌 中 产 ESBLs 菌 株 检 出 率 为 % 左 右
26 产 ESBLs 菌 株 ICU 病 房 和 老 年 科 发 生 率 高, 有 报 道 由 ESBLs 菌 株 引 起 的 爆 发 流 行
27 ( 六 ) 产 ESBLs 菌 株 流 行 的 原 因 1 ESBLs 是 质 粒 介 导 的, 在 一 定 条 件 下 细 菌 将 耐 药 质 粒 转 移 给 同 种 属 或 不 同 种 属 细 菌 而 传 播 快 2 药 物 选 择 性 压 力 导 致 产 ESBLs 菌 株 不 断 增 加 3 医 务 人 员 通 过 手 或 使 用 气 械 传 播
28 4 患 者 之 间 传 播 5 正 常 人 携 带 也 是 造 成 ESBLs 传 播 和 感 染 的 重 要 因 素, 在 芝 加 哥 的 老 人 疗 养 院 中, 从 半 数 老 人 的 胃 肠 道 内 分 离 出 产 ESBLs 的 肺 炎 克 雷 伯 菌 和 大 肠 埃 希 菌
29 ( 七 ) 治 疗 选 药 和 控 制 措 施 ESBLs 的 质 粒 上 常 常 携 带 对 其 他 抗 生 素 如 庆 大 霉 素, 环 丙 沙 星 和 磺 胺 类 等 耐 药 基 因, 造 成 ESBLs 菌 株 多 重 耐 药
30 1 ESBLs 菌 株 治 疗 选 药 原 则 碳 青 酶 稀 类 如 亚 胺 配 能 含 ß- 内 酰 胺 酶 抑 制 剂 复 合 抗 生 素, 如 舒 普 深, 特 治 星 等 氨 基 糖 苷 类 抗 生 素, 阿 米 卡 星 头 酶 稀 类 抗 生 素, 头 孢 西 丁
31 2 预 防 措 施 控 制 超 广 谱 抗 生 素 第 三 代 头 孢 菌 素 等 的 使 用 预 防 自 身 感 染 和 交 叉 感 染 发 现 产 ESBLs 菌 株 爆 发 流 行, 应 该 立 即 采 取 感 染 控 制 的 处 理 方 法, 如 关 闭 病 房 彻 底 消 毒 等 发 现 散 发 的 ESBLs 感 染 株 应 选 择 有 效 药 物 清 除 它, 对 环 境 要 彻 底 消 毒
32 ESBLs 菌 株 的 检 测 方 法 目 前 检 测 ESBLs 菌 株 有 几 种 方 法 ( 除 外 分 子 学 方 法 ) 都 共 同 应 用 一 个 原 理, 即 头 孢 类 抗 生 素 与 ß- 内 酰 胺 酶 抑 制 剂 克 拉 维 酸 联 合 应 用, 克 拉 维 酸 抑 制 ESBL, 细 菌 对 头 孢 类 抗 生 素 减 少 耐 药 性 具 体 检 测 方 法 有 :
33 1 双 纸 片 协 同 法 按 照 标 准 纸 片 扩 散 法 操 作, 在 测 试 菌 涂 布 在 M-H 琼 脂 平 版 上 后 将 含 克 拉 维 酸 ( 棒 酸 ) 的 阿 莫 西 林 纸 片 贴 在 平 板 中 央, 然 后 在 其 周 围 分 别 贴 上 头 孢 他 定 (CAZ) 头 孢 噻 肟 (CTX), 氨 曲 南 (AZT) 纸 片, 与 含 棒 酸 纸 片 距 离 为 15mm-20mm ( 纸 片 边 缘 到 边 缘 ), 放 置 35 18h, 出 现 协 同 现 象 为 ESBLs 菌 株 在 检 测 大 肠 埃 希 菌 和 肺 炎 克 雷 伯 菌 时 用 CTX 和 AZT 较 CAZ 易 于 观 察 结 果, 试 验 中 发 现 阴 沟 肠 杆 菌 中 产 ESBLs 菌 株 用 CAZ 优 于 CTX 因 此 检 测 产 ESBLs 菌 株 时 最 好 同 时 使 用 CAZ 和 CTX 以 利 于 提 高 检 出 率
34 2 三 维 试 验 什 么 叫 三 维? 纸 片 上 的 药 物 向 培 养 基 中 扩 散 为 一 维 琼 脂 平 板 上 的 细 菌 产 生 的 抗 药 性 酶 向 培 养 基 中 扩 散 是 二 维 在 纸 片 旁 边 的 琼 脂 刻 一 裂 缝, 在 其 中 加 入 受 试 菌 液, 该 菌 产 生 的 抗 药 性 酶 向 四 周 的 琼 脂 中 扩 散 是 第 三 维
35 2 三 维 试 验 有 2 种 方 法 直 接 法 ( 用 同 一 菌 株 ) 间 接 法 ( 用 不 同 菌 株 )
36 直 接 法 平 板 表 面 涂 布 的 细 菌 和 裂 缝 中 的 细 菌 相 同, 首 先 按 标 准 纸 片 扩 散 法 操 作, 贴 上 CAZ,CTX,AZT 药 敏 纸 片, 距 离 纸 片 3mm 处 刻 一 裂 缝 加 入 浓 度 为 cfu/ml 菌 液,35 过 夜, 抑 菌 环 形 状 改 变 为 阳 性
37 间 接 法 平 板 表 面 涂 布 的 细 菌 是 用 已 知 对 检 测 用 的 药 物 敏 感 菌 株 如 ATCC25922, 裂 缝 中 为 受 试 菌 ; 如 果 受 试 菌 干 扰 敏 感 菌 株 形 成 抑 菌 环 的 现 象 为 阳 性
38 3 Etest 法 按 照 标 准 纸 片 扩 散 法 操 作, 贴 上 CAZ/CAZ+CLA CTX/CTX+CLA 等 用 于 检 测 ESBLs 的 E- 试 验 纸 条, 放 置 35 18h 结 果 判 读 : 加 克 拉 维 酸 的 MIC 值 比 不 加 克 拉 维 酸 的 MIC 值 降 低 3 个 倍 数 为 产 ESBLs 菌 株
39 4 自 动 化 仪 器 如 Vitek-Ams 仪 器, 用 专 门 检 测 ESBLs 的 药 敏 卡 进 行 检 测 被 试 菌, 仪 器 自 动 读 取 结 果
40 5 NCCLs 推 荐 的 检 测 肺 炎 克 雷 伯 菌, 产 酸 克 雷 伯 菌, 大 肠 埃 希 菌 和 2005 年 NCCLs 推 荐 的 检 测 变 形 杆 菌 中 ESBLs 的 筛 选 和 确 证 试 验 具 体 方 法 有 纸 片 扩 散 法 和 稀 释 法 ( 包 括 琼 脂 稀 释 法 和 肉 汤 稀 释 法 )
41 (1) 纸 片 扩 散 筛 选 试 验 方 法 同 标 准 纸 片 扩 散 法 标 准 纸 片 扩 散 法, 选 用 头 孢 泊 肟 (10ug/ 片 ) 头 孢 他 定 氨 曲 南 头 孢 噻 肟 或 头 孢 曲 松 (30ug/ 片 ) 药 敏 纸 片 中 的 至 少 两 种 进 行 试 验, 放 h, 按 NCCLs 标 准 进 行 判 断 凡 头 孢 泊 肟 或 头 孢 他 定 抑 菌 环 直 径 22mm, 头 孢 曲 松 25mm, 氨 曲 南 或 头 孢 噻 肟 27mm, 均 应 高 度 怀 疑 为 ESBL 菌 株 并 进 一 步 作 确 证 试 验
42 确 证 试 验 用 CAZ,30ug/ 片 和 CAZ/CLA(30ug/10ug); CTX, 30ug/ 片 和 CTX/ CLA (30ug/10ug); h 读 取 结 果, 分 别 测 量 两 种 纸 片 单 独 及 加 克 拉 维 酸 的 抑 菌 环 直 径, 加 克 拉 维 酸 与 不 加 克 拉 维 酸 的 抑 菌 环 直 径 之 差 5mm 判 断 为 产 ESBL
43 质 控 菌 株 大 肠 埃 希 菌 ATCC25922( 药 物 联 合 克 拉 维 酸 后 与 单 药 的 抑 菌 环 直 径 之 差 2mm; 肺 炎 克 雷 伯 菌 ATCC700603(CAZ 联 合 CLA 的 抑 菌 环 直 径 与 单 独 CAZ 抑 菌 环 直 径 之 差 5mm), CTX 联 合 CLA 的 抑 菌 环 直 径 与 单 独 CTX 抑 菌 环 直 径 之 差 3mm) 肺 炎 克 雷 伯 菌 ATCC 质 控 范 围 ; 头 孢 泊 肟 抑 菌 环 直 径 为 7-16mm, 头 孢 他 定 为 10-18mm, 氨 曲 南 为 9-17mm, 头 孢 噻 肟 为 17-25mm, 头 孢 曲 松 为 16-24mm
44 肉 汤 稀 释 法 筛 选 试 验
45 头 孢 泊 肟 头 孢 他 定 氨 曲 南 头 孢 噻 肟 或 头 孢 曲 松 药 敏 均 为 1ug/ml, 使 用 一 种 以 上 药 物 进 行 筛 选,MIC 2ug/ml, 可 疑 产 ESBL
46 确 证 试 验
47 头 孢 他 定 /ml, 头 孢 他 定 / 克 拉 维 酸 0.25/4-128/4ug/ml, 头 孢 噻 肟 ug/ml, 头 孢 噻 肟 / 克 拉 维 酸 / /4ug/ml, 两 组 药 物 同 时 使 用 结 果 加 克 拉 维 酸 后 MIC 比 不 加 的 MIC 值 降 低 3 个 以 上 倍 比 稀 释 度, 判 断 为 产 ESBL( 如 : 头 孢 他 定 MIC=8ug/ml, 头 孢 他 定 / 克 拉 维 酸 的 MIC 为 1ug/ml)
48 6 PCR 方 法 PCR 方 法 进 行 扩 增 ESBLs 的 特 异 基 因 片 段 ( 选 用 TEM SHV 和 CTX 的 通 用 引 物 ), 通 过 DNA 测 序 进 行 分 型
49 以 上 几 种 方 法 的 评 价 以 上 几 种 方 法 各 有 优 缺 点, PCR 方 法 和 DNA 测 序 适 用 于 科 研 Etest 法 和 自 动 化 仪 器 法 简 便 快 速, 但 价 格 也 较 贵 三 维 法 准 确 但 较 烦 锁, 双 纸 片 协 同 法 的 试 验 结 果 受 双 纸 片 之 间 距 离 很 大 影 响, 国 外 也 有 同 样 的 报 道, 双 纸 片 之 间 距 离 为 15mm 时 比 20mm 时 提 高 ESBLs 菌 株 的 检 出 率
50 NCCLs 推 荐 的 纸 片 扩 散 法 简 便, 价 廉 而 且 检 出 率 高, 适 合 于 各 级 实 验 室 常 规 应 用, 琼 脂 稀 释 法 实 用 于 同 时 检 测 大 批 量 菌 株, NCCLs 推 荐 的 方 法 应 该 做 为 检 测 ESBLs 的 标 准 方 法 在 试 验 中 注 意 保 存 含 棒 酸 的 抗 生 素 纸 片 以 避 免 棒 酸 失 效 国 外 也 有 报 道 含 棒 酸 的 抗 生 素 纸 片 在 -20 冰 箱 内 可 保 存 2 周
51 二 AmpC ß- 内 酰 胺 酶 及 检 测 1 AmpC ß- 内 酰 胺 酶 是 头 孢 菌 素 酶, 为 Bush 分 类 c 组 1 型 酶, 通 常 称 1 型 AmpC 产 该 酶 菌 株 对 ß- 内 酰 胺 类 抗 菌 素 广 泛 耐 药 如 窄 谱 广 谱 超 广 谱 头 孢 菌 素 类 和 ß- 内 酰 胺 类 联 合 酶 抑 制 的 抗 菌 素 以 及 氨 曲 南 耐 药
52 2 产 生 酶 AmpC 的 菌 株 肠 杆 菌 属 ( 阴 沟 肠 杆 菌 产 气 肠 杆 菌 ) 弗 劳 地 枸 橼 酸 杆 菌 粘 质 沙 雷 菌 铜 绿 假 单 胞 菌 普 通 / 奇 异 变 形 杆 菌 大 肠 埃 希 菌 肺 炎 克 雷 伯 菌 摩 根 菌
53 3 AmpC 酶 特 性 AmpC 酶 是 由 染 色 体 或 质 粒 编 码 的 酶
54 (1) 染 色 体 编 码 的 AmpC 酶 AmpC 酶 由 激 活 一 抑 制 基 因 ampr 进 行 调 节 控 制,AmpD 基 因 为 ampr 基 因 提 供 抑 制 子 蛋 白, 在 正 常 情 况 下 使 AmpC 酶 处 于 抑 制 状 态 或 AmpC 酶 低 水 平 表 达 该 组 酶 不 被 ß- 内 酰 胺 酶 抑 制 剂 如 克 拉 维 酸 舒 巴 坦 和 他 唑 巴 坦 所 抑 制
55 AmpC 酶 是 通 过 诱 导 产 生 的 ( 除 外 部 分 大 肠 埃 希 菌 和 志 贺 菌 是 结 构 酶 ) 在 用 头 孢 菌 素 治 疗 过 程 可 促 使 AmpC 酶 控 制 基 因 突 变, 当 启 动 子 内 选 择 性 的 某 一 个 基 因 突 变 后 而 去 控 制 作 用, 即 发 生 AmpC 酶 持 续 高 水 平 表 达, 导 致 对 头 孢 菌 素 和 头 霉 素 类 及 AmpC ß- 内 酰 胺 酶 抑 制 剂 耐 药
56 (2) 质 粒 介 导 AmpC ß- 内 酰 胺 酶 产 生 机 制 : 是 由 染 色 体 上 的 AmpC ß- 内 酰 胺 酶 基 因 转 移 到 质 粒, 质 粒 上 的 耐 药 基 因 又 可 转 移 给 其 它 细 菌 大 多 数 质 粒 介 导 AmpC ß- 内 酰 胺 酶 失 去 ampr 调 节 基 因 而 持 续 高 产 AmpC 酶
57 质 粒 介 导 的 AmpC ß- 内 酰 胺 酶 菌 株 检 出 情 况 1989 年 韩 国 首 次 报 道 质 粒 介 导 的 AmpC ß- 内 酰 胺 酶 (CMY-1), 美 国 philip E coudron 等 人 报 道 AmpC ß- 内 酰 胺 酶 大 肠 埃 希 菌 为 1.6% (11/638), 肺 炎 克 雷 伯 菌 1.1%(4/37), 奇 异 变 形 杆 菌 为 0.4%(1/232), 希 腊 Gazouli 等 报 道 从 10 所 医 院 检 出 产 AmpC 酶 大 肠 埃 希 菌 2.6%(55/2133), 上 海 第 六 人 民 医 院 蒋 燕 群 等 人 报 道 检 出 出 产 AmpC 酶 大 肠 埃 希 菌 为 0.3% (131), 肺 炎 克 雷 伯 菌 为 0.4%(1/24)
58 近 年 报 道 AmpC 酶 有 20 多 种 基 因 型 如 MIR 和 ACT-1 起 源 于 阴 沟 杆 菌 ;BiL,CMY-2,-3,-4, -5 和 LAT-1,-2,-3,-4 起 源 于 弗 劳 地 枸 橼 酸 杆 菌 ;CMY-1,FOX-1,-2,-3,-4 起 源 于 铜 绿 假 单 胞 菌 ;DHA-1 来 自 摩 根 摩 根 菌 ;ACC-1 来 源 于 蜂 房 哈 夫 尼 亚 菌 染 色 体 编 码 的 AmpC 酶, 并 发 现 携 带 ACC-1 酶 肺 炎 克 雷 伯 菌 在 一 个 ICU 病 房 爆 发 流 行 质 粒 介 导 的 AmpC ß- 内 酰 胺 酶 菌 株 对 头 孢 菌 素 类 和 头 霉 素 类 耐 药 CMY-2 酶 和 相 关 的 ß- 内 酰 胺 酶 对 他 唑 巴 坦 敏 感
59 4 质 粒 介 导 的 AmpC ß- 内 酰 胺 酶 检 测 方 法 纸 片 法 筛 选 法 : (1) 检 测 原 理 是 AmpC 酶 不 被 克 拉 维 酸 和 EDTA 抑 制 而 被 氯 唑 西 林 (Cloxacillin) 抑 制
60 (2) 试 验 菌 株 对 头 孢 西 丁 耐 药 而 对 氯 唑 西 林 敏 感 为 可 凝 产 AmpC 酶 菌 株 PHILIP E.COURON 等 用 头 孢 西 丁 (30ug/ 片 ) 药 敏 纸 片 筛 选 AmpC 酶 菌 株, 若 抑 菌 环 直 径 <18mm 就 用 三 维 方 法 做 确 证 试 验 ( 头 孢 西 丁 药 敏 纸 片 筛 选 法 敏 感 好 但 特 异 性 差, 特 别 是 对 肺 炎 克 雷 伯 菌, 因 为 对 头 孢 西 丁 耐 药 还 有 其 它 机 理 如 外 膜 微 孔 缺 失 等 )
61 三 维 方 法 与 检 测 ESBLs 的 相 同 (1) 酶 粗 提 取 物 的 制 备 : 挑 取 血 平 板 上 过 夜 生 长 的 菌 落 制 成 0 5 号 麦 氏 单 位 菌 悬 液, 取 50ug 加 入 12ml 胰 化 大 豆 肉 汤 中 35 培 养 4h, 离 心 沉 淀, 弃 去 上 清, 将 沉 淀 物 反 复 冻 融 5 次, 离 心 取 上 清 ( 直 接 涂 片 无 细 菌 及 细 菌 培 养 为 阴 性 ) 加 1.5ml 磷 酸 盐 缓 冲 液, 于 1200 转 4 离 心 -20 保 存
62 (2) 操 作 方 法 和 结 果 判 读 按 标 准 纸 片 扩 散 法 操 作, 将 ATCC25922 大 肠 埃 希 菌 制 成 0.5 号 麦 氏 单 位 的 菌 悬 液, 均 匀 涂 布 于 M-H 平 板 上 将 30ug/ 片 头 孢 西 丁 贴 在 M-H 平 板 上, 使 用 刮 胡 刀 片 在 离 纸 片 边 缘 5mm 处 由 里 向 外 放 射 性 的 开 一 条 狭 缝 然 后 取 25~30ul 酶 粗 提 物 由 里 向 外 加 入 狭 缝 内, 避 免 液 体 溢 出 35 培 养 过 夜, 若 看 到 狭 缝 与 抑 菌 环 交 接 处 的 抑 菌 环 变 形 并 且 在 此 有 细 菌 扩 大 生 长 区, 可 判 断 为 三 维 试 验 结 果 阳 性 反 之, 在 交 接 处 无 细 菌 生 长, 抑 菌 环 呈 圆 形, 为 阴 性 同 时 使 用 AmpC 酶 阳 性 和 阴 性 菌 株 做 质 控
63 (3)PCR 方 法
64 5 对 产 AmpC 酶 菌 株 的 治 疗 选 药 (1) 第 四 代 头 孢 菌 素 如 头 孢 吡 肟 对 AmpC 酶 是 低 诱 导, 对 ß- 内 酰 胺 酶 是 低 亲 合 力, 对 产 AmpC 酶 菌 株 有 较 强 的 抗 菌 作 用, 其 敏 感 性 与 泰 能 相 似, 可 作 为 替 代 性 首 选 药
65 (2) 碳 青 酶 烯 类 如 泰 能, 虽 然 其 能 诱 导 产 生 AmpC 酶, 但 只 是 暂 时 性 增 加, 如 果 更 换 另 一 种 抗 生 素, 这 种 诱 导 会 消 失 碳 青 酶 烯 类 耐 酶 性 强, 耐 药 率 低, 仍 可 选 择 敏 感 药 治 疗
66 (3) 选 择 非 ß- 内 酰 胺 酶 类 如 氟 喹 诺 硐 类 和 氨 基 糖 苷 类 药 物 (4) 避 免 使 用 三 代 头 孢 菌 素 及 其 酶 抑 制 剂
67 三 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 及 其 检 测 随 着 产 ESBLs 和 AmpC 酶 菌 株 不 断 增 加, 碳 青 酶 烯 类 抗 生 素 如 亚 胺 配 能 的 使 用 量 也 增 多, 而 后 出 现 了 水 解 碳 青 酶 烯 ß- 内 酰 胺 酶
68 ( 一 ) 碳 青 酶 烯 酶 的 分 类, 功 能 及 来 源 1 水 解 碳 青 酶 烯 ß- 内 酰 胺 酶 有 两 大 类, 一 类 是 Bush 分 类 A 组 2f 型 酶, 在 酶 的 活 性 部 位 有 一 丝 氨 酸, 称 为 非 金 属 碳 青 酶 烯 酶, 该 酶 能 被 克 拉 维 酸 抑 制, 不 被 EDTA 抑 制 非 金 属 碳 青 酶 烯 酶 能 水 解 青 霉 素 类, 头 孢 菌 素 类 和 碳 青 酶 烯 类 抗 生 素 还 发 现 某 些 菌 株 同 时 具 有 AmpC 酶, 因 此 对 ß- 内 酰 胺 类 抗 生 素 耐 药 谱 广 研 究 发 现 IMI-1 和 NMC- A 酶 来 自 阴 沟 肠 杆 菌,Sme-1 酶 来 自 粘 质 沙 雷 菌, 但 是 非 金 属 碳 青 酶 烯 酶 的 发 生 率 极 低 另 一 类 是 Bush 分 类 B 组 酶, 在 酶 的 活 性 部 位 有 金 属 锌, 称 为 金 属 ß- 内 酰 胺 酶
69 2 大 多 数 ß- 内 酰 胺 酶 是 由 染 色 体 介 导 的 酶 不 被 ß- 内 酰 胺 酶 抑 制 剂 克 拉 维 酸 舒 巴 坦 和 他 唑 巴 坦 抑 制, 但 是 能 被 EDTA 抑 制
70 3 产 生 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 菌 株 :1982 年 Saino 从 嗜 麦 芽 窄 食 单 孢 菌 中 发 现, 此 后 在 腊 样 芽 孢 杆 菌, 洋 葱 伯 克 霍 尔 德 菌, 脆 弱 类 杆 菌,Chryseobacterium( 以 前 称 黄 杆 菌 属 Flavobacterium) 菌 种, 高 曼 军 团 菌, 芳 香 黄 杆 菌, 窄 食 单 孢 菌 和 气 单 孢 菌 中 的 不 同 种 中 发 现 洋 葱 伯 克 霍 尔 德 菌,AsbM1 和 CphA 来 自 气 单 孢 菌
71 4 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 分 类 及 功 能 : Bush 分 类 B 组 中 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 有 3a 3b 3c 三 个 型 3a 型 酶 能 水 解 青 霉 素 类, 头 孢 菌 素 类 和 碳 青 酶 烯 类 抗 生 素 3a 型 中 有 的 酶 来 自 腊 样 芽 孢 杆 菌,CcrA 来 源 于 脆 弱 类 杆 菌,L1 酶 来 自 嗜 麦 芽 窄 食 单 孢 菌, 以 及 质 粒 介 导 的 酶 IMP-1; 3b 型 酶 选 择 性 地 水 解 碳 青 霉 稀 类 抗 生 素, 该 型 酶 活 性 部 位 有 锌 离 子 时 酶 才 有 最 大 的 活 性, 3b 型 酶 发 现 在 芳 香 黄 杆 菌,3c 型 水 解 头 孢 菌 素 类 和 碳 青 酶 烯 类, ß- 内 酰 胺 酶 来 自 高 曼 军 团 菌
72 5 质 粒 编 码 的 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 90 年 代 初 期 在 日 本, 从 沙 雷 菌 中 发 现 了 由 质 粒 编 码 的 IMP-1 金 属 ß- 内 酰 胺 酶, 同 时 也 发 现 这 些 酶 存 在 于 肺 炎 克 雷 伯 菌 和 绿 脓 杆 菌 中 最 近 在 福 氏 志 贺 菌 中 发 现 一 个 新 的 质 粒 介 导 MET-1 酶, 对 亚 胺 配 能 低 耐 药 意 大 利 在 鲍 曼 不 动 杆 菌 中, 新 加 坡 在 肺 炎 肺 炎 克 雷 伯 菌 株 中 都 发 现 这 种 酶, 而 法 国 也 有 同 样 报 道 目 前 虽 然 检 出 率 不 高, 但 是 由 的 质 粒 介 导 细 菌 易 于 传 播, 加 强 对 其 检 测 十 分 必 要
73 ( 二 ) 质 粒 介 导 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 检 测 方 法 1 纸 片 扩 散 试 验 ( 过 筛 试 验 ) (1) 原 理 : 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 抑 制 剂 能 阻 断 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 的 产 生, 重 金 属 盐 如 CUcl2 和 Fecl2 在 纸 片 周 围 形 成 环 形 沉 淀 并 有 杀 菌 作 用, 其 抑 制 生 长 圈 能 扩 散 到 含 CAZ 的 纸 片
74 2 试 验 材 料 (1) CAZ 纸 片 2 张 (30ug/ 片 ) (2) 无 菌 滤 纸 片 1 张 (3) 被 测 菌 是 对 CAZ 耐 药 的 革 兰 阴 性 菌 株 (4) 质 控 菌 株 : 产 ESBLs 菌 株, 高 产 AmpC 酶 菌 株, 产 IMP-1 酶 菌 株 (5) 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 抑 制 剂 : CUcl2 和 Fecl2 或 EDTA 或 硫 化 合 物 ( 颈 基 乙 酸 二 颈 基 丙 酸 和 颈 基 乙 醇 )
75 3 方 法 制 备 测 试 菌 菌 悬 液 浓 度 为 10 6 CFU/ml, 按 照 NCCLs 推 荐 的 纸 片 扩 散 法 进 行 操 作, 将 两 片 CAZ 纸 片 (30ug/ 片 ) 贴 在 M-H 平 板 上, 两 纸 片 中 心 距 离 为 4~5CM 在 距 离 CAZ 纸 片 1~2.5CM ( 纸 片 中 心 距 离 ) 贴 一 张 无 菌 滤 纸 片 并 在 此 纸 片 上 加 入 2~5ul 的 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 抑 制 剂 ( 任 选 下 列 一 种 :CUCL 2,100mM(5ul), 或 Fecl 2 100mM(5ul) 或 EDTA,100mM(5ul), 或 硫 化 合 物 未 稀 释 液 (2~3ul) 放 置 35 过 夜
76 4 判 断 结 果 重 金 属 盐 如 CUcl2 和 Fecl2 在 纸 片 周 围 形 成 环 形 沉 淀 抑 制 生 长 圈 扩 大 到 含 CAZ 的 纸 片 为 产 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 对 产 AmpC 和 ESBLs 菌 株 未 出 现 抑 制 生 长 圈 扩 大 到 含 CAZ 的 纸 片, 为 阴 性 根 据 文 献 报 道 Hgcl 2 的 试 验 结 果 比 CUcl2 和 Fecl2 的 试 验 结 果 易 于 观 察, 但 是 因 其 对 人 体 有 害 不 易 才 用
77 PCR 方 法 PCR 方 法 检 测 金 属 ß- 内 酰 胺 酶 blal IMP 基 因 PCR 引 物 见 参 考 文 献 (J.0f clin.micro.jan 2000,p40-43)
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