幻灯片 1

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1 卫生部临床检验中心微生物实验室 胡继红 第十三条二级以上医院应当根据实际需要, 建立符合实验室生物安全要求的临床微生物室 临床微生物室开展微生物培养 分离 鉴定和药物敏感试验等工作, 提供病原学诊断和细菌耐药技术支持, 参与抗菌药物临床应用管理工作 第六条抗菌药物临床应用实行分级管理 根据安全性 疗效 细菌耐药性 价格等因素, 将抗菌药物分为三级 : 非限制使用级 限制使用级与特殊使用级 具体划分标准如下 : ( 一 ) 非限制使用级抗菌药物是指经长期临床应用证明安全 有效, 对细菌耐药性影响较小, 价格相对较低的抗菌药物 ; ( 二 ) 限制使用级抗菌药物是指经长期临床应用证明安全 有效, 对细菌耐药性影响较大, 或者价格相对较高的抗菌药物 ; ( 三 ) 特殊使用级抗菌药物是指具有以下情形之一的抗菌药物 : 1. 具有明显或者严重不良反应, 不宜随意使用的抗菌药物 ; 2. 需要严格控制使用, 避免细菌过快产生耐药的抗菌药物 ; 3. 疗效 安全性方面的临床资料较少的抗菌药物 ; 4. 价格昂贵的抗菌药物 抗菌药物分级管理目录由各省级卫生行政部门制定, 报卫生部备案 第三十二条医疗机构应当开展细菌耐药监测工作, 建立细菌耐药预警机制, 并采取下列相应措施 : ( 一 ) 主要目标细菌耐药率超过 30% 的抗菌药物, 应当及时将预警信息通报本机构医务人员 ; ( 二 ) 主要目标细菌耐药率超过 40% 的抗菌药物, 应当慎重经验用药 ; ( 三 ) 主要目标细菌耐药率超过 50% 的抗菌药物, 应当参照药敏试验结果选用 ; ( 四 ) 主要目标细菌耐药率超过 75% 的抗菌药物, 应当暂停针对此目标细菌的临床应用, 根据追踪细菌耐药监测结果, 再决定是否恢复临床应用 以临床认同的准确 最低的成本 最快的速度 最大限度 提供对临床或流行病学有用的信息 Jay P.Sanford M.D. 1

2 可培养 细菌 放线菌 真菌 支原体 衣原体 ( 细胞内寄生 ) 病毒 ( 细胞内寄生 ) 立克次体 螺旋体 不可培养临床微生物实验室 : 以细菌 真菌及可培养病原菌为主要诊断对象, 并根据个体化治疗的需要, 对引起感染的病原菌进行药物敏感性试验, 给临床提供使用抗生素治疗的依据 标本来源 全身各部位 ; 标本分析前影响因素多, 标本前处理对检验人员要求高, 标本合格判断难度大 检验过程环节多, 技术含量高 : 接种培养孵育分纯筛查 排除可疑致病菌 ( 试剂, 手工 ) 鉴定 ( 仪器 / 手工 ) 确认试验 ( 试剂, 手工 ) 药敏试验需有丰富经验人员判断培养结果与感染是否相关并报告 病原菌是未知的, 有内源性和外源性 ; 手工操作多, 对实验人员的专业基础知识要求高, 特别要靠经验判断, 还要不断更新知识 ; 新出现病原 耐药菌变异 ; 仪器也不能解决所有问题 ; 需多种方法和技术 来自通常无菌部位的标本血液 脑脊液 无菌体液 ( 胸水 腹水 关节积液 ) 来自手术采集的标本组织或深部脓液 来自与外界相通的腔道的标本 ( 呼吸道 消化道 泌尿生殖道 皮肤 ) 有正常菌群干扰的标本 ( 咽拭子 痰 阴道宫颈拭子 便 尿 ) 同时接收各类细菌学标本处理顺序 顺序常见标本 最长处理时间 1 来自手术和正常无菌部位标本 20min 2 运送接种淋球菌标本平皿 / 非运送培养基试子 20min 3 CSF 20min 4 组织 体液 脓液 1h 5 非运送培养基试子采集便标本 采集后 30min 6 痰 下呼吸道培养标本 室温 1h 7 血 采集后室温 4h 8 运送培养基试子标本 4,8h 9 尿 4,24h 内 10 A 群和 B 群链球菌培养 4,8h 引起中枢神经系统感染的常见致病菌 急性细菌性脑膜炎 脑脓肿 脑膜炎奈瑟菌 肺炎链球菌 无乳链球菌产单核李斯特菌 流感嗜血杆菌大肠杆菌 肠杆菌科 金黄色葡萄球菌钩端螺旋体 厌氧菌 ( 少 ) 链球菌属 厌氧菌 金黄色葡萄球菌肠杆菌科 洋葱伯克霍德菌 脑膜炎奈瑟菌肺炎链球菌 无乳链球菌 产单核李斯特菌放线菌属 奴卡菌属 分枝杆菌属 2

3 苛养菌 G+c G-b 厌氧菌其他 肺炎链球菌 草绿色链球菌 牛链球菌化脓链球菌 无乳链球菌 嗜血杆菌属 卡他莫拉菌 奈瑟菌属 JK 棒状杆菌 产单核李斯特菌 金黄色葡萄球菌 凝固酶阴性葡萄球菌粪肠球菌 屎肠球菌 肠杆菌科 假单胞菌属 嗜麦芽窄食单胞菌洋葱伯克霍德菌 不动杆菌 黄杆菌属 拟杆菌属 梭杆菌属 普雷沃菌属 卟啉单胞菌属 消化链球菌属 分枝杆菌属, 念珠菌属 菌血症休克 先天性瓣膜心内膜炎 心包炎心肌炎 脑膜炎奈瑟菌 流感嗜血杆菌 肺炎链球菌沙门菌属 肠杆菌科 耶尔森菌属弧菌 假单胞菌属 草绿色链球菌 牛链球菌 马链球菌粪肠球菌 屎肠球菌 耐久肠球菌化脓链球菌 无乳链球菌棒状杆菌属 李斯特菌属嗜血杆菌属 假单胞菌属 金黄色葡萄球菌 肺炎链球菌 化脓链球菌大肠杆菌 变形杆菌 铜绿杆菌 沙门氏菌脑膜炎奈瑟菌荚膜组织胞浆菌 念珠菌属 曲霉菌属肺炎支原体 3

4 ( 一 ) 传统检验技术 1 形态学检查 2 分离培养 3 鉴定 4 血清学检查 ( 二 ) 细菌 / 酵母样真菌的自动化检验技术 ( 三 ) 现代免疫学检测技术 ( 四 ) 分子生物学技术 1 不染色标本检查利用细菌半透明特性, 观察细菌形态 动力及运动状况 : 弧菌 螺旋体 弯曲菌等运动方式独特, 有诊断意义 压滴法 悬滴法等 2 染色标本检查 革兰染色 : 光学显微镜下, 革兰阳性菌 革兰阴性菌, 形态 : 球菌 链球菌 杆菌 抗酸染色 : 阳性 分枝杆菌 结核杆菌 ; 墨汁染色 : 隐球菌 芽孢染色 : 芽孢杆菌 鞭毛染色 : 特殊鞭毛 基于形态学的基本的细菌鉴定 需氧 厌氧 革兰染色的准备 革兰阳性 革兰阴性 革兰阳性 革兰阴性 涂片要薄, 以便光线能透过 杆菌 : 棒状杆菌属李斯特菌属放线菌属乳酸杆菌丹毒丝菌属杆菌奴卡菌属分枝杆菌属 球菌 : 触酶阳性 : 葡萄球菌微球菌 触酶阴性 : 链球菌肠球菌 杆菌 : 肠杆菌科大肠埃希, 克雷伯沙雷菌属摩根菌属, 志贺菌属, 沙门菌属, 耶尔森菌属, 普罗维登菌属, 等不动杆菌属假单胞菌属单胞菌属气单胞菌属弧菌弯曲杆菌属 球菌 : 奈瑟菌属莫拉菌属 球菌 : 消化链球菌属 杆菌 : 梭菌属丙酸杆菌属放线菌乳酸杆菌属 球菌 : 韦荣球菌属 杆菌 : 类杆菌属梭菌属普氏菌属卟啉单胞菌属 染色之前必须完全干燥 用甲醇固定并完全干燥 脱色是至关重要的步骤 布鲁氏菌弗朗西斯菌属鲍特氏菌属 完全干燥后才可以加显微镜油观察 艾肯菌属 巴斯德菌属 嗜血杆菌 军团菌属 脱色 1. 尽可能除去多余的水 2. 水池中需要有轻柔流动的流水 3. 在光亮的背景下观察玻片 4. 玻片平放时滴加脱色剂 5. 轻柔晃动玻片的两边, 使得结晶紫来回地流动 6. 当停止流动后立刻将玻片用流水清洗以停止脱色 读片 首先用 40 倍镜纵览全片 用低倍镜 (40X) 寻找中性粒细胞和上皮细胞 对细菌进行计数 每油镜视野下 <1 个细菌 = 稀少 (1+) 每油镜视野有 1-5 个细菌 = 少量 (2+) 每油镜视野下有 5-30 个细菌 = 中等 (3+) 每油镜视野下 >30 个细菌 = 大量 (4+) 仔细辨认细菌的形态 4

5 组织或吸取物中革兰染色的评价 涂片准备 : 液体 1. 细胞甩片机 浓聚细胞和微粒 涂布成一层细胞厚的均匀的细胞层 2. 滴 清亮的液体 离心后用加样器移除 ml 的上清液 漩涡震荡沉淀物或者用加样器上下吹打 5 次 第一滴于玻片上, 不要涂抹开 干燥, 用甲醇固定, 再干燥 3. 粘稠的或脓性的液体 如血涂片那样涂片 镜下所见 出现鳞状上皮细胞 大量中性粒细胞 大量的中性粒细胞, 混合 G- 和 G+ 小细菌 少见或可见破损的中性粒细胞和粗大 G 不定的或 G+b 中性粒细胞罕见, 无其他体细胞 细胞内微生物 小的 浅的 不规则 链状排列 G+c 呈堆排列 很细小 G-b 备注 标本采集技术不过关, 培养提示皮肤菌群污染 长时间仔细寻找病原菌, 这时菌有可能在细胞内 混合厌氧或兼性厌氧菌感染 可能是梭菌属细菌引起的组织坏死, 手术应激, 提示产期荚膜梭菌引起的气性坏疽 病人没能产生足够的免疫反应, 或细菌没有能激活中性粒细胞 ( 如球菌 ), 仍然高度怀疑细菌感染 活动性细菌感染 如果分离自脓肿, 提示咽峡炎链球菌群 ( 米勒链球菌 ) 特别是如果标本为淋巴结或组织时, 这些菌可能为生物恐怖病原菌 ( 布氏杆菌, 耶尔森菌, 弗朗西斯菌 ), 标本须在安全柜里处理 平皿需用胶带封起来, 培养物只能在生物安全柜中进行 不可闻平皿 肺炎 - 可接受的标本采集不合理评述 很少鳞状上皮细胞 <10 个 / 低倍视野 很多中性粒细胞 很多中性粒细胞混合有形态多样的细菌 ( G-b, 纺锤形,G+c) 许多或中等量的中性 粒细胞, 以一种形态 的细菌为主 许多不着色的有分叉的杆菌 呼吸道标本的涂片模式 许多鳞状上皮 >10 个每低倍视野 很少有或没有中性粒细胞免疫抑制的病人也会出现中性粒细胞减少 酵母菌样, 酵母菌是一种很 少引起肺炎的细菌, 常由口 腔污染 可以在玻片上看到许多鳞状上皮细胞, 说明在 采集时受到了上呼吸道分泌物的污染或口水的 污染 中性粒细胞和上皮细胞都很少 : 标本需要培养 吸入性肺炎标本革兰染色的典型形式, 只培养 出正常菌群, 革兰染色是用于诊断的方法 G+ 双 c, 短链 = 肺炎链球菌 G+ 成群 = 金黄色葡萄球菌 G-cb( 小 )= 流感嗜血杆菌 G-b 大且肥厚 = 肺炎克雷伯菌或其他肠道菌 G- 双 c= 卡他莫拉菌 可能是肺结核, 抗酸杆菌不能被革兰染色所染 色 鉴定 药敏试验 ( 二 ) 临床微生物学常规检验方法 表型鉴定 手工基础性试验 商业化系统 自动 半自动 手工 实验室内手工鉴定体系 基因鉴定 ( 非常规方法 ) 基因测序 ( 金标准 ) 趋势 : 质谱方法 定性 (S,I,R): 纸片扩散法 手工定量 (MIC): 微量肉汤法,E-test 仪器 : 稀释法 筛选方法 ( 包括显色培养筛选 ) 确认方法 : 表型确认基因型确认 ( 对耐药基因测序 ) 形态 生理生化 血清学 ( 二 ) 病原微生物生活习性不同, 生长条件各异 标本前处理自动化 自动 ( 半自动 ) 鉴定药敏系统 对微生物检验流程标准化此外, 很多理念将影响真正病原菌的报告和对治疗的误导 营养 气体 温度 普通苛养 ( 加血和特殊生长因子 ) 选择性生长 ( 含某些抑制剂 ) 空气 普通培养箱 CO2(5-10%) 二氧化碳培养箱微需氧 (5%O2) 微需氧装置厌氧 (5%CO2,10%H2,85%N2) 厌氧装置 ( 细菌 ) 不同培养温度的温箱 ( 真菌 ) 42 ( 可调 ) 5

6 1) 与微生物检验人员的专业程度密切相关, 能够认识 评价和追踪有意义的培养细菌 ; 2) 可能造成假阴性结果的原因 采集和运输标本不理想 ( 可能控制的 ) 延误了培养时间 ; 培养环境错误, 如温度和气体 培养基营养不支持微生物的生长 病原菌数量很少, 或标本量不够检出 ( 敏感度 ) WBCs 和其他身体免疫因子抑制生长 在当时所有培养方法不能培养的微生物 ( 局限性 ) 3) 可能造成假阳性结果的原因 不同患者标本混淆 报告了污染菌 ( 从实验室或标本采集过程中 ) 4) 没有分离到病原菌 也不表明实验室不能检测, 其他的疾病有可能象感染性疾病的症状 ( 复杂性 ) 引发菌血症或血流感染前三位来源 : 血管内装置 (19%) 泌尿生殖道 (17%) 呼吸道感染 (12%) + 血培养 1 患者 2 标本采集方式 3 任何方式标本 无症状 :>10 万 cfu/ml 有症状 :1 万 cfu/ml,1-2 种条件致病菌 ;>2 种报告 : 报告 混合菌群 女性 :100cfu/ml 纯肠杆菌 男性 :1000cfu/ml 条件致病菌 清洁中段尿 : 10 万 cfu/ml 内置导尿管 : 10 万 cfu/ml 或任意数量条件致病菌 直接导管 :100 cfu/ml 条件致病菌肾脏手术 : 任意数量 膀胱穿刺 : 任意数量 ( 厌氧肉汤增菌 ) 金黄色葡萄球菌 酵母菌 报告临床的主要病原菌 A 群 β 溶血链球菌 ( 咽峡炎最常见致病菌, 造成严重的免疫系统疾病 ) C 群, G 群 β 溶血链球菌 ( 食源性, 引起咽峡炎爆发 ) 溶血隐秘杆菌 ( 选择报告可引起咽炎和扁桃体化脓 ) 不报告咽炎中非致病菌 金黄色葡萄球菌 肺炎链球菌 流感嗜血杆菌 ( 定植 ) 卡他莫拉菌 α 溶血链球菌 所有革兰阴性杆菌和 所有酵母菌 常规不应报告, 引起误导和不必要的治疗 6

7 下呼吸道标本有意义的细菌浓度值 (CFU/ml) 标本 有意义的浓度 CFU/ml 自然咳痰 10 7 诱导痰 不确定 气管内吸取物 10 6 支气管肺泡灌洗液 10 4 保护性毛刷 10 3 支气管灌洗液不做培养 检验并报告 : 化脓链球菌 B 群 β- 溶血链球菌 ( 儿童 ) 博德特菌属, 特别是支气管博德特菌 奴卡菌 新型隐球菌 淋病奈瑟菌 弗朗西斯吐拉菌 ( 高致病菌 ) 鼠疫耶尔森菌 ( 高致病菌 ) 炭疽芽孢杆菌 ( 高致病菌 ) 霉菌, 排除腐生菌污染 当培养达到有意义数量时, 非优势菌, 也报告 : 当培养少量, 涂片也见到时报告 : 卡他莫拉菌脑膜炎奈瑟菌 肺炎链球菌, 报告药敏 只对住院患者报告 : 流感嗜血杆菌, 报告 β- 内酰胺酶 铜绿假单胞菌, 报告药敏嗜麦芽窄食单胞菌不动杆菌, 报告药敏伯克霍德菌, 报告药敏 做氧化酶 三糖铁试验 : 报告 肠道革兰阴性杆菌 报告 非发酵革兰阴性杆菌 报告 分离到上呼吸道细菌 7

8 检测什么菌? 使用什么方法? 检测哪些抗菌药物? 如何报告结果? 只对与感染相关致病菌或可能致病菌做药敏试验, 否则将导致不必要的治疗 1 标本来源 (1) 无菌部位来源标本分离的细菌最具临床意义, 如脑脊液 血液 体液 骨髓等 血 无菌体液标本中分离的任何细菌均需做药敏试验 除外血培养分离的芽孢杆菌属 棒状杆菌属 单个培养阳性的凝固酶阴性葡萄球菌 ( 不包括路登葡萄球菌 ); 无菌体液中分离的芽孢杆菌属 如果多次培养分离出以上所示同一种细菌, 仍需做药敏试验 伤口, 脓肿和来自其他污染部位标本, 分离到中量或大量生长的 1 或 2 种潜在病原菌做药敏试验 ; 呼吸道标本 : 支气管肺泡灌洗液 / 保护性毛刷 对质量合格痰标本中分离的中量或大量生长的 1 或 2 种可能病原菌做药敏试验 对正常菌群或污染菌不做药敏试验 如果可推测敏感, 不需要检测药敏 伤口分离的化脓链球菌 ( 化脓链球菌通常对青霉素敏感 ) 尿道标本分离的淋病奈瑟氏菌 ( 淋病奈瑟氏菌通常对头孢曲松和头孢克肟敏感 ) 如果敏感性不定, 需要检测药敏 伤口分离的金黄色葡萄球菌 ( 金葡菌敏感性可变 ) 血中分离的大肠杆菌 ( 大肠杆菌抗菌谱不定 ) 大量生长, 通常做药敏 ; 少量生长 - 是否做药敏不定 尿液分离的大肠杆菌数目为 10E4 CFU/ml ( 无症状女性 ) 静脉插管尖端分离 1 个菌落的凝固酶阴性葡萄球菌 >10E5 CFU/ml 尿液中的大肠杆菌 >10E4 CFU/ml ( 清洁导管 ) 静脉插管尖端分离的凝固酶阴性葡萄球菌 >15 个菌落 纯培养通常做药敏 ; 混合细菌生长, 是否做药敏不定 ; 伤口分离的大量大肠杆菌, 肠杆菌属, 枸橼酸菌属 ( 可能是污染菌 ) 痰正常菌群中存在少量肺炎克雷伯菌 伤口大肠杆菌纯培养 痰中除正常菌群外存在大量肺炎克雷伯菌 8

9 分离自特定年龄组的一些细菌有必要检测药敏 22 岁青年, 痰正常菌群 + 流感嗜血杆菌 ( 中量 ) 2 岁儿童, 痰正常菌群 + 流感嗜血杆菌 ( 中量 ) 免疫正常 - 遵循一般规则 浅表伤口分离的少量鲍曼不动杆菌 浅表伤口分离的大量鲍曼不动杆菌 免疫抑制 - 病人, 一些不重要的细菌需要做药敏试验 肝移植病人浅表伤口分离的少量反硝酸盐不动杆菌 对选择药物过敏 青霉素过敏病人分离的化脓链球菌对红霉素有反应 青霉素过敏病人分离的化脓链球菌对红霉素无反应 检测什么菌? 使用什么方法? 检测哪些抗菌药物? 如何报告结果? 平板扩散法 (KB 法 ) 临床试验标准协会推荐 商业化的系统 ( 自动化的区域阅读程序 ) 关键性的步骤 : 准确地测量区域大小 肉汤微稀释法最小抑菌浓度 临床及实验室标准协会参考法 商业化的系统 关键性的步骤 : 为确保检测不被 污染, 用 纯度检查平板 接种微生物 关键性的步骤 ( 所有的方法 ): 正确地准备和标准化接种物 葡萄球菌 - 万古霉素 ; 达托霉素 肠球菌 - 万古霉素 中介 结果 ; 达托霉素 肺炎链球菌 - 头孢噻肟 / 头孢曲松 美罗培南 (CSF 常规报告 ) 青霉素, 阿莫西林 / 棒酸, 厄他培南 亚胺培南 头孢呋辛 头孢吡肟 草绿色链球菌 - 青霉素 Beta 溶血链球菌 - 达托霉素 洋葱伯克霍德菌 氯霉素 左氧氟沙星 氯霉素 非肠杆菌科 ( 除铜绿假单胞菌 ) 嗜麦芽窄食单胞菌 头孢他啶 氯霉素 替卡西林 / 棒酸 达普托霉素 葡萄球菌属 肠球菌属 β - 溶血链球菌 9

10 心内膜炎 脑膜炎 败血病 骨髓炎 免疫抑制 假体装置 虽然 敏感 但对治疗无反应的病人 使用自动化仪器或 CLSI 推荐方法均不能生长的菌株 菌株 / 药物的测试不能用纸片扩散法进行 ( 如葡萄球菌 - 万古霉素 ) 如需要检测 MIC 和 / 或较宽的药物浓度范围苛养菌 肺炎链球菌 厌氧菌 检测什么菌? 使用什么方法? 检测哪些抗菌药物? 如何报告结果? 选择测试 / 报告药物 确定一种药物的结果可否用于预测另一种药物 确认报告 危险 的药物 在报告中增加注释注意 : 表 1 列举的是美国常用的药物 ; 可能与其他国家有所不同 M100-S21 每个方格中的一群类似药物, 其结果解释 (S,I,R) 和临床疗效相似 ; 每个方格中药物间 或 字表明这些药物交叉耐药性和敏感性几乎完全相 同 ; 肠杆菌科绿脓假单胞菌葡萄球菌属肠球菌属 大量菌株检测时, 重要误差率 + 极重要误差率 <3%, 次要误差率低于 <10%; 或 用于解释 仅有敏感 解释标准的类似抗菌药物之间 ( 如头孢噻肟或头孢曲松对流感嗜血杆菌 ); 由 或 连接的一种抗菌药物试验结果可预报其他抗菌药物结果 无 或 连接的药物, 由于结果不一致或研究数据不充分, 一种药物检测结果不能预测其他药物结果 A 组 : 常规首选并常规报告 B 组 : 可用于首选试验, 但选择性报告, 当对 A 组同类药物耐药时可选用 脑脊液中分离肠道杆菌用三代头孢菌素 泌尿道分离菌株用复方新诺明 ; 多种微生物感染, 多部位感染 ; 对 A 组药物过敏 不耐受 / 无效 ; 感染控制目的 10

11 肠杆菌科绿脓假单胞菌葡萄球菌属肠球菌属肠杆菌科绿脓假单胞菌葡萄球菌属肠球菌属 C 组 : 替代性或补充性药物, 当某些医院潜在对数种基本药物 ( 特别是同类耐药的举办或广泛流行株 ; 治疗对基本药物过敏者 ; 治疗少见菌感染 ( 氯霉素用于肠道外分离的沙门菌 ) 或流行病学为目的向感染控制部门报告 ) U 组 : 仅用于或首选治疗泌尿道感染的抗菌药物 ( 如呋喃妥因 某些喹诺酮类 其他感染部位分离的病原菌不用常规报告此组药物 对于特殊闹的病原菌 ( 铜绿假单胞菌和氧氟沙星 ) 具有广泛适应症的其他药物可放在 U 组 11

12 检测什么菌? 使用什么方法? 检测哪些抗菌药物? 如何报告结果? 先报告窄抗菌谱, 最低毒性, 最小花费的 ( 一线 ) 药物 报告其它药物, 如果 : - 一线药物耐药 ( 主要的 ) - 来自特定的身体部位 - 对药物不耐受或不敏感的病人 - 多种微生物感染 - 多个部位感染 警告 例子 仅仅通过口服给药的试剂 MIC (μg/ml) 氨苄西林 1 敏感 甲氧苄啶 - 磺胺甲噁唑 0.5/9.5 敏感 头孢菌素对产单核李斯特菌无效 第一代和第二代头孢菌素类 ( 除了头孢呋辛钠 ) 和头霉素 克林霉素 大环内酯类 四环素类 氟喹诺酮类 CLSI M100-S19 对尿液分离出的菌株不要常规报告 阿奇霉素 氯霉素 克拉霉素 克林霉素 红霉素 仅仅对尿分离菌群报告 在 CLSI M100-S22 表 1 U 组中的药物 例如, 呋喃妥因和其它的! CLSI M100-S22 12

13 1 罕见的耐药表型是指一些细菌对特殊的抗菌药物尚未报道过耐药, 或极少见耐药 流感嗜血杆菌对卡巴配能类 3 代 4 代头孢菌素 氟喹诺酮类不敏感, 对氨苄西林耐药不产 β- 内酰胺酶 ; 淋病奈瑟菌对 3 代 4 代头孢菌素不敏感 ; 脑膜炎奈瑟菌对 3 代 4 代头孢菌素 对美罗培南 米诺霉素不敏感 肺炎链球菌对利奈唑烷 万古霉素不敏感 ; β- 溶血链球菌对氨苄西林或青霉素 头孢菌素不敏感 ; 草绿色链球菌对达托霉素 厄他培南或美罗培南 万古霉素不敏感 金葡菌万古霉素中介度等 对于只有敏感解释标准, 而检测为非敏感的菌株, 应采取如下措施 换一种方法复核鉴定和药敏结果或送参考实验室 ; 药敏结果复核应采用 CLSI 参考方法, 如肉汤微量稀释法 琼脂稀释法或纸片扩散法, 或一种 FDA 通过的商品化试验 金葡菌万古霉素 MIC 8μg/mL 不常见, 有些凝固酶阴性葡萄球菌万古霉素中介, 但万古霉素耐药菌株少见 应对 C 群和 G 群 β- 溶血链球菌确认是大菌落 如果氨苄西林或青霉素不敏感则是罕见耐药表型 ; 小菌落 C 群和 G 群 β- 溶血链球菌归到草绿色链球菌群 开始对某种抗菌药物 S 的菌株治疗后可发展为 I/R; 随后从身体相似部位分离出鉴定相同菌株, 应做药敏 ; 治疗后 3-4d 可出现耐药 : 3nd 头孢菌素治疗肠杆菌属 枸橼酸杆菌属和沙雷菌属 ; 所有抗菌药物治疗铜绿假单胞菌 ; 喹诺酮类治疗葡萄球菌. 金葡菌对延长疗程期间对万古霉素 S 菌株可发展为中介 MIC 为 4~8μg/mL, 适合的方法用 Etest 或含 6μg/mL 万古霉素脑心浸液平板 对葡萄球菌临床分离株检测甲氧西林耐药是强制性的 所有对甲氧西林 苯唑西林和 / 或头孢西丁耐药 或 meca 基因 PBP2a 试验阳性的葡萄球菌 : 应认为对现有的 β- 内酰胺类耐药, 包括青霉素类 β- 内酰胺 /β- 内酰胺抑制剂复合药物, 头孢类 ( 除外新的抗苯唑西林耐药金黄色葡萄球菌活性的头孢菌素, 如 ceftaroline 和头孢吡普 ) 和碳青霉烯类体外可能敏感, 但临床无效 实验室应了解患者的特殊情况和病情的严重性 ( 如从早产儿血培养中分离出阴沟杆菌 ); 实验室应明确对重复分离菌株何时重复药敏试验, 应与临床医师协商后决定 MRSAs 是指表达 meca 或具有另一种甲氧西林耐药机制, 如青霉素结核蛋白与苯唑西林的亲和力改变的金黄色葡萄球菌 检测 meca 介导的苯唑西林耐药 : 1 金黄色葡萄球菌和路登葡萄球菌 : 头孢西丁纸片法或 MIC 法 ; 2 凝固酶阴性葡萄球菌 ( 除路登葡萄球菌外 ): 首选头孢西丁纸片法 头孢西丁可用于检测苯唑西林耐药的替代品 ; 根据头孢西丁结果来报告苯唑西林敏感或耐药 3 用头孢西丁和苯唑西林同时检测金葡菌或路登葡萄球菌, 只要其中一个耐药, 既报告 苯唑西林耐药 13

14 250 腐生葡萄球菌 & 苯唑西林 MIC 值分布 S R 敏感率 93.4% % 敏感率 82.7% 48 R S 所有实验室苯唑西林 MIC 法结果范围 : g/ml MICs 分布 0.5-2g/ml 的实验室占 82.7% (387/468); 这株菌检测结果分布符合 CLSI 标准提示 : 某些苯唑西林 MIC 为 0.5~2g/ml 的非表皮葡萄球菌的凝固酶阴性葡萄球菌, 缺乏 meca 基因, 因此, 苯唑西林解释标准可能高估了这些菌的耐药性 对于苯唑西林为 MIC0.5~2g/ml 的非表皮葡萄球菌外的其他凝固酶阴性葡萄球菌引起的严重感染, 适合的检测方法 : 检测分离株的 meca 基因或 PBP2a 或头孢西丁纸片扩散法 检测葡萄球菌对万古霉素敏感性应用 MIC 法, 纸片法不能区分金葡菌的敏感与中介 (VSSA 和 VISA) 及凝固酶阴性葡萄球菌的敏感性 万古霉素纸片 (30μg) 可检测含 vana 基因的 VRSA, 纸片周围完全没有抑菌环, 需确认菌株鉴定结果 肠杆菌科细菌的耐药机制复杂, 按照检测耐药机制判断头孢菌素和卡巴培南的敏感性报告药敏结果带来很多问题,2010 年后 CLSI 根据药代动力学 / 药效学 (PK/PD) 性能评价和有限的临床资料, 修订了部分头孢菌素 ( 头孢唑啉 头孢噻肟 头孢他啶 头孢唑肟和头孢曲松 ) 和氨曲南 碳青霉烯类药敏判断折点, 并注释了新折点对应的用药方案 ; 降低肠杆菌科对头孢菌素 氨曲南和碳青霉烯类的敏感判断折点, 既可检测出有 临床意义 的耐药机制, 包括 ESBL 质粒介导的产 AmpC 酶菌株 ; 卡巴培南酶 (A B 和 D 类酶 ) 及联合 ( 去阻遏 AmpC 酶或产 ESBL 和通透性降低等 ) 耐药机制 无需做 ESBL 或改良 Hodge(MHT) 确认试验, 缩短了报告时间 ; 且动物模型 PK/PD 分析及蒙特卡罗公式均支持这种改变, 临床效果与 MIC 值的相关性好于报告产 ESBL 14

15 采用修订后折点, 可减少因报告 ESBL 菌株而更多使用卡巴配能类和氟喹诺酮类药物, 可减少对产卡巴配能酶等耐药机制菌株的选择性压力 从个体化治疗 医生选药上, 特别是各级医院开始执行政府抗菌药物分级管理的背景下, 采用修订折点是有积极意义的 重新评估折点的头孢菌素还有静脉用头孢呋辛 头孢吡肟 头孢替坦和头孢西丁 ; 头孢西丁符合当前临床试验数据和 PK/PD, 支持现有折点 ; 头孢替坦因无足够数据支持而未改变折点 ; 头孢呋辛和头孢吡肟根据标准推荐剂量治疗无需更改折点 目前临床折点的含义并不都是最佳折点, 因此, 根据微生物 PK/PD 和临床效果, 不断修订后的结果应能显示出 MIC 值与预期的临床结果更符合, 药敏标准的发展方向是预测抗感染治疗的预后, 而不是为了能检测细菌中出现的所有耐药机制 临床微生物实验室是否能提供准确和具有临床意义的检测信息, 是依赖 : 培养基质控菌株 (ATCC) 质控特性 血平板 肺炎链球菌 草绿色溶血 (α- 溶血 ), 典型菌落生长 标本的质量 ( 标本采集 运送 标本合格判断 / 处理 ) 试验方法的有效性 ( 涂片 培养 鉴定 药敏试验 ) 试验的操作步骤 试剂 培养基 仪器和人员 (QC) 报告结果 ( 准确 / 及时 / 有临床意义 ) 化脓链球菌 巧克力 流感嗜血杆菌 Β- 溶血, 生长良好 生长良好, 湿润 15

16 试验名称质控菌株 (ATCC) 试验结果 过氧化氢酶 (3%H2O2) 血浆凝固酶 ( 玻片法, 测凝集因子 ) 血浆凝固酶 ( 试管法, 测凝固酶 ) 阳性对照 : 金黄色葡萄球菌 阴性对照 : 粪肠球菌 阳性对照 : 金黄色葡萄球菌 阴性对照 : 表皮葡萄球菌 阳性对照 : 金黄色葡萄球菌 阴性对照 : 表皮葡萄球菌 试验名称质控菌株 (ATCC) 试验结果 氧化酶阳性对照 : 绿脓假单胞菌 阴性对照 : 大肠杆菌 β- 内酰胺酶阳性对照 : 金黄色葡萄球 阴性对照 : 流感嗜血杆菌 试验名称质控菌株 (ATCC) 奥普托辛 (OP) 肺炎链球菌 :S 其他草绿色链球菌 : R 杆菌肽化脓链球菌 :S CAMP ( 金葡菌 ) 其他 β- 溶血链球菌 : R 无乳链球菌 : 阳性 其他 β- 溶血链球菌 : 阴性 X/V 因子流感嗜血杆菌 : X/V:(-),X+V: (+) 其他嗜血杆菌属 : X 或 V: (+) 试验结果 革兰染色 : 使用大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌标准菌株进行质控 ; 抗酸染色 : 使用已知抗酸阳性菌株 ( 或标本 ) 进行质控 ; 每批试剂至少 1 次, 每周 1 次 最好定期做质控 当染色结果不确定时, 可做质控作为对照 革兰染色 : G+: 金黄色葡萄球菌 ATCC25923 G-: 大肠埃希菌 ATCC25922 抗酸染色 : 阳性 :Mube.trculosisATCC25177 阴性 : 大肠埃希菌 ATCC25922 使用厂家规定的标准菌株对相应试剂进行质控 每批试剂至少 1 次, 定期做 手工 半自动系统 自动系统 : 使用厂家规定的标准菌株做质控, 应符合预期结果 ; 质控频率 : 每批试剂使用前需要先做质控可增加质控次数 当使用新系统或新的操作人员以考察技术人员操作是否满足厂家操作说明书要求 温度 可接受范围 目的 25 ±1.0 酵母菌 霉菌 35 ±1.0 常规 30 ±1.0 酵母菌和霉菌 李斯特 42 ±0.5 沙门 / 弯曲菌分离 鲍曼不动杆菌 冷藏 4-8 储存培养基 试剂 冷冻 -20 低温 储存标本 试剂 贮存菌种 冷冻 -70 超低温 储存参考菌株和血清 16

17 / 能力测试 (PT) 室间质评 (EQA) 室内质控 (QC) 分析后 紧急报告值及时准确报告 标本留取 运送 分析前 考察试验结果正确性 (accuracy) 检查实验室间结果差异 考察实验室试验结果重复性 / 精确性 (precision) 而无法判断检验的正确性 标本合格判定培养基 试剂仪器设备 分析中 临床机构实验室管理 基本要求 参加微生物室间质量评价活动 检查实验室室内质控的质量 ; 了解本实验室与其他实验室之间的结果差异 ; 实验室认可的要求 关乎指导临床使用抗生素的正确与否 反映耐药监测数据和流行病学数据的准确性 年年参加全国临床微生物 EQA 实验室数 1 卫生部临床检验中心组织微生物室间质评活动 ( 并已通过国家认可委能力验证组织者认可 ) 参加单位 : 二级以上医院 ( 多数是综合医院 ) 微生物室 各省 市 自治区临床检验中心 400 负责各省 市 自治区微生物间质评活动 年 01 年 02 年 03 年 04 年 05 年 06 年 07 年 08 年 09 年 10 年 11 年 实验室数 2012 年参加实验室数 :1107 个 不断提高自身技术能力, 改进检验服务质量, 尽量 满足临床对感染病原学诊断的需要 ; 为临床提供快速 准确的结果和抗菌治疗的依据 ; 加强与临床医护人员沟通, 为医院和患者省钱 17

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