检验医学 2014 年 5 月第 29 卷第 5 期 LaboratoryMedicine,May2014,Vol29.No 的大量应用, 细菌对氨基糖苷类药物的耐药越来越严重 产生 16SrRNA 甲基化酶是近年来报道的介导氨基糖苷类高水平耐药的主要机制之一 [1 8] 我们对临床分离

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1 528 文章编号 : (2014) 中图分类号 :R378.2 文献标志码 :A DOI: /j.isn 氨基糖苷类耐药的肠杆菌科细菌 16SrRNA 甲基化酶基因研究 吴琼 1, 韩立中 2, 孙景勇 2, 倪语星 2 3, 陈敏 (1. 上海交通大学附属第六人民医院检验科, 上海 ;2. 上海交通大学医学院附属瑞金医院微生物科, 上海 ;3. 上海市疾病预防控制中心微生物实验室, 上海 ) 摘要 : 目的探讨临床分离的对氨基糖苷类耐药的肠杆菌科细菌产 16SrRNA 甲基化酶状况, 分析其分子流行趋势及其耐药性形成和传播的机制 方法采用纸片扩散法筛选庆大霉素和 / 或阿米卡星耐药的肠杆菌科细菌 ; 采用聚合酶链反应 (PCR) 扩增 16SrRNA 甲基化酶基因 氨基糖苷修饰酶基因 β 内酰胺酶基因 ; 采用质粒接合试验验证 16SrRNA 甲基化酶的转移性 ; 应用脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 对 16SrRNA 甲基化酶基因阳性菌株进行分型 结果 201 株对庆大霉素和 / 或阿米卡星耐药的肠杆菌科细菌中共检出 38 株 16SrRNA 甲基化酶阳性株 (arma 基因 16 株,rmtB 基因 22 株 ) 其中 30 株可通过接合试验将耐药质粒转移至受体菌 bla CTX M 14 bla TEM 1 和 bla SHV 12 可连同 arma 或 rmtb 分别转移到 和 7 个接合子中 肺炎克雷伯菌 大肠埃希菌和阴沟肠杆菌分别被 PFGE 分为 4 21 和 1 个型别 结论本研究分离的肠杆菌科细菌 16SrRNA 甲基化酶以 arma 和 rmtb 为主要流行型别, 且后者分离率较高 该甲基化酶可导致氨基糖苷类高水平耐药, 而且酶编码基因位于质粒上, 具有转移性,β 内酰胺酶基因和氟喹诺酮耐药决定因子可随之一同转移 关键词 :16SrRNA 甲基化酶 ; 肠杆菌科细菌 ; 氨基糖苷类药物 Research on16s rrna methylasein aminoglycoside resistantenterobacteriaceae WU Qiong 1,HAN Lizhong 2,SUNJingyong 2,NIYuxing 2,CHENMin 3 (1.DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiSixthPeople s Hospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200233,China;2.DepartmentofMicrobiology,RuijinHospital, ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China;3.ShanghaiMunicipalCenterforDisease ControlandPrevention,Shanghai200336,China) Abstract:Objective Toinvestigatethemolecularepidemiologicalcharacterizationandthedrugresistanceand prevalencemechanism of16s rrna methylase in aminoglycoside resistantenterobacteriaceaeisolated clinicaly. Methods Gentamicin andoramikacin resistantenterobacteriaceaewerescreenedbydiscdifusionmethod.16srrna methylasegenes,aminoglycosidemodificationenzymegenesandbeta lactamasegeneswereamplifiedbypolymerase chainreaction(pcr).theconjugaltransferofaminoglycoside resistantdeterminationwasperformed.pulsed fieldgel electrophoresis(pfge)wascariedouttoanalyzegenotyping.results Atotalof16armAgeneand22rmtBgene16S rrnamethylasepositiveisolateswereidentified.plasmidconjugationexperimentsweresuccesfulwith30arma or rmtb positiveisolates.bla CTX M 14,bla TEM 1 andbla SHV 12 co transferedwitharmaorrmtbweretransferedto11,20and 7isolates.Klebsielapneumoniae,EscherichiacoliandEnterobactercloacaeweredividedinto4,21and1PFGE paterns.conclusions armaandrmtbarethemaintypesof16srrnamethylaseinenterobacteriaceaeisolatedinour hospital,andrmtbismoreprevalentthanarma.this16srrna methylasecouldmediatehigh levelresistanceto aminoglycoside,andtheencodinggenesarelocatedonplasmidthatcouldtransferamongdiferentspecies.beta lactamasegenesandfluoroquinoloneresistancecouldbecotransferedwitharmaorrmtbgene. Keywords:16SrRNAmethylase;Enterobacteriaceae;Aminoglycosidedrug 氨基糖苷类抗菌药物通过与原核生物 30S 核糖体亚基的 16SrRNA 高度保守的 A 位点结合, 干扰其蛋白质合成, 导致细菌死亡而起到抗菌作 用 该类药物由于抗菌作用强 抗菌谱广, 对革兰阴性及阳性菌均具有良好的抗菌活性, 因而广泛用于各种细菌感染的临床治疗 但随着这类药物 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ) 作者简介 : 吴 琼, 女,1977 年生, 博士, 主管技师, 主要从事细菌耐药机制研究

2 检验医学 2014 年 5 月第 29 卷第 5 期 LaboratoryMedicine,May2014,Vol29.No 的大量应用, 细菌对氨基糖苷类药物的耐药越来越严重 产生 16SrRNA 甲基化酶是近年来报道的介导氨基糖苷类高水平耐药的主要机制之一 [1 8] 我们对临床分离的耐氨基糖苷类肠杆菌科细菌进行了 16SrRNA 甲基化酶分型, 分析其分子流行趋势, 以了解质粒介导的 16SrRNA 甲基化酶所致高水平氨基糖苷类耐药性的形成和传播机制 材料和方法一 试验菌株选择 2006 年 10 月至 2007 年 5 月从上海交通大学医学院附属瑞金医院住院及门诊 急诊患者的各种感染标本中分离出的耐氨基糖苷类肠杆菌科细菌 201 株, 经常规细菌鉴定及 ATB 半自动细菌鉴定仪确证 其中有 82 株分离自中段尿,35 株分离自痰液,17 株分离自血液,9 株分离自各种导管,8 株分离自胆汁,50 株分离自其它标本 质控菌株为大肠埃希菌 (ATCC25922) 肺炎克雷伯菌 (ATCC700603), 购于上海市临床检验中心, 大肠埃希菌 J53Azr 由复旦大学医学院附属华山医院抗生素研究所惠赠 聚合酶链反应 (polymerasechainreaction, PCR) 引物由上海生物工程有限公司合成 二 方法 1. 琼脂稀释法测定最小抑菌浓度 (minimum inhibitoryconcentration,mic) 琼脂稀释法检测肠杆菌科细菌对 8 种抗菌药物的 MIC 值, 药物包括庆大霉素 阿米卡星 哌拉西林 头孢曲松 头孢噻肟 头孢他啶 亚胺培南 环丙沙星 ( 购自卫生部中国药品生物制品检定所 ) 严格按照 全国临床检验操作规程 ( 第 3 版 ) 操作 2. 超广谱 β 内酰胺酶 (extendedspectrum beta lactamases,esbls) 确证试验纸片扩散法检测菌株对头孢他啶 头孢他啶 克拉维酸 头孢噻肟 头孢噻肟 克拉维酸的抑菌圈大小 根据美国临床实验室标准化协会 (ClinicalandLaboratory StandardsInstitute,CLSI)ESBLs 判定标准, 头孢他啶 头孢他啶 克拉维酸和头孢噻肟 头孢噻肟 克拉维酸中任何一项检测的结果, 若加克拉维酸的抑菌圈直径比不加克拉维酸抑菌圈直径 5mm, 则可确认为产 ESBLs 菌株 用肺炎克雷伯菌 (ATCC700603) 作为 ESBLs 检测质控菌株 3.PCR 扩增 16SrRNA 甲基化酶基因及其他耐药基因煮沸法提取细菌 DNA PCR 引物名称 序列和扩增片段大小见表 1 PCR 扩增体系和过程严格按照 全国临床检验操作规程 ( 第 3 版 ) 进行 扩增产物委托上海生物工程有限公司纯化 测序 DNA 测序结果经 BLAST 程序 (htp:// 分析, 与 GenBank 上公布的 16SrRNA 甲基化酶基因及 β 内酰胺酶基因进行比对 表 1 PCR 扩增的引物名称 序列和扩增片段大小 引物名称引物序列 (5 3 ) 扩增片段大小 (bp) arma rmta rmtb rmtc rmtd npma TEM SHV F:AGGTTGTTTCCATTTCTGAG R:TCTCTTCCATTCCCTTCTCC 590 F:ATGAACATCAACGATGCCCT R:CCTTCTGATTGGCTTATCCA 635 F:ATGAACATCAACGATGCCCT R:CCTTCTGATTGGCTTATCCA 756 F:CGAAGAAGTAACAGCCAAAG R:GCTAGAGTCAAGCCAGAAAA 1001 F:TCATTTTCGTTTCAGCAC R:AAACATGAGCGAACTGAAGG 748 F:AAGCACTTTCATACTGACG R:CAATTTTGTTCTTATTAGC 980 F:TCCGCTCATGAGACAATAACC R:TTGGTCTGACAGTTACCAATGC 3977 F:TGGTTATGCGTTATATTCGCC R:GCTTAGCGTTGCCAGTGCT 867

3 530 续表 1 引物名称引物序列 (5 3 ) 扩增片段大小 (bp) CTX M 1 CTX M 2 CTX M 9 CTX M 8 CTX M 25 PER 1 VEB 1 aac(3) Ⅰ aac(3) Ⅱ aac(6 ) Ⅰad aac(6 ) Ⅰb aac(6 ) Ⅱ ant(3 ) Ⅰ ant(2 ) Ⅰ F:TCTTCCAGAATAAGGAATCCC R:CCGTTTCCGCTATTACAAAC 909 F:ATGATGACTCAGAGCATTCG R:TGGGTTACGATTTTCGCCGC 866 F:ATGGTGACAAAGAGAGTGCA R:CCCTTCGGCGATGATTCTC 870 F:ATGATGAGACATCGCGTTAAG R:CGGTGACGATTTTCGCGGCAG 865 F:CACACGAATTGAATGTTCAG R:TCACTCCACATGGTGAGT 924 F:ATGAATGTCATTATAAAAGC R:AATTTGGGCTTAGGGCAGAA 925 F:CGACTTCCATTTCCCGATGC R:GGACTCTGCAACAAATACGC 642 F:ACCTACTCCCAACATCAGCC R:ATATAGATCTCACTACGCGC 169 F:ACTGTGATGGGATACGCGTC R:CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA 237 F:ATGATTAGAAAAGCAACTGTCCAAG R:TTAAAGTTGCTTTGTAAAACAAATC 435 F:TATGAGTGGCTAAATCGA R:CCCGCTTTCTCGTAGCA 394 F:TTCATGTCCGCGAGCACCCC R:GACTCTTCCGCCATCGCTCT 178 F:TGATTTGCTGGTTACGGTGAC R:CGCTATGTTCTCTTGCTTTTG 284 F:GAGCGAAATCTGCCGCTCTGG R:5CTGTTACAACGGACTGGCCGC 质粒接合试验将供体菌和受体菌大肠埃希菌 J53Azr 分别划线接种于血平板,35 孵育过夜 次日, 挑取单个菌落分别转种 2mLLB 肉汤中,35 振荡孵育 4h 各取 0.5mL 的供体菌和受体菌加入到 4mLLB 肉汤中,35 静置孵育过夜, 取 0.1mL 的混合菌液涂布于含 100μg/mL 的叠氮钠和 128μg/mL 阿米卡星或 1μg/mL 亚胺培南的大豆胰蛋白平板,35 孵育过夜 5. 脉冲场凝胶电泳 (pulsed fieldgelelectro phoresis,pfge) 进行同源性分析采用 XbaⅠ 内切酶 (Takara 公司 ) 进行全基因组酶切后, 用 PFGE 分型 [9 10] 细菌划线分离于血平板,35 孵育过夜 次日挑取单个菌落进行 PFGE 结果一 耐氨基糖苷类肠杆菌科细菌的分离情况临床分离到的对庆大霉素和 / 或阿米卡星耐药的 201 株肠杆菌科细菌中大肠埃希菌 142 株 肺炎克雷伯菌 35 株 阴沟肠杆菌 24 株 其中 44 株对庆大霉素和阿米卡星同时耐药, 包括大肠埃希菌 27 株 肺炎克雷伯菌 8 株 阴沟肠杆菌 9 株 二 耐氨基糖苷类肠杆菌科细菌对 15 种抗菌药物的敏感性 201 株耐庆大霉素和 / 或阿米卡星的肠杆菌科细菌对临床常用各类抗菌药物耐药较严重 3 种细菌对氨苄西林的耐药率最高, 为 100.0%; 阴沟肠杆菌和大肠埃希菌对第 1 2 代头孢菌素的耐药率均在 98.0% 以上, 肺炎克雷伯菌对第 1 2 代头孢菌素的耐药率相对较低, 为 88.0% 以上 阴沟肠杆菌对第 3 代头孢菌素的耐药率为 90.0% 以上, 其次为大肠埃希菌 ( 对头孢噻肟耐药率为 93.0%, 对头孢他啶耐药率为 33.1%), 最后为肺炎克雷伯菌 ( 对头孢噻肟耐药率为 82.9%, 对头孢他啶耐药率为 80.0%) 对于第 4 代头孢菌素 头孢吡肟的耐药率, 阴沟肠杆菌的耐药现象较为严重, 为 54.2%, 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药中则相对较低, 分别为 31.0% 和 37.1% 3 种细菌对酶抑制剂耐药的情况也较为

4 检验医学 2014 年 5 月第 29 卷第 5 期 LaboratoryMedicine,May2014,Vol29.No 普遍, 尤其是阴沟肠杆菌对 β 内酰胺类 / 酶抑制剂复合物的耐药情况最为严重, 对氨苄西林 舒巴坦和哌拉西林 他唑巴坦的耐药率分别为 100.0% 70.8%; 其次为肺炎克雷伯菌, 耐药率分别为 91.4% 51.4%; 大肠埃希菌耐药率分别为 88.7% 5.6% 3 种细菌对氨基糖苷类的耐药情况是对庆大霉素的耐药率明显高于阿米卡星 : 所有分离的阴沟肠杆菌对庆大霉素均耐药, 对阿米卡星的耐药率为 37.5%; 大肠埃希菌对庆大霉素和阿米卡星的耐药率分别为 97.9% 19.0%; 肺炎克雷伯菌则分别为 97.1% 25.7% 对复方磺胺类和氟喹诺酮类的耐药率也较高,3 种细菌的耐药率分别在 80.0% 和 65.0% 以上 由统计结果可知碳青霉烯类药物是敏感率最高的药物, 仅阴沟肠杆菌存在 5 株耐药株, 耐药率为 20.8%, 其余 2 种细菌均为全部敏感 三 ESBLs 确证试验经 ESBLs 确证试验,142 株大肠埃希菌中有 139 株为产 ESBLs 阳性株, 产酶率高达 97.9%;35 株肺炎克雷伯菌中有 25 株产 ESBLs, 产酶率为 71.4% 四 16SrRNA 甲基化酶基因扩增及 DNA 测序结果在 201 株对庆大霉素和 / 或阿米卡星耐药肠杆菌科细菌中共检出 38 株 16SrRNA 甲基化酶阳性株, 其中 16 株 (4 株大肠埃希菌 6 株肺炎克雷 伯菌 6 株阴沟肠杆菌 ) 为 arma 基因阳性株 ;22 株 (20 株大肠埃希菌 2 株肺炎克雷伯菌 ) 为 rmtb 阳性株, 见图 1 未检测到 rmta rmtc rmtd npma 基因 在其他氨基糖苷类非耐药株中均未检测到 16SrRNA 甲基化酶基因 PCR 扩增产物经 DNA 双向测序证实为 arma 基因和 rmtb 基因, 基因号分别为 EU 和 AB 注 :M 为 Marker;1~4 为 arma 型 16SrRNA 甲基化酶 ;5~8 为 rmtb 型 16SrRNA 甲基化酶 ;1 为 K32;2 为 K48;3 为 E127;4 为 E133;5 为 E122;6 为 E162;7 为 E164;8 为 E167 图 1 肠杆菌科细菌 16SrRNA 甲基化酶基因扩增产物电泳结果 五 β 内酰胺酶基因扩增对 38 株 16SrRNA 甲基化酶基因阳性菌株进行 β 内酰胺酶基因扩增及扩增产物双向测序, 结果见表 2 图 %(31/38) 的 arma 或 rmtb 阳性菌株 CTX M 型 β 内酰胺酶基因呈阳性, 对照菌株大肠埃希菌 (ATCC25922)PCR 结果均为阴性 表 2 16SrRNA 甲基化酶基因阳性菌株 β 内酰胺酶分型 类别 β 内酰胺酶型别菌株 arma 阳性大肠埃希菌 TEM 1,SHV 12 E170 TEM 1,CTX M 14 E66,E133 TEM 1,SHV 12,CTX M 2 E127 肺炎克雷伯菌 SHV 1 K48 TEM 1,SHV 1 K45 CTX M 14 K4,K15 SHV 12,CTX M 14 K6 TEM 1,SHV 12,CTX M 2 K32 阴沟肠杆菌 TEM 1,SHV 1,CTX M 14 O31 TEM 1,SHV 12,CTX M 14 O33,O34,O35,O36,O37 rmtb 阳性大肠埃希菌 TEM 1 E164,E167,E180,E204 CTX M 14 E84,E178 TEM 1,CTX M 14 E31,E111,E122,E162,E173,E183,E188,E196, E200,E202,E203 肺炎克雷伯菌 TEM 1,CTX M 2,CTX M 14 E94,E117 TEM 1,SHV 12,CTX M 2,CTX M 14 E165 TEM 1,SHV 12,CTX M 14 K49 TEM 1,SHV 12,CTX M 2,CTX M 14 K46

5 532 注 :M 为 Marker;1 为 TEM 1;2 为 SHV 1;3 为 CTX M 2;4 为 CTX M 14;5 为 arma 图 2 arma 阳性株 β 内酰胺酶基因扩增产物电泳图 六 氨基糖苷修饰酶基因扩增结果对 38 株 16SrRNA 甲基化酶基因阳性菌株进行氨基糖苷修饰酶基因扩增, 结果见图 3 对照菌株大肠埃希菌 (ATCC25922)PCR 结果均为阴性 肺炎克雷伯菌中未检出 aac(6 ) Ⅰad 基因, 阴沟肠杆菌中未检出 aac(6 ) Ⅰad 和 aac(6 ) Ⅰb 基因, 大肠埃希菌中未检出 aac(6 ) Ⅰad 和 aac(6 ) Ⅱ 基因 aac(3) Ⅰ aac(3) Ⅱ aac(6 ) Ⅰb aac(6 ) Ⅱ ant (3 ) Ⅰ ant(2 ) Ⅰ 的检出率分别为 26.3% 71.1% 60.5% 31.6% 76.3% 和 86.8% 注 :M 为 Marker;1 为 aac(3) Ⅰ;2 为 aac(3) Ⅱ;3 为 aac (6 ) Ⅰb;4 为 aac(6 ) Ⅱ;5 为 ant(3 ) Ⅰ;6 为 ant(2 ) Ⅰ 图 3 16SrRNA 甲基化酶基因阳性菌株氨基糖苷修饰酶基因扩增产物电泳图 七 16SrRNA 甲基化酶基因阳性株对 8 种抗菌药物的 MIC 值 38 株 16SrRNA 甲基化酶基因阳性株对 8 种抗菌药物的耐药程度极高, 见表 3 其中对氨基糖苷类呈现高水平耐药,MIC50 和 MIC90 均 > 256mg/L 36 株对环丙沙星耐药, 耐药率高达 94.7%(36/38) 5 株阴沟肠杆菌对亚胺培南耐药, 且该 5 株菌株除对多黏菌素 B 敏感外, 对其他抗菌药物均耐药 八 质粒接合试验结果 38 株 16SrRNA 甲基化酶基因阳性株中有 30 株可在含阿米卡星和叠氮钠的筛选平板上获得接合子 其中有 14 株 arma 阳性株,16 株 rmtb 阳性株 8 株未能筛选到接合子 接合子抗菌药物敏感性试验显示均对庆大霉素和阿米卡星耐药,8 株对环丙沙星耐药 抽提接合子质粒后, 以其为 模板扩增 arma 基因和 rmtb 基因均为阳性 ; 扩增 β 内酰胺酶基因结果显示,bla CTX M 14 bla TEM 1 和 bla SHV 12 可连同 arma 或 rmtb 分别转移到 和 7 个接合子中 表 3 16SrRNA 甲基化酶基因阳性株对 8 种抗菌药物的 MIC 值 MIC(mg/L) 菌株 抗菌药物 范围 MIC50MIC90 大肠埃希菌 庆大霉素 256~>256 >256 >256 阿米卡星 128~>256 >256 >256 哌拉西林 16~>256 >256 >256 头孢曲松 0.25~> 头孢噻肟 0.25~> >256 头孢他啶 0.5~ 环丙沙星 <0.03~> >256 亚胺培南 0.25~ 肺炎克雷伯菌 庆大霉素 128~>256 >256 >256 阿米卡星 128~>256 >256 >256 哌拉西林 8~>256 >256 >256 头孢曲松 0.06~> >256 头孢噻肟 0.06~> >256 头孢他啶 0.5~ 环丙沙星 4~ 亚胺培南 0.25~2 2 2 阴沟肠杆菌 庆大霉素 >256 >256 >256 阿米卡星 >256 >256 >256 哌拉西林 >256 >256 >256 头孢曲松 32~>256 >256 >256 头孢噻肟 4~>256 >256 >256 头孢他啶 8~32 >256 >256 环丙沙星 32~ 亚胺培南 2~ 九 PFGE 分型结果 38 株 16SrRNA 甲基化酶基因阳性菌株 PFGE 分型结果见图 4 肺炎克雷伯菌 大肠埃希 菌和阴沟肠杆菌分别被分为 4 21 和 1 个型别 6 株阴沟肠杆菌 PFGE 谱型一致, 可能源于同一株 克隆 肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌 PFGE 谱型各 异, 表明可能存在散在播散

6 检验医学 2014 年 5 月第 29 卷第 5 期 LaboratoryMedicine,May2014,Vol29.No 注 :(a) 大肠埃希菌 PFGE 分型 ;(b) 肺炎克雷伯菌 PFGE 分型 ;(c) 阴沟肠杆菌 PFEG 分型 讨 [1] 2003 年 Galimand 等在分离自法国的一株肺炎克雷伯菌 BM4536 中发现, 该菌对头孢噻肟和磺胺 甲氧苄啶耐药, 对氨基糖苷类呈现异常的广泛耐药, 并且该耐药表型可随质粒转移至接合试验受体菌 ; 对链霉素 大观霉素耐药是由于 ant3 9 基因介导, 对其它剩余的氨基糖苷类耐药 [2] 则归因于 aac3 Ⅱ 和 arma 基因 Liou 等研究发现,armA 基因编码的 ArmA 蛋白使 16SrRNAN7 G1405 位点发生甲基化, 阻碍其于 4,6 脱氧链霉胺的 3 氨基之间的氢键形成, 并造成 G1405 与庆大霉素环 Ⅲ 之间产生空间位阻 这一甲基化将使 G1405 发生改变, 导致氨基糖苷与译码位点不能结合, 从而形成耐药 这是国际上首次报道发现的一种导致氨基糖苷类高水平耐药的质粒介导的 16SrRNA 甲基化酶 在后来的几年中又相继报 图 4 16SrRNA 甲基化酶阳性肠杆菌科细菌 PFGE 分型图谱 论 道了 5 种甲基化酶基因, 即 rmta [3 4] rmtb [5] rmtc [6] rmtd [7] 和 npma [8] 虽然在革兰阴性致病菌中新发现的这一机制在全球报道不是很多, 但由于质粒介导, 可在非发酵菌和肠杆菌科细菌中横向传播, 也可在同一菌种间克隆传播, 其危害性不容忽视 因此, 本研究试图对瑞金医院分离的耐氨基糖苷类肠杆菌科细菌产质粒介导的 16S rrna 甲基化酶的状况进行调查, 分析其分子流行趋势 基因环境及传播机制 本研究共收集了来自上海交通大学医学院附属瑞金医院各个临床科室分离的对庆大霉素和 / 或阿米卡星耐药肠杆菌科细菌 201 株 ( 排除同一患者的相同菌株 ) 在该批肠杆菌科细菌中, 共检测到 38 株 16SrRNA 甲基化酶阳性株 在 44 株对庆大霉素和阿米卡星同时耐药的菌株中, 有 6 株未检测到 16SrRNA 甲基化酶基因, 其耐药性可能由其他机制所引起 本研究对庆大霉素和 /

7 534 或阿米卡星非耐药株也进行了 16SrRNA 甲基化酶基因筛查, 未检出相关基因 在所有收集的菌株中均未检测到 rmta rmtc rmtd npma 基因 这表明, 瑞金医院耐氨基糖苷类肠杆菌科细菌 16S rrna 甲基化酶以 ArmA 和 RmtB 为流行型别 ArmA 型甲基化酶是 6 种 16SrRNA 甲基化酶中最先报道发现的 研究表明 arma 基因常与 CTX M 型 β 内酰胺酶存在某种联系,armA 基因位于接合型质粒 pip1204 上, 而该质粒与编码 CTX M 型 β 内酰胺酶的转座子相邻 [1] 在中国台湾地区,94.3% 的 arma 或 rmtb 阳性菌株产 CTX M 型 β 内酰胺酶 本研究显示,81.6%(31/ 38) 的 arma 或 rmtb 阳性菌株 CTX M 型 β 内酰胺酶基因扩增呈阳性 然而, 同样在亚洲, 一项来自韩国的调查研究发现, 仅有一株 16SrRNA 甲基化酶阳性的肺炎克雷伯菌具有 CTX M 14 等位基因 [11] 这一差异可能归因于地域上的不同, 其真正原因有待深入研究 rmtb 最早在日本被发现 [5] 该耐药决定因子位于非接合性大质粒上, 但可经转化进入受体菌 耐药基因编码产物氨基酸序列分析显示与 RmtA 有 82% 的相似性, 组氨酸标记的重组蛋白可使大肠埃希菌 16SrRNA 甲基化, 因此将该基因命名为 rmtb, 其位于 Tn3 结构旁 本研究中接合试验显示,rmtB 基因与 arma 基因相同, 也可通过接合形式在不同菌株间转移, 导致耐药基因的扩散 因此, 在我国分离的 rmtb 基因阳性菌株中, 该耐药基因被证实位于可接合性质粒上 但本研究发现有 8 株未能得到接合子 是否该 8 株菌株中存在耐药决定子位于非接合性质粒上, 或可通过接合形式转移至受体菌中, 但不能在受体菌中复制从而丧失编码甲基化酶的功能, 又或者可通过转化的形式转移到受体菌中, 尚待进一步研究证实 对接合子的药物敏感试验及 β 内酰胺酶等基因扩增的结果表明,β 内酰胺酶基因及氟喹诺酮类耐药决定因子可随同 arma 基因和 rmtb 基因在不同菌株间转移 由此可见, 由质粒传播导致的对不同种类抗菌药物耐药的现象, 是我们关注并采取一定措施预防和控制的重点 质粒介导的 16SrRNA 甲基化酶作为一种新型氨基糖苷类耐药决定因子已引起世界的广泛关注, 这提示广大医务工作者和流行病学工作者应高度重视这一耐药现象, 早期筛查具有该基因的病原菌, 并且采取一定措施, 加强对这一类耐药菌株的监控, 以防止耐药菌株广泛传播 参考文献 [1] GalimandM,CourvalinP,LambertT.Plasmid mediatedhigh levelresistancetoaminoglycosidesin Enterobacteriaceaedueto16SrRNAmethylation[J]. AntimicrobAgentsChemother,2003,47(8): [2] LiouGF, YoshizawaS, CourvalinP, etal. Aminoglycoside resistance by ArmA mediated ribosomal 16S methylation in human bacterial pathogens[j].jmolbiol,2006,359(2): [3] YokoyamaK,DoiY,YamaneK,etal.Acquisition of16s rrna methylase gene in Pseudomonas aeruginosa[j].lancet,2003,362(9399): [4] YamaneK,DoiY,YokoyamaK,etal.Genetic environments ofthe rmta gene in Pseudomonas aeruginosaclinicalisolates[j].antimicrobagents Chemother,2004,48(6): [5] DoiY,YokoyamaK,YamaneK,etal.Plasmid mediated16srrnamethylaseinseratiamarcescens conferinghigh levelresistancetoaminoglycosides [J].AntimicrobAgentsChemother,2004,48(2): [6] WachinoJ,YamaneK,ShibayamaK,etal.Novel plasmid mediated 16S rrna methylase, RmtC, foundin aproteusmirabilisisolatedemonstrating extraordinaryhigh levelresistance againstvarious aminogycosides[j].antimicrobagentschemother, 2006,50(1): [7] DoiY,deOliveiraGarciaD,AdamsJ,etal. Coproductionofnovel16SrRNA methylasermtd andmetalo beta lactamasespm 1inapanresistant Pseudomonasaeruginosa isolatefrom Brazil[J]. AntimicrobAgentsChemother,2007,51(3): [8] WachinoJ,ShibayamaK,KurokawaH,etal.Novel plasmid mediated 16S rrna m1a1408 methyltransferase, NpmA, found in a clinicaly isolatedescherichiacolistrainresistanttostructuraly diverse aminoglycosides[j]. Antimicrob Agents Chemother,2007,51(12): [9] TenoverFC,ArbeitRD,GoeringRV,etal. InterpretingchromosomalDNA restriction paterns producedbypulsed fieldgelelectrophoresis:criteria forbacterialstraintyping[j].jclinmicrobiol, 1995,33(9): [10] WeiZQ,ChenYG,YuYS,etal.Nosocomial spread of multi resistant Klebsiela pneumoniae containing a plasmid encoding multiple beta lactamases[j].jmedmicrobiol,2005,54(pt9): [11] LeeH,YongD,Yum JH,etal.Diseminationof 16S rrna methylase mediated highly amikacin resistant isolates of Klebsiela pneumoniae and Acinetobacter baumanni in Korea[J]. Diagn MicrobiolInfectDis,2006,56(3): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 姜敏 )

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