218 中华预防医学杂志 2011 年 3 月第 45 卷第 3 期 ChinJPrevMed,March2011,Vol 45,No 3 DHA,orCIT positiveampc β lactamase producingstrains Antibioticresistantrateswere
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1 中华预防医学杂志 2011 年 3 月第 45 卷第 3 期 ChinJPrevMed,March2011,Vol 45,No 论著 维吾尔族与汉族新生儿感染产超广谱 β 内酰胺酶与头孢菌素酶病原菌的耐药性及基因型分析 张文利刘军张坚苏广龙 摘要 目的了解乌鲁木齐地区维吾尔族与汉族新生儿中肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产超广谱 β 内酰胺酶 (ESBLs) 与头孢菌素酶 (AmpC 酶 ) 的耐药性及基因型分布 方法采用纸片扩散 (K B) 法测定 299 株病原菌对 22 种抗菌药的耐药率 ; 利用多重 PCR 技术检测产 ESBLs 或 AmpC 酶菌株耐药基因, 并用 DNA 序列分析确认基因亚型 ; 采用数字表法随机抽取产 ESBLs 的 TEM SHV CTX M 1 CTX M 9 组阳性菌株及产 AmpC 酶的 DHA CIT 阳性菌株共 148 株进行测序 耐药率采用世界耐药监测网 Whonet5 4 软件进行统计, 数据对比应用医学 PEMS3 1 统计软件采用卡方检验进行统计学处理,P<0 05 认为差异有统计学意义 结果在耐药率方面, 维吾尔族与汉族新生儿中产 ESBLs 肺炎克雷伯菌对复方新诺明 [80 0%(40/50) 和 56 0%(28/50),χ 2 =6 6176,P=0 0101] 产 ESBLs 大肠埃希菌对头孢哌酮 + 舒巴坦 [54 2% (32/59) 和 94 0% (47/50),χ 2 = ,P= ] 产 AmpC 酶肺炎克雷伯菌对头孢哌酮 + 舒巴坦 [100 0%(20/20) 和 72 2%(26/36),χ 2 = ,P=0 0093] 和对阿米卡星 [65 0%(13/20) 和 25 0%(9/36),χ 2 =8 6246,P=0 0033] 耐药率差异有统计学意义 基因测序结果显示,ESBLs 基因型除 SHV 在大肠埃希菌中维吾尔族新生儿只检出 3 4%(2/59) 而汉族新生儿未检出外, 其他 TEM CTX M 1 CTX M 9 组基因检出率均在 38 0% (19/50) 以上 ; 其中 TEM CTX M 1 组基因分别为单一的 TEM 1 型和 CTX M 15 型,SHV CTX M 9 组阳性基因分别检出 SHV 和 CTX M 等不同型别基因 肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中检出 2 种或 2 种以上 ESBLs 基因型的菌株占 56 7%(42/74)~90 0%(63/70) 携带 AmpC 酶基因的 2 种菌在 2 个民族新生儿中基因型都只集中在 DHA 1 和 CMY 44 型, 其他型未检出 2 个民族新生儿间只有产 TEM 型的 ESBLs 大肠埃希菌检出率为维吾尔族新生儿高于汉族新生儿 [71 2%(42/59) 和 50 0%(25/50),χ 2 =5 1291,P=0 0235], 其余各种耐药基因型检出率差异无统计学意义 (χ 2 <3 7780,P>0 05) 结论 2 个民族新生儿间部分菌株耐药率和耐药基因型分布差异有明显统计学意义, 而且肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌携带多种耐药基因并对 β 内酰胺类抗生素呈高耐药性 关键词 婴儿, 新生 ; 酰胺基水解酶类 ; 基因型 ; 抗药性, 细菌 ; 对比研究 Analysisofantibioticresistanceandgenotypesonextendedspectrum β lactamaseandampc β lactamaseproducingstrainsisolatedfrom UygurandHannewborns ZHANGWen li,liujun, ZHANGJian,SUGuang long DepartmentofClinicalLaboratory,TheChildren shospital,urumqi,urumqi ,China Abstract Objective Thisstudyaimedtoinvestigatedrugresistanceandgenotypesofthe extendedspectrumβ lactamase(esbls)andampcβ lactamase producingescherichiacoliandklebsiela pneumoniaeisolatedfromuygurandhannewbornsinurumqi Methods Diskdifusiontest(Kirby Bauer) wasusedfordetectingdrugresistanceof299strainstotwentytwokindsofantibiotics Resistancegenesofthe ESBLsandAmpC β lactamase producingstrainswereamplifiedbymultiplexpcr andsubtypeswere confirmedbydna sequenceanalysis Total148 strainswereselectedwithrandom numbertableand sequenced,whichincludedtem,shv,ctx M 1,orCTX M 9 positiveesbls producingstrainsand DOI: /cma j isn 基金项目 : 乌鲁木齐市卫生局科研基金资助项目 (200812) 作者单位 : 乌鲁木齐儿童医院检验科 ( 张文利 刘军 ); 乌鲁木齐市妇幼保健医院检验科 ( 张坚 苏广龙 )
2 218 中华预防医学杂志 2011 年 3 月第 45 卷第 3 期 ChinJPrevMed,March2011,Vol 45,No 3 DHA,orCIT positiveampc β lactamase producingstrains Antibioticresistantrateswereanalyzedby Whonet5 4andstatisticanalysiswasperformedbychi square(χ 2 )testwithpems3 1 Results The antibioticresistantratesbetweenuygurandhannewbornssignificantlydiferinesbls producingklebsiela pneumoniaetosulfamethoxazolum Trimethoprimum(80 0% (40/50)and56 0% (28/50),χ 2 =6 6176, P=0 0101),inESBLs producingescherichiacolitosulbactam andcefopcrazone(54 2% (32/59)and 94 0% (47/50),χ 2 = ,P=0 0000),andinAmpCβ lactamase producingklebsielapneumoniae tosulbactamandcefopcrazone(100 0% (20/20)and72 2% (26/36),χ 2 =6 7633,P=0 0093)andto Amikacin(65 0% (13/20) and25 0% (9/36),χ 2 =8 6246,P=0 0033) AlthoughSHV geneof ESBLs producingescherichiacoliwasdetectedfrom Uygurnewbornsatonly3 4% (2/59) andnot detectablefromhannewborns,tem,ctx M 1,andCTX M 9groupgeneswerealdetectedover38 0% (19/50) Amongthedetectedstrains,thesubtypesofTEM andctx M 1weremainlyTEM 1andCTX M 15,respectively;whereasthesubtypesofSHVandCTX M 9includedSHV 1,2,11,12,27,61,99andCTX M 9,14,24,27,65,respectively ThestrainsofEscherichiacoliandKlebsielapneumoniaecaryingtwoor morekindsofesblsgenotypeswere56 7% (42/74)-90 0% (63/70) TwospeciescaryingtheAmpC geneintwokindsofnewbornswereonlygroupedinthesubtypesofdha 1andCMY 44,andothersubtypes werenotdetectedatal Moreover,TEM positiveesbls producingescherichiacoliweredetectedfromuygur newbornsatthehigherratethanthatfrom Hannewborns(71 2% (42/59)and50 0% (25/50),χ 2 = ,P=0 0235),whiletherewasnodiferenceinothergenotypesdetectedbetweentwokindsof newborns(χ 2 <3 7780,P>0 05).Conclusion Thereweresignificantdiferencesinantibioticresistance andgenotypedistributionofklebsielapneumoniaeandescherichiacolibetweentwonationalitynewborns,and thesetwobacteriadetectedinthisstudycariedmulti resistancegenesandshowedhighresistanttoβ lactamaseantibiotics Keywords Infant,newborn; Amidohydrolases; Genotype; Drugresistance,bacterial; Comparativestudy 近年来肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌已成为儿童 临床感染和医院感染的重要病原菌 随着 β 内酰 胺类抗生素, 尤其是第 3 4 代头孢菌素在临床的广 泛应用, 产超广谱 β 内酰胺酶 (ESBLs) 与头孢菌素 酶 (AmpC 酶 ) 的肺炎克雷伯菌株与大肠埃希菌日益 增多, 由于它们的多重耐药性, 以及经质粒介导容易 在同种属或不同种属细菌间传递造成暴发流行的特 点, 使得临床抗感染治疗和医院感染控制困难重重 因各个地区 人群 时间 抗生素使用情况等不同, 不 同地域 人群的病原菌耐药性和携带耐药基因情况 也有较大差别 为了探讨新疆地区不同民族新生儿 人群中肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌产 2 种酶的耐药 基因分布情况, 本研究收集了乌鲁木齐儿童医院和 乌鲁木齐市妇幼保健医院 2006 年 1 月至 2009 年 1 月在新生儿标本中分离到的产 ESBLs 与 AmpC 酶 的肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌进行研究, 现报告 如下 材料与方法 1 菌株来源 :(1) 实验菌株 : 随机 ( 数字表法 ) 收集乌鲁木齐儿童医院和乌鲁木齐妇幼保健医院 2006 年 1 月至 2009 年 1 月新生儿住院患儿临床标 本, 根据美国临床实验室标准化研究所 (Clinicaland [1] LaboratoryStandardsInstitute,CLSI) 制定的标准确 证为产 ESBLs 的肺炎克雷伯菌 : 汉族新生儿中有 50 株 维吾尔族新生儿中有 50 株 ; 产 ESBLs 的大肠埃 希菌 : 汉族新生儿中有 50 株 维吾尔族新生儿中有 [2 3] 59 株 ; 收集了所有产 AmpC 酶的肺炎克雷伯菌 : 汉族新生儿中有 36 株 维吾尔族新生儿中有 20 株 ; 所有产 AmpC 酶的大肠埃希菌 : 汉族新生儿中有 24 株 维吾尔族新生儿中有 10 株 (2) 质控菌 : 大肠 埃希菌 ATCC25922 肺炎克雷伯菌 ATCC700603; 产 ESBLs 的 TEM4 SHV3 SHV5 等基因型大肠埃希 菌 ; 产 AmpC 酶的阴沟肠杆菌 029M 2 试剂 : 高保真 PCR 试剂 (expandhighfidelity PCRsystem) 购于德国的 Roche 公司 ;PCR 产物纯化 试剂盒 (3SPCRproductpurificationkit) 购于上海申 能博彩生物科技有限公司 3 仪器 : 电热恒温培养箱 DNP 9162 型购于上 海精宏实验设备有限公司 ; 恒温振荡器 HZ 8811K 为太仓市科教器材公司 ;PCR 扩增仪为英国 Hybaid 公司产品 ; 水平电泳仪 紫外线透射仪为瑞典 PharmaciaBiotech 公司产品 ; 超声粉碎仪为 Sonic 公 司产品 ; 台式冷冻高速离心机为 Sorval 和 Beckman 公司产品 4 耐药基因扩增 : 采用煮沸法提取细菌模板 DNA ESBLs 的 TEM SHV CTX M 基因及 AmpC 酶 DHA CIT MOX FOX ACC EBC 基因扩增所用的引 物经 Primerdesign 软件自行设计 引物由上海生物 工程技术服务有限公司合成 反应体系 (50μl): 包
3 中华预防医学杂志 2011 年 3 月第 45 卷第 3 期 ChinJPrevMed,March2011,Vol 45,No 括 10 缓冲液,2 5mmol/L MgCl 2,0 2mmol/L dntp( 脱氧核糖核苷酸 ),0 2UTaq 酶, 正反向引物, 模板,ddH 2 O dntp 和 Taq 酶均购自上海生物工程技术服务有限公司 扩增条件 :ESBLs:95 预变性 5min,95 变性 1min,55 退火 30s,72 延伸 1min, 循环 35 次, 最后 72 延伸 10min; AmpC 酶 :94 预变性 3min,94 变性 30s,64 退火 30s,72 延伸 1min, 循环 25 次, 最后 72 延伸 7min PCR 产物检测经 1% 琼脂糖凝胶电泳 30min, 用 EB 染色剂进行 DNA 染色, 于紫外凝胶电泳成像仪下观察结果 纯水为阴性对照, 阳性对照株由浙江医科大学附属第一医院国家重点传染病研究所提供 5 耐药基因测序 : 采用数字表法随机抽取 ESBLs 的 TEM SHV CTX M 1 组 CTX M 9 组阳性基因及 AmpC 酶的 DHA CIT 阳性基因共 148 株送上海英骏生物技术有限公司和杭州泽横生物工程有限公司测序 结果在基因序列数据库 (GenBank) 上用碱基局部对准检索工具 (BasicLocalAlignment SearchTool,BLAST)[ 美国国立生物技术信息中心 (NCBI) 开发 ] 对所得基因序列进行比对分析 6 统计学处理 : 应用世界耐药监测网 WHONET 5 4 软件进行药敏统计和分析 ; 数据对比应用医学 PEMS3 1 统计软件, 采用卡方检验进行统计学处理,P<0 05 认为差异有统计学意义 结果 1 产 ESBLs 病原菌耐药结果 ( 表 1): 产 ESBLs 肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌体外抗生素敏感试验显示 :β 内酰胺类抗生素中除碳青霉烯类抗生素 100 0% 敏感 β 内酰胺抗生素加酶抑制剂 44 0% (22/50)~94 0%(47/50) 耐药外, 其余青霉素类和头孢菌素类抗生素均 100 0% 耐药 ; 阿米卡星耐药率较低, 都在 6 0%(3/50) 以下 ; 肺炎克雷伯菌对喹诺酮类耐药率较低, 在 28 0%(14/50) 以下 ; 大肠埃希菌对喹诺酮类耐药率较高,44 0% (22/50)~ 50 0%(25/50) 产 ESBLs 肺炎克雷伯菌对复方新诺明耐药率维吾尔族新生儿高于汉族新生儿 (χ 2 = ,P=0 0101), 产 ESBLs 大肠埃希菌对头孢哌酮 + 舒巴坦耐药率汉族新生儿高于维吾尔族新生儿 (χ 2 = ,P=0 0000) 2 产 AmpC 酶病原菌耐药结果 ( 表 2): 产 AmpC 酶的 2 种菌对碳青霉烯类抗生素 100 0% 敏感 肺炎克雷伯菌除汉族新生儿对 β 内酰胺抗生 素加酶抑制剂 72 2%(26/36) 94 4%(34/36) 耐药外, 对其余青霉素类和头孢菌素类抗生素均 100 0% 耐药 ; 维吾尔族新生儿则对所有青霉素类和头孢菌素类抗生素 100 0% 耐药 大肠埃希菌对青霉素类和头孢类抗生素耐药率也在 79 2% (19/24)~100 0%(24/24 10/10) 之间, 对阿米卡星耐药率较低, 在 16 7%(4/24) 以下 同样, 肺炎克雷伯菌对喹诺酮类耐药率较低, 在 35 0%(7/20) 以下, 但大肠埃希菌耐药率却较高在 79 2% (19/24)~90 0%(9/10) 之间 新生儿 2 个民族间耐药菌株对部分抗生素耐药率差异有统计学意义 (P<0 05), 即产 AmpC 酶肺炎克雷伯菌对头孢哌酮 + 舒巴坦耐药率 (χ 2 =6 7633,P=0 0093) 及对阿米卡星耐药率 (χ 2 =8 6246,P=0 0033) 均为维吾尔族新生儿高于汉族新生儿 其余维吾尔族与汉族新生儿间病原菌耐药差异均无统计学意义 3 肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌耐药基因型检出情况 ( 表 3, 图 1): 维吾尔族与汉族新生儿产 ESBLs 的肺炎克雷伯菌 TEM SHV CTX M 1 组 CTX M 9 组基因型检出率均在 40 0% (20/50) 以上 ; 产 ESBLs 的大肠埃希菌 TEM CTX M 1 组 CTX M 9 组基因型检出率也都在 38 0%(19/50) 以上, 但 SHV 在维吾尔族新生儿中只检出 3 4%(2/59), 而汉族新生儿未检出 产 AmpC 酶的肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌在 2 个民族新生儿中基因都只集中在 DHA 和 CIT 型, 其他型未检出 2 个民族新生儿间耐药基因型除大肠埃希菌产 ESBLs 的 TEM 型为维吾尔族新生儿高于汉族新生儿外 (χ 2 =5 1291,P= ), 其他基因型产生率差异无统计学意义 2 种菌中检出 2 种或 2 种以上 ESBLs 基因型的菌株在 56 7%(42/74)~90 0%(63/70) 4 耐药基因测序结果 ( 表 4): 本研究采用数字表法随机抽取 ESBLs 的 TEM SHV CTX M 1 组 CTX M 9 组阳性基因及 AmpC 酶的 DHA CIT 阳性基因共 148 株进行测序, 其中 ESBLs 的 TEM CTX M 1 组基因与 AmpC 酶的 DHA CIT 阳性基因分别为单一的 TEM 1( 广谱 β 内酰胺酶基因 ) CTX M 15 和 DHA 1 CMY 44 基因 ; 而 ESBLs 的 SHV CTX M 9 组阳性基因分别包含 SHV 1( 广谱 β 内酰胺酶基因 ) 和 CTX M 等不同型别基因 讨论 1 产 ESBLs 和 AmpC 酶肺炎克雷伯菌与大肠
4 220 中华预防医学杂志 2011 年 3 月第 45 卷第 3 期 ChinJPrevMed,March2011,Vol 45,No 3 表 1 22 种抗生素对于维吾尔族与汉族新生儿中产 ESBLs 肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌的敏感试验结果分析 抗生素 肺炎克雷伯菌维吾尔族汉族 χ 2 值 P 值 阿莫西林 100.0(50/50) 100.0(50/50) 阿莫西林 + 克拉维酸 86.0(43/50) 86.0(43/50) 氨苄西林 100.0(50/50) 100.0(50/50) 哌拉西林 100.0(50/50) 100.0(50/50) 头孢唑啉 100.0(50/50) 100.0(50/50) 头孢呋辛钠 100.0(50/50) 100.0(50/50) 头孢噻肟 100.0(50/50) 100.0(50/50) 头孢曲松 100.0(50/50) 100.0(50/50) 头孢他啶 100.0(50/50) 100.0(50/50) 头孢哌酮 100.0(50/50) 100.0(50/50) 头孢哌酮 + 舒巴坦 58.0(29/50) 44.0(22/50) 头孢吡肟 100.0(50/50) 100.0(50/50) 氨曲南 100.0(50/50) 100.0(50/50) 头孢西丁 4.0(2/50) 4.0(2/50) 亚胺培南 0.0(0/50) 0.0(0/50) - - 美洛培南 0.0(0/50) 0.0(0/50) - - 阿米卡星 6.0(3/50) 2.0(1/50) 庆大霉素 70.0(35/50) 54.0(27/50) 环丙沙星 28.0(14/50) 14.0(7/50) 左旋氧氟沙星 14.0(7/50) 6.0(3/50) 复方新诺明 80.0(40/50) 56.0(28/50) 四环素 66.0(33/50) 68.0(34/50) 抗生素 大肠埃希菌维吾尔族汉族 χ 2 值 P 值 阿莫西林 100.0(59/59) 100.0(50/50) 阿莫西林 + 克拉维酸 81.4(48/59) 92.0(46/50) 氨苄西林 100.0(59/59) 100.0(50/50) 哌拉西林 100.0(59/59) 100.0(50/50) 头孢唑啉 100.0(59/59) 100.0(50/50) 头孢呋辛钠 100.0(59/59) 100.0(50/50) 头孢噻肟 100.0(59/59) 100.0(50/50) 头孢曲松 100.0(59/59) 100.0(50/50) 头孢他啶 100.0(59/59) 100.0(50/50) 头孢哌酮 100.0(59/59) 100.0(50/50) 头孢哌酮 + 舒巴坦 54.2(32/59) 94.0(47/50) 头孢吡肟 100.0(59/59) 100.0(50/50) 氨曲南 100.0(59/59) 100.0(50/50) 头孢西丁 3.4(2/59) 0.0(0/50) 亚胺培南 0.0(0/59) 0.0(0/50) - - 美洛培南 0.0(0/59) 0.0(0/50) - - 阿米卡星 5.1(3/59) 2.0(1/50) 庆大霉素 54.2(32/59) 52.0(26/50) 环丙沙星 47.5(28/59) 50.0(25/50) 左旋氧氟沙星 45.8(27/59) 44.0(22/50) 复方新诺明 69.5(41/59) 64.0(32/50) 四环素 84.7(50/59) 96.0(48/50) 注 : 表中括号外数据为耐药率 (%); 括号内数据分子为耐药株数, 分母为所有检测株数 埃希菌对抗菌药物的耐药程度 : 肺炎克雷伯菌 大肠埃希菌是儿童临床感染最常见的病原体, 随着广谱抗生素尤其是 β 内酰胺类抗生素的大量使用, 产 ESBLs 和 AmpC 酶肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌耐药性在儿童人群中日益严重 由于产 ESBLs 和 AmpC 酶的细菌耐药速度快 传播范围广 耐药程度高 耐药谱宽 耐药机制复杂, 常常是新生儿病房 重症监护病房等各科病房暴发流行的主要菌株 本研究中, 来源于乌鲁木齐地区新生儿人群中的 2 种产酶菌体外药敏试验显示 : 青霉素类和头孢类抗生素除
5 中华预防医学杂志 2011 年 3 月第 45 卷第 3 期 ChinJPrevMed,March2011,Vol 45,No 表 2 22 种抗生素对于维吾尔族与汉族新生儿中产 AmpC 酶肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌的敏感试验结果分析 抗生素 肺炎克雷伯菌维吾尔族汉族 χ 2 值 P 值 阿莫西林 100.0(20/20) 100.0(36/36) 阿莫西林 + 克拉维酸 100.0(20/20) 94.4(34/36) 氨苄西林 100.0(20/20) 100.0(36/36) 哌拉西林 100.0(20/20) 100.0(36/36) 头孢唑啉 100.0(20/20) 100.0(36/36) 头孢呋辛钠 100.0(20/20) 100.0(36/36) 头孢噻肟 100.0(20/20) 100.0(36/36) 头孢曲松 100.0(20/20) 100.0(36/36) 头孢他啶 100.0(20/20) 100.0(36/36) 头孢哌酮 100.0(20/20) 100.0(36/36) 头孢哌酮 + 舒巴坦 100.0(20/20) 72.2(26/36) 头孢吡肟 100.0(20/20) 100.0(36/36) 氨曲南 100.0(20/20) 100.0(36/36) 头孢西丁 100.0(20/20) 100.0(36/36) 亚胺培南 0.0(0/20) 0.0(0/36) - - 美洛培南 0.0(0/20) 0.0(0/36) - - 阿米卡星 65.0(13/20) 25.0(9/36) 庆大霉素 65.0(13/20) 69.4(25/36) 环丙沙星 35.0(7/20) 19.4(7/36) 左旋氧氟沙星 0.0(0/20) 5.6(2/36) 复方新诺明 100.0(20/20) 77.8(28/36) 四环素 65.0(13/20) 91.7(33/36) 抗生素 大肠埃希菌维吾尔族汉族 χ 2 值 P 值 阿莫西林 100.0(10/10) 100.0(24/24) 阿莫西林 + 克拉维酸 100.0(10/10) 91.7(22/24) 氨苄西林 100.0(10/10) 100.0(24/24) 哌拉西林 100.0(10/10) 100.0(24/24) 头孢唑啉 100.0(10/10) 91.7(22/24) 头孢呋辛钠 100.0(10/10) 95.8(23/24) 头孢噻肟 90.0(9/10) 91.7(22/24) 头孢曲松 90.0(9/10) 100.0(24/24) 头孢他啶 90.0(9/10) 91.7(22/24) 头孢哌酮 100.0(10/10) 91.7(22/24) 头孢哌酮 + 舒巴坦 90.0(9/10) 79.2(19/24) 头孢吡肟 90.0(9/10) 91.7(22/24) 氨曲南 90.0(9/10) 91.7(22/24) 头孢西丁 100.0(10/10) 100.0(24/24) 亚胺培南 0.0(0/10) 0.0(0/24) - - 美洛培南 0.0(0/10) 0.0(0/24) - - 阿米卡星 10.0(1/10) 16.7(4/24) 庆大霉素 60.0(6/10) 75.0(18/24) 环丙沙星 90.0(9/10) 83.3(20/24) 左旋氧氟沙星 90.0(9/10) 79.2(19/24) 复方新诺明 90.0(9/10) 83.3(20/24) 四环素 90.0(9/10) 100.0(24/24) 注 : 表中括号外数据为耐药率 (%); 括号内数据分子为耐药株数, 分母为所有检测株数 β 内酰胺抗生素加酶抑制剂外, 其他抗生素耐药率最低为 90 0%, 最高达 100 0%, 且大部分都为 100 0% 根据 CLSI 推荐的标准确证为产 ESBL 的菌株临床应报告对所有青霉素类和头孢类抗生素 ( 除加酶抑制剂 ) 耐药, 因此对于产 ESBLs 株, 临床 治疗只是采用药敏试验敏感的带有 β 内酰胺酶抑制剂的抗生素 碳青霉烯类和其他可用抗生素, 而对产 AmpC 酶株, 临床治疗可采用敏感的第 4 代头孢, 如头孢吡肟, 以及碳青霉烯类和其他可用抗生素 所有产 ESBLs 和 AmpC 酶的菌株对碳青霉烯类抗生
6 222 中华预防医学杂志 2011 年 3 月第 45 卷第 3 期 ChinJPrevMed,March2011,Vol 45,No 3 表 3 肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌耐药表型 基因型在维吾尔族 汉族新生儿中的检出率对比 菌株 耐药表型 基因型 维吾尔族 汉族 χ 2 值 P 值 肺炎克雷伯菌 ESBLs TEM 66.0(33/50) 70.0(39/50) SHV 78.0(39/50) 82.0(41/50) CTX M 1 组 58.0(29/50) 58.0(29/50) CTX M 9 组 40.0(20/50) 46.0(23/50) AmpC FOX 0.0(0/20) 0.0(0/36) - - MOX 0.0(0/20) 0.0(0/36) - - ACC 0.0(0/20) 0.0(0/36) - - CIT 0.0(0/20) 8.3(3/36) DHA 10.0(2/20) 30.6(11/36) EBC 0.0(0/20) 0.0(0/36) - - 大肠埃希菌 ESBLs TEM 71.2(42/59) 50.0(25/50) SHV 3.4(2/59) 0.0(0/50) CTX M 1 组 47.5(28/59) 38.0(19/50) CTX M 9 组 72.9(43/59) 68.0(34/50) AmpC FOX 0.0(0/10) 0.0(0/24) - - MOX 0.0(0/10) 0.0(0/24) - - ACC 0.0(0/10) 0.0(0/24) - - CIT 20.0(2/10) 12.5(3/24) DHA 20.0(2/10) 12.5(3/24) EBC 0.0(0/10) 0.0(0/24) - - 注 : 表中括号外数据是检出率 (%); 括号内数据分子代表检出相应基因型阳性的株数, 分母代表耐药菌株的总株数 电泳泳道第 1 排与第 2 排 分别对应的泳道 M 为 DNA 分子量 100~2000bp Marker; 第 1 排 泳道分别为产 ESBLs 肺炎克雷伯菌 149 号临床测定株检出 CTX M 9 SHV 和 TEM 基因型 ; 第 2 排 1 5 泳道分别为产 AmpC 酶肺炎克雷伯菌 号临床测定株检出 DHA CMY 基因型 ( 第 9 泳道 24 号临床菌株检出 CARB 基因属于碳青霉烯酶, 本研究暂不讨论 ); 第 1 排与第 2 排 泳道对应的 + 分别为 CTX M 9 SHV TEM DHA CMY CARB 等 6 种基因阳性对照 ; 第 1 排与第 2 排 泳道对应的 - 分别为蒸馏水阴性对照图 1 ESBLs 和 AmpC 酶基因型 PCR 扩增产物电泳结果 素 100 0% 敏感, 对阿米卡星耐药率也较低 肺炎克雷伯菌对喹诺酮类耐药率较低, 在 35 0% 以下, 但大肠埃希菌耐药率却较高, 在 44 0% ~90 0% 之间 因新生儿人群肝 肾发育均未成熟, 用药范围只 局限在 β 内酰胺类和大环内酯类等少数几种抗生素, 因此如再出现不规范用药, 则极易产生耐药性, 导致临床高死亡率及高比率持续性定殖 ( 即定殖在机体某些部位暂时不发病, 一旦机体抵抗力下降时即引起感染, 就像 定时炸弹 一样 ) 而此次研究显示, 新生儿感染的病原菌对临床应用非常广泛的 β 内酰胺类抗生素有着很高的耐药率, 而对临床不常用的氨基糖甙类和喹诺酮类抗生素还存在较高的敏感度 碳青霉烯类抗生素仍然是临床治疗产 ESBLs 和 AmpC 酶的肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌最重要的抗生素 新生儿 2 个民族间部分菌株耐药率差异存在明显统计学意义, 说明不同民族新生儿人群中感染的不同种类菌株间耐药率存在差异 2 ESBLs 主要检出基因型 : 由于不同国家 地区和人群 ESBLs 的流行株各有差异, 其携带的耐药基 因型也各不相同,ESBLs 基因型目前世界流行的有 TEM 型 SHV 型 CTX M 型 OXA 型和其他类型 (PER,SFO,GES,TLA 1,VEB,BES,CME 等等 ) 共
7 中华预防医学杂志 2011 年 3 月第 45 卷第 3 期 ChinJPrevMed,March2011,Vol 45,No 表型基因型基因亚型 广谱 β 内酰胺酶基因 表 4 ESBLs 与 AmpC 酶基因亚型在维吾尔族与汉族新生儿中的分布 维吾尔族汉族 ( 肺炎克 ( 肺炎克雷雷伯菌,58 株 ) 伯菌,36 株 ) χ 2 值 P 值 维吾尔族汉族 ( 大肠埃 ( 大肠埃希菌,22 株 ) 希菌,32 株 ) χ 2 值 P 值 TEM TEM SHV SHV ESBLs SHV SHV SHV SHV SHV SHV SHV CTX M 1 组 CTX M CTX M 9 组 CTX M CTX M CTX M CTX M CTX M AmpC 酶 DHA DHA CIT 注 : 表中除了统计学数据外, 其余数据为基因阳性株数 CMY 型 [4], 但主要为 TEM SHV 和 CTX M 型 TEM 与 SHV 基因型均为 β 内酰胺酶, 可由质粒介导, 广谱 β 内酰胺酶基因 TEM 1 TEM 2 和 SHV 1 的酶活性区经过 1~4 个关键氨基酸突变可以衍生出其他超广谱酶, 是新型广谱抗生素选择性压力的结果 CTX M 型 ESBLs 是一类菌谱及地域分布极为广泛的酶, 对临床抗感染治疗的威胁性与日俱增, 已出现在社区感染中 [5 6], 属于 Ambler 分类中的 A 类酶, Bush 分类中的 2be 类酶 在我国 CTX M 3 型 (CTX M 1 组 ) 和 CTX M 14 型 (CTX M 9 组 )ESBLs 较为流行 [7] 本研究中, 产 ESBLs 的肺炎克雷伯菌 TEM SHV CTX M 1 组 CTX M 9 组基因型在维吾尔族与汉族新生儿中检出率都在 40 0% 以上, 产 ESBLs 的大肠埃希菌 TEM CTX M 1 组 CTX M 9 组基因型检出率也都在 38 0% 以上, 但 SHV 型基因在维吾尔族新生儿中只检出 3 4%, 而汉族新生儿中未检出 且 2 种菌中同时检出 2 种或 2 种以上 ESBLs 基因型的菌株占 56 7% ~90 0%,2 个民族新生儿中各基因型分布除大肠埃希菌产 ESBLs 的 TEM 型为维吾尔族新生儿高于汉族新生儿外, 其他基因型产生率无统计学意义 研究表明除大肠埃希 菌中 SHV 型基因携带率很少外,TEM 型 SHV 型以及 CTX M 型基因在我区新生儿感染产酶菌的患者中均大量存在 除此之外, 同时携带多种耐药基因, 甚至多达 3 种 4 种的菌株也多达 12 0% 以上, 这种严重的耐药性出现在抵抗力极为薄弱的新生儿人群中, 值得引起临床医师和院内感染控制人员的高度重视 通过对数字表法随机抽取的 TEM SHV CTX M 1 组 CTX M 9 组阳性基因测序发现,TEM 型基因全部是普通的广谱 β 内酰胺酶基因 TEM 1 型,CTX M 1 组基因也全部是单一的 CTX M 15 型, 这 2 种基因型目前在美国 加拿大 法国等世界各地广为流行 [8 9], 旅游 交通的便利和不规范用药加剧了耐药基因的广泛传播, 甚至在本地区新生儿人群中也存在一定程度的流行 而 SHV CTX M 9 组阳性基因则分别包含广谱 β 内酰胺酶基因 SHV 1 ESBLs 的 SHV 和 CTX M 等不同型别基因, 为耐药基因横向传播 抗生素选择性压力等导致地域和人群分布不同的结果 本研究中还有数株表型产 ESBLs, 但却未检测出此次研究的 3 类基因型, 因其他分布于世界各地的 ESBLs 基因型还有 PER VEB OXA TLA GES
8 224 中华预防医学杂志 2011 年 3 月第 45 卷第 3 期 ChinJPrevMed,March2011,Vol 45,No 3 SFO BES [6] 等都未列在本次检测中, 因此是否是这些型别还有待于进一步研究 3 AmpC 酶主要检出基因型 : 大多数质粒介导的 AmpC 酶来源于染色体 AmpC 酶, 根据氨基酸序列同源性可将其基因分为 5 个组 :LAT 族 FOX 族 Entb 族 Morg 族和 Hal 族, 包括 LAT CMY BIL FOX MOX MIR ACT DHA ACC EBC 等基因 [10] 由于这些耐药基因在质粒与染色体间及质粒间转移是通过质粒 转座子 整合子等多种形式实现的, 因此具有很强的耐药性, 给临床治疗带来了很大的困难 质粒介导的 AmpC 酶流行和 ESBLs 的流行相似, 都有地域分布和横向传播的特点, 并已在世界范围内流行 [10] 本组调查显示, 产 AmpC 酶的肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌在 2 个民族新生儿中基因都只集中在 DHA 和 CIT 型, 测序结果为均一的 DHA 1 和 CMY 44 型基因, 其他型未检出 2 个民族新生儿间 AmpC 酶耐药基因型分布也无明显区别 DHA 1 和 CMY 44 型基因虽在其他国家有报道 [11], 但以 DHA 1 型在我国流行最为广泛, 国内许多地区都有过报道 [12], 我区新生儿人群中 AmpC 酶耐药基因型也与国内流行型别相同 本研究数据中有超过半数虽表型检测出产 AmpC 酶, 但基因型未检出 6 种基因型中的任何一型 ; 因本组检测未能覆盖所有的 AmpC 酶基因型, 有可能会导致耐药基因的漏检 因此, 本研究对此类耐药菌株还需进一步进行研究 产生 AmpC 酶的细菌对青霉素类 头孢菌素类 ( 第 4 代头孢部分可有效 ) 头霉素类 单环内酰胺类 酶抑制剂类等 β 内酰胺类抗生素都耐药, 且这些菌株往往同时携带氨基糖甙类 氯霉素 四环素等药物的耐药基因而造成多重耐药 对于这些耐药菌株, 碳青霉烯类抗生素是最有效的药物 4 总结 : 产 ESBLs 与 AmpC 酶菌的耐药质粒可以通过接合 转化和转导等形式使耐药基因在细菌中扩散,TEM SHV CTX M 型 ESBLs 和 DHA 1 CMY 44 型 AmpC 酶均是本地区新生儿肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌对 β 内酰胺类抗生素耐药的主要机制, 为了控制 ESBLs 与 AmpC 酶的产生和传播, 及时发现新的耐药基因, 对临床产生的耐药株及其检 测应给予足够的重视, 为更有效地指导临床抗生素 的合理应用和控制由其引起的医院感染将起到积极 的推动作用 志谢 此研究中基因检测部分有赖于浙江医科大学第一附属医院传 染科俞云松主任及其他老师的全力帮助 参考文献 [1] WiklerMA,BushK,CockerilFR,etal Nationalcommiteefor clinical laboratory standards//performance standards for antimicrobial susceptibility testing M100 S18,Clinical and Laboratory Standards Institute Philadelphia: Clinical and LaboratoryStandardsInstitute,2008:34 38 [2] YagiT,WachinoJ,KurokawaH,etal Practicalmethodsusing boronic acid compounds foridentification ofclas C beta lactamase producingklebsielapneumoniaeandescherichiacoli J ClinMicrobiol,2005,43: [3] 张文利, 沈定霞, 李星萍, 等 产酸克雷伯菌 ESBL 与 AmpC 酶耐药基因型研究 中华检验医学杂志,2007,30: [4] KoCS,SungJY,KooSH,etal Prevalenceofextended spectrum beta lactamasesinescherichiacoliandklebsielapneumoniae fromdaejeon KoreanJLabMed,2007,27: [5] Walther RasmusenJ,H ibyn Cefotaximases(CTX M ases),an expandingfamily ofextended spectrum beta lactamases Can J Microbiol,2004,50: [6] JonesCH,Tuckman M,KeeneyD,etal Characterization and sequence analysis of extended spectrum {beta} lactamase encodinggenesfromescherichiacoli,klebsielapneumoniae,and Proteusmirabilisisolatescolected duringtigecyclinephase3 clinicaltrials AntimicrobAgentsChemother,2009,53: [7] MundayCJ,XiongJ,LiC,etal DiseminationofCTX M type beta lactamasesin Enterobacteriaceaeisolatesin thepeople s RepublicofChina IntJAntimicrobAgents,2004,23: [8] UrbanC,MarianoN,BradfordPA,etal IdentificationofCTX M beta lactamasesinescherichiacolifrom hospitalizedpatientsand residentsoflong term carefacilities DiagnMicrobiolInfectDis, 2010,66: [9] Nicolas Chanoine MH, Blanco J, Leflon Guibout V, et al IntercontinentalemergenceofEscherichiacolicloneO25:H4 ST131producingCTX M 15 JAntimicrobChemother,2008,61: [10] JacobyGA AmpCbeta lactamases ClinlMicrobiolRev,2009,22: ,TableofContents [11] DalenneC,DaCostaA,DecréD,etal Developmentofasetof multiplexpcrasaysforthedetectionofgenesencodingimportant beta lactamasesinenterobacteriaceae JAntimicrobChemother, 2010,65: [12] 王勇, 蒋晓飞, 孙景勇, 等. 从肺炎克雷伯菌临床菌株中检出质粒介导的 AmpCDHA 1 型 β 内酰胺酶基因. 上海医学检验杂志,2003,18: ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 薛爱华 )
目录 一 2014 年全院 5533 株细菌分布及前 10 位主要细菌耐药性结果 二 按照标本类型 ( 或感染部位 ) 进行的病原菌构成及药敏分析 1 呼吸道标本病原菌构成及药敏分析 2 尿液标本病原菌构成及药敏分析 3 血流 骨髓标本病原菌构成及药敏分析 4 皮肤软组织标本病原菌构成及药敏分析 5
2014 年安医大一附院病原菌分布及药物敏感性分析 编者 : 沈继录 编审 : 王中新徐元宏 1 目录 一 2014 年全院 5533 株细菌分布及前 10 位主要细菌耐药性结果 二 按照标本类型 ( 或感染部位 ) 进行的病原菌构成及药敏分析 1 呼吸道标本病原菌构成及药敏分析 2 尿液标本病原菌构成及药敏分析 3 血流 骨髓标本病原菌构成及药敏分析 4 皮肤软组织标本病原菌构成及药敏分析 5 伤口引流液标本病原菌构成及药敏分析
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上海交通大学附属第六人民医院肺科沈策 lyshence@gmail.com 目前的细菌耐药主要问题 ESBL 产生超广谱 β-lac 酶的 KPN 和 ECO MRS 耐苯唑西林 PRP 耐青霉素和多重耐药的肺炎链球菌 VRE 耐万古霉素的肠球菌 Type 1 持续高产染色体 Type 1 β-lac 酶的阴沟 产气肠杆菌和弗劳地枸橼酸杆菌等 Pseudo 多重耐药的铜绿 嗜麦芽和不动杆菌 2 3
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