检验医学 2015 年 12 月第 30 卷第 12 期 LaboratoryMedicine,December2015,Vol.30No 敏感, 但治疗后林可霉素却变为耐药, 于是作者推测克林霉素和林可霉素治疗此类菌可能会引起治疗无效 [3] 大环内酯类( 如红霉素 ) 林可酰胺类

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志芽俞
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1 1238 文章编号 : (2015) 中图分类号 :R446.5 文献标志码 :A DOI: /j.isn 种表型试验检测葡萄球菌诱导型克林霉素耐药的评估及基因分析张静华, 袁应华, 刘妍, 成洁, 孙奋勇 ( 同济大学附属第十人民医院, 上海 ) 摘要 : 目的评价 MicroScan 革兰阳性复合板 ( 简称 PC33 复合板 ) 和 D 试验 ( 红霉素克林霉素双纸片法 ) 检测葡萄球菌诱导型克林霉素耐药的性能及耐药基因分析方法检测 115 株 PC33 复合板检测结果为红霉素耐药而克林霉素敏感的葡萄球菌对红霉素 / 克林霉素复合孔的耐药性, 同时用 D 试验检测红霉素对克林霉素的诱导耐药表型, 用聚合酶链反应 (PCR) 检测大环内酯类林可酰胺类链阳霉素 B 类复合药物 (MLS) 的耐药基因结果 PC33 复合板耐药检出率分别为金黄色葡萄球菌 61.3% 凝固酶阴性葡萄球菌 47.6%,D 试验耐药检出率分别为金黄色葡萄球菌 61.3% 凝固酶阴性葡萄球菌 51.2%,2 种方法的检测结果差异无统计学意义 (P> 0.5) 以 D 试验为判断标准计算 PC33 复合板检测克林霉素诱导耐药的敏感性为 95.1%, 特异性为 100.0%; 检出 erm 基因常见的结构型 MLS(cMLS) 耐药基因 erma 和诱导型 MLS(iMLS) 耐药基因 ermc 结论 PC33 复合板与 D 试验检测葡萄球菌诱导型克林霉素耐药的结果有很好的一致性 ;PC33 复合板有较好的临床应用价值实验室应加强克林霉素诱导耐药的检测, 以指导临床合理选用抗菌药物关键词 : 诱导型克林霉素耐药 ; 葡萄球菌 ;MicroScan 革兰阳性复合板 ;D 试验 ; 红霉素 ; 基因 Drugresistanceevaluation and geneanalysison thedetection ofinducibleclindamycin resistancein Staphylococcusby2phenotypetests ZHANGJinghua,YUANYinghua,LIUYan,CHENGJie,SUNFenyong. (TheTenthPeople shospitaloftongjiuniversity,shanghai200072,china) Abstract:Objective Toevaluatethedrugresistanceperformanceanddrugresistancegeneonthedetectionof inducibleclindamycinresistanceinstaphylococusbymicroscangram positivecompositeplate(pc33compositeplate) andd test(erythromycin and clindamycin double disk difusion method). Methods The drug resistance of erythromycin/clindamycincompositewelofthe115isolateswhichwereresistanttoerythromycinandsensitiveto clindamycinbymicroscanautomaticidentificationwasdetermined.meanwhile,theinducibleresistantphenotypeof erythromycintoclindamycinwasanalyzedbydtest,andtheresistantgenetomacrolide lincosamide streptograminb (MLS)wasdetectedbypolymerasechainreaction(PCR).Results ThedetectionratesofPC33compositeplatewere 61.3% forstaphylococusaureusand47.6% forcoagulase negativestaphylococus.thedetectionratesofdtestwere 61.3% forstaphylococusaureusand51.2% forcoagulase negativestaphylococus.thediferencebetweenthe2 methodshadnostatisticalsignificance(p>0.5).usingdtestasastandardtoevaluatepc33compositeplateresistant toinducibleclidamycinresistance,thesensitivitywas95.1%,andthespecificitywas100.0%.thepredominantgene forconstitutivemlb(cmls)resistancetoclindamycinwaserma.thepredominantgeneforinduciblemls(imls) resistancetoclindamycinwasermc.conclusions Thedetectionresultsofinducibleclindamycinresistancein StaphylococusbyMicroScanGram positivecompositeplateshowacoincidencewithdtest.pc33compositeplatehas goodclinicalsignificance.thedetectionofinducibleclindamycinresistanceshouldbepaidatentioninlaboratoriesin ordertoguidephysicianstoselectantimicrobialagentscorectly. Keywords:Inducibleclindamycinresistance;Staphylococus;MicroScanGram positivecompositeplate;dtest; Erythromycin;Gene 葡萄球菌属中所有的菌种都有较大的潜在致病性, 已成为临床抗感染治疗的一大难题 [1 2] 1968 年有学者报道 2 例耐红霉素金黄色葡萄球菌引起的感染, 治疗前对克林霉素和林可霉素均作者简介 : 张静华, 女,1984 年生, 学士, 技师, 主要从事临床微生物检验工作通讯作者 : 孙奋勇, 联系电话 :

2 检验医学 2015 年 12 月第 30 卷第 12 期 LaboratoryMedicine,December2015,Vol.30No 敏感, 但治疗后林可霉素却变为耐药, 于是作者推测克林霉素和林可霉素治疗此类菌可能会引起治疗无效 [3] 大环内酯类( 如红霉素 ) 林可酰胺类 ( 如克林霉素 ) 链阳霉素 B 类复合药物 (macrolide lincosamide streptograminb,mls) 为治疗葡萄球菌感染的常用药物 [4], 在多数菌属中, 红霉素一直是较强的诱导剂, 具有诱导克林霉素耐药的作用因此, 如何合理使用 MLS 已经成为人们关注的焦点 [5] 为此, 实验室有必要开展试验对克林霉素诱导耐药的菌株进行检测并报告临床为评价 MicroScan 革兰阳性复合板 ( 简称 PC33 复合板 ) 检测葡萄球菌属诱导型克林霉素耐药的性能, 本研究对医院分离到的红霉素耐药而克林霉素敏感的葡萄球菌以 D 试验 ( 双纸片法检测克林霉素诱导耐药试验 ) 为判断标准, 用 PC33 复合板进行诱导型克林霉素耐药检测, 同时通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction,pcr) 进一步了解其基因分布情况材料和方法一材料 1. 菌株来源复苏同济大学附属第十人民医院 2013 年 6 月至 2014 年 6 月 PC33 复合板结果为红霉素耐药而克林霉素敏感的葡萄球菌 ( 使用 Walkaway96plus 全自动微生物鉴定和药物敏感性分析仪 ) 共 115 株, 其中金黄色葡萄球菌 31 株凝固酶阴性葡萄球菌 84 株从同一患者同一部位多次分离的相同菌株按 1 次统计菌株均来自同济大学附属第十人民医院住院和门诊患者送检的样本, 包括痰液咽拭子尿液脓液分泌物血液透析液等质控菌株 : 金黄色葡萄球菌 (ATCC 29213) 作为 PC33 复合板的质控菌株, 金黄色葡萄球菌 (ATCC25923) 作为纸片扩散法药物敏感性试验的质控菌株 2. 培养基及药物敏感性纸片水解酪蛋白胨琼脂培养基为上海伊华生物公司产品 ; 红霉素 (15μg/ 片 ) 克林霉素 (2μg/ 片 ) 为英国 Oxoid 公司产品 3. 试剂与仪器 DNA 抽提试剂盒及 PCR 试剂盒 (TaKaRa 公司 );2 种耐药基因的 PCR 引物 ( 上海宝生物公司 );9700 型基因扩增仪 ( 美国 MJRearch 公司 ); 电泳仪 ( 上海天能公司 ); 凝胶成像系统 ( 美国伯乐公司 ) 二方法 1. 菌株鉴定 115 株菌株用革兰染色凝固酶试验西门子 Walkaway96plus 全自动微生物鉴定和药物敏感性分析仪及其配套的 PC33 复合板进行鉴定 2. 体外药物敏感性分析采用 PC33 复合板联合孔进行常规鉴定药物敏感性分析,35 培养 16~18h, 观察含红霉素和克林霉素联合孔 ( 含 4μg/mL 红霉素和 0.5μg/mL 克林霉素 ) 是否有菌生长来判断结果 3.D 试验按照美国临床实验室标准化协会 (theclinicaland LaboratoryStandardsInstitute, CLSI) 标准进行操作和判读 [6] 挑选在 35 有氧环境孵育 18~24h 的单个菌落, 将 0.5 麦氏单位的新鲜菌液均匀涂布于水解酪蛋白胨琼脂平板, 在相距 15mm 处 ( 边缘到边缘 ) 分别贴上红霉素 (15μg/ 片 ) 和克林霉素 (2μg/ 片 ) 纸片 35 有氧环境孵育 18~24h 后, 按照红霉素 14~ 22mm 克林霉素 15~20mm 的标准判读 4. 相关耐药基因检测 (1)DNA 抽提 : 所有试验菌株经 DNA 抽提试剂盒抽提后用 PCR 扩增试剂盒进行模板制备 ;(2) 引物设计及 PCR 扩增 :PCR 引物参考文献 [7], 反应过程见表 1;(3) 扩增产物分析 :PCR 产物于 1% 琼脂糖凝胶中进行电泳,100V 电泳 45min 后紫外光线下观察结果, 置入凝胶成像仪中观察并记录结果在预计位置 420 和 572bp 处出现条带, 分别为 erma ermc 基因表 1 引物序列和 PCR 循环条件靶基因 GenBank 基因编号引物序列 (5 3 ) 片段 (bp) PCR 循环条件 erma K02987 F:GATCAGGAAAAGGACATTTTAC R:GTTCAAGAACAATCAATACAGAG ermc X54338 F:GCTCAGGAAAAGGGCATTTTAC R:GCTAATATTGTTTAAATCGTCAATTCC 个循环 (94 20s, 57 20s,72 45s) 个循环 (94 20s, 57 20s,72 45s)

6%(40/84) 见表 2 二 D 试验测定诱导耐药表型结果及诱导耐药的检出率当克林霉素在靠近红霉素纸片一侧出现截平现象, 即克林霉素纸片的抑菌环看似大写的 D 时 ( 称为 D 抑菌环 ) 提示存在可诱导的克林霉素耐药, 为诱导型 MLS(inducible macrolide lincosamide streptograminb,imls) 耐药, 即 D 试验阳性 ;

3 1240 三统计学方法采用 SPSS20.0 统计软件进行数据分析计数资料以百分率表示,2 种方法的结果进行配对 χ 2 检验, 显著性检验水准 α=0.05 同时以 D 试验法为判断标准评估 PC33 复合板检测克林霉素诱导耐药的敏感性及特异性结果一 PC33 复合板诱导孔结果及诱导耐药的检出率含红霉素和克林霉素联合孔内有菌生长为诱导试验阳性, 不生长为阴性 PC33 复合板耐药检出率分别为金黄色葡萄球菌 61.3%(19/31) 凝固酶阴性葡萄球菌 47.6%(40/84) 见表 2 二 D 试验测定诱导耐药表型结果及诱导耐药的检出率当克林霉素在靠近红霉素纸片一侧出现截平现象, 即克林霉素纸片的抑菌环看似大写的 D 时 ( 称为 D 抑菌环 ) 提示存在可诱导的克林霉素耐药, 为诱导型 MLS(inducible macrolide lincosamide streptograminb,imls) 耐药, 即 D 试验阳性 ; 如果红霉素和克林霉素均耐药, 则为结构型 MLS (constitutive macrolide lincosamide streptograminb,cmls) 耐药 ; 如果克林霉素抑菌环仍为圆形, 为 MS 表型, 即 D 试验阴性见图 1 D 试验耐药的检出率分别为金黄色葡萄球菌 61.3%(19/31); 凝固酶阴性葡萄球菌 51.2% (43/84) 见表 2 三 PC33 复合板与 D 试验检测克林霉素诱导耐药的结果比较经配对 χ 2 检验,2 种方法的检测结果差异无统计学意义 (P>0.5), 并以 D 试验法为判断标准评估 PC33 复合板检测克林霉素诱导耐药的敏感性为 95.1%, 特异性为 100.0%;2 种表型试验金黄色葡萄球菌符合率为 100.0%, 凝固酶阴性葡萄球菌符合率为 93.0% 见表 2 在 115 株葡萄球菌中,D 试验结果和 PC33 复合板诱导孔结果同时阳性 59 株 ;D 试验结果阳性而 PC33 复合板诱导孔结果阴性 3 株 ;D 试验结果和 PC33 复合板诱导孔结果同时阴性 53 株 ( 其中 MS 表型 29 株 cmls24 株 ) 四 erm 基因在不同菌株中的分布检测 erma ermc 基因, 发现 cmls 耐药菌株主要为 erma;imls 耐药菌株主要为 ermc, 见表 3 PCR 反应产物在琼脂糖凝胶中电泳, 见图 2 图 3 表 2 PC33 复合板及 D 试验耐药检出率 D 试验 PC33 复合板菌株株数金黄色葡萄球菌凝固酶阴性葡萄球菌注 :(a) 为 cmls 型 ;(b) 为 imls 型图 1 克林霉素诱导试验表 3 不同菌株中基因型检测结果耐药基因细菌种类和耐药表型株数 erma ermc erma/ermc 金黄色葡萄球菌 MS imls cmls 凝固酶阴性葡萄球菌 MS imls cmls 注 :1 为 DL2000Marker;2 3 为阴性样本 ;4~8 为 erma 基因阳性样本图 2 erma 基因扩增片段电泳图

4 检验医学 2015 年 12 月第 30 卷第 12 期 LaboratoryMedicine,December2015,Vol.30No 注 :1 为 DL2000Marker;2~8 为 ermc 基因阳性样本图 3 ermc 基因扩增片段电泳图讨临床上葡萄球菌引起的医院感染有所上升, 而大环内酯类林可酰胺类等抗菌药物由于其组织渗透性强口服效果好且对肾脏无不良反应等特点被应用于治疗该类细菌引起的感染 [8] 在患者中发现, 克林霉素耐药情况是高度易变的, 如果经常使用, 可造成 imls 的漏检, 导致临床治疗失败,iMLS 的耐药表型是红霉素耐药而克林霉素敏感, 必须用 D 试验才能检测出来 [9] 应用红霉素和克林霉素纸片进行的 D 试验首先由 [10] SWENSON 等倡导, 该方法用于葡萄球菌属克林霉素诱导耐药的检测, 操作简便, 结果可靠但红霉素和克林霉素的纸片间距对试验结果有较大影响 [11],2 张纸片间距过大可导致假阴性 [12] 由于 D 试验是用纸片扩散法进行检测, 不适合临床大量样本作为常规药物敏感性试验而 PC33 复合板克林霉素诱导孔使诱导型耐药检测实现自动化, 简单易行, 准确度高, 本研究对其检测性能进行了评估 115 株试验菌株中,D 试验阳性 62 株,D 试验耐药检出率分别为金黄色葡萄球菌 61.3% 凝固酶阴性葡萄球菌 51.2% PC33 复合板检测阳性 59 株,PC33 复合板耐药检出率分别为金黄色葡萄球菌 61.3% 凝固酶阴性葡萄球菌 47.6% 本研究结果表明, 以 D 试验为判断标准计算 PC33 复合板检测克林霉素诱导耐药的敏感性为 95.1%, 特异性为 100.0%;2 种表型试验金黄色葡萄球菌符合率为 100.0%, 凝固酶阴性葡萄球菌符合率为 93.0% 2 种方法有很好的一 [13] 致性, 这与傅石明的结果基本一致在纸片法红霉素与克林霉素同时耐药的 24 例中,PC33 复合板诱导孔未生长但红霉素孔耐药克林霉素孔论敏感, 是否与 PC33 复合板对克林霉素的检测能力不稳定, 或与操作人员处理菌液浓度是否均匀有关, 有待进一步研究葡萄球菌对大环内酯类耐药通常有 2 种机制 : 一是由 msra 基因 ( 仅影响大环内酯类和链阳菌素 B) 或由 mefa mefe 基因 ( 仅影响大环内酯类, 不影响克林霉素和链阳菌素 B) 介导的主动流出的泵机制, 编码产生外排蛋白导致对大环内酯类和链阳霉素 B 的耐药, 但对克林霉素敏感, 这种耐药表型称为 MS 表型, 即红霉素耐药而克林霉素敏感, 这种能量依赖泵能在药物与核糖体靶位结合前有效地从菌细胞内排出大环内酯类药物二是核糖体靶位改变, 由各种 erm 基因编码的核糖体甲基化酶所介导, 核糖体上单个位点发生变化,23SrRNA 上腺嘌呤残基 N6 二甲基化, 导致核糖体构象发生变化, 表现为对大多数 MLS 抗菌药物耐药这种耐药体外可有 2 种表型, 即 cmls 和 imls 若 erm 基因稳定表达, 则表现对红霉素克林霉素和其他 MLS 群成员耐药, 称为 MLS 固有表型, 即红霉素耐药且克林霉素耐药, 常规的体外药物敏感性试验均能测出然而在某些情况下, 基因需药物诱导剂诱导才能表达对克林霉素耐药, 否则体外可能会表现为对克林霉素敏感, 红霉素可作为这种诱导剂, 这些分离菌在体外表现对红霉素耐药而对克林霉素敏感, 称为 MLS 诱导表型, 即红霉素耐药而克林霉素敏感 ( 诱导耐药 ) 目前, 在葡萄球菌中发现了 3 种 erm 基因, 即 erma ermb 和 ermc,erma 和 ermc 比较常见,ermA+ermC 是 MLS 葡萄球菌较为常见的复合基因型, 而 ermb 较少见, 主要从动物分离菌株中检测到本试验对 erma ermc 进行了研究在 115 例试验菌株中,29 株 MS 表型的菌株未检出任何基因型 12 株 imls 耐药的金黄色葡萄球菌菌株中,8 株基因型为 erma,4 株基因型为 ermc, 未检出同时带有 2 种基因的菌株 ;50 株 imls 耐药的凝固酶阴性葡萄球菌菌株中,11 株基因型为 erma,38 株基因型为 ermc,1 株检出同时带有 2 种基因的菌株 11 株 cmls 耐药的金黄色葡萄球菌中,8 株基因型为 erma,1 株基因型为 ermc,1 株检出同时带有 2 种基因的菌株,1 株未检出任何基因型 ;10 株 cmls 耐药的凝固酶阴性

5 1242 葡萄球菌菌株中,5 株基因型为 erma,1 株基因型为 ermc,2 株检出同时带有 2 种基因的菌株,2 株未检出任何基因型由此可见,PC33 复合板对克林霉素诱导型耐药有较小的漏检率本研究中, cmls 耐药菌株的主要耐药基因为 erma,imls 耐 [14] 药菌株的主要耐药基因为 ermc, 这同乔昀等的报道基本一致试验中 3 株菌株 ( 其中 1 株为金黄色葡萄球菌,2 株为凝固酶阴性葡萄球菌 ) 未发现以上 2 种基因的任何 1 种, 其表型为红霉素和克林霉素均耐药, 耐药机制是否与携带其他基因如 ermb msra( 编码大环内酯类和链阳菌素共同耐药基因 ) 和 msrb 基因等有关, 有待进一步研究 imls 型耐药在临床上比较多见, 主要耐药基因为 ermc,pcr 可进行分子流行病学调查目前临床微生物实验室使用 PC33 复合板进行克林霉素诱导耐药的检出率较高, 能较好地指导临床合理使用克林霉素治疗参考文献 [1] MARTINEAU F,PICARD FJ,LANSAC N,etal. Corelation between the resistance genotype determined by multiplex PCR asays and the antibiotic susceptibility paterns ofstaphylococus aureus and Staphylococus epidermidis [J]. AntimicrobAgentsChemother,2000,44(2): [2] 王凤玲, 侯振江, 张金艳, 等. 金黄色葡萄球菌耐药基因及致病毒素基因的相关性研究 [J]. 国际检验医学杂志,2011,32(16): [3] LEWIS JS 2nd, JORGENSEN JH. Inducible clindamycin resistance in Staphylococi: should cliniciansandmicrobiologistsbeconcerned[j].clin InfectDis,2005,40(2): [4] 沈定霞, 罗燕萍, 徐雅萍, 等. 葡萄球菌对红霉素和克林霉素的诱导耐药性研究 [J]. 中华检验医学杂志,2005,28(4): [5] SHAMMAS AG,MOMANI MD. Misoprostol for terminationofsecondtrimesterpregnancyinascared uterus[j].saudimedj,2006,27(8): [6] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performancestandardsforantimicrobialsusceptibility testing[s].m100 S20,CLSI,2010. [7] 乔昀, 陈君灏, 罗云桃, 等.146 例金黄色葡萄球菌中红霉素对克林霉素诱导耐药分析 [J]. 检验医学,2012,27(2): [8] 朱以军, 应华永, 卜黎红, 等. 微量肉汤稀释法检测葡萄球菌属诱导型克林霉素耐药的评价 [J]. 中华医院感染学杂志,2010,20(17): [9] 孙建文, 万新亮, 任孔华, 等. 金黄色葡萄球菌对红霉素和和克林霉素诱导耐药分析 [J]. 检验医学,2010,25(9): [10] SWENSONJM,BRASSOWB,FERRAROMJ,etal. Detection ofinducible clindamycin resistance in Staphylococi by broth microdilution using erythromycin clindamycincombinationwels[j].j ClinMicrobiol,2007,45(12): [11] PEREZLR,CAIERAO OJ,ANTUNESAL,etal. Use ofthe D testmethod to detect inducible clindamycin resistance in coagulase negative Staphylococi(CoNS)[J].BrazJInfectDis,2007, 11(2): [12] FERNANDESCJ,O SULLIVAN MV,CAIY,etal. Agardilution method for detection ofinducible clindamycinresistanceinstaphylococusspp[j].j ClinMicrobiol,2007,45(12): [13] 傅石明.MicroScan 革兰阳性复合板检测葡萄球菌属诱导型克林霉素耐药的应用 [J]. 中华医院感染学杂志,2012,22(6): [14] 乔昀, 陈君灏, 罗云桃, 等.146 例金黄色葡萄球菌中红霉素对克林霉素诱导耐药分析 [J]. 检验医学,2012,27(2): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 姜敏 )

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