簡介 糖尿病和癌症都有複雜的病因並可能互相影響 二型糖尿病患者患癌的風險較沒有糖尿病的患者高 1.3 至 3 倍 [1-3] 糖尿病人患癌致死不容忽視, 本地約有四分之一糖尿病死亡個案來自癌症 [4,5] 香港中文大學內科及藥物治療學系的流行病學研究發現二型糖尿病患者的高血糖可能是患癌風險上升的主因 [6-8] 我們在 1995 年建立了香港糖尿病登記這個定期更新的資料庫, 紀錄糖尿病患者的臨床檢驗數據和病情變化 [4,7], 用以提升治療糖尿病的效果 我們利用這個資料庫的數據, 查證各種與癌症相關的風險因素, 發掘出二型糖尿病患者患上癌症前的一些共同特徵 首先, 血液中的脂肪水平和白血球數量可以預測糖尿病患者患上癌症的風險, 並呈現非線性 (non-linear) 相關 [9] 二型糖尿病患者患上癌症的風險隨血液中總膽固醇上升而下降, 直至血液中總膽固醇高於 4. 3 mmol/l 時, 患上癌症的風險不再下降, 趨於平穩 血液中白血球數量與患癌的風險呈現 V 型關係, 血液中白血球數量低於 5. 8x10 9 /L 時患癌風險顯著增加 [9] 我們綜合了各種患癌的風險因素, 包括年齡 吸煙狀況和血液中的脂肪水平和白血球數量, 開發出二型糖尿病患者患癌的風險方程式, 經過在二型糖尿病患者中驗證, 在接收者操作特徵曲線 (receiver s operating characteristic curve) 下的面積 (aroc) 達到 0.71 [10] 再者, 我們還發現低密度膽固醇 (LDL-C) 和患癌風險有非線性關係 [11], 而且在服用腎素 - 血管收縮素系統 (RAS,renin-angiotensin system) 抑制劑和他汀類 (statin) 藥物的病例中大幅少 [12] 這個發現和我們在大鼠身上切除單腎 ( UNX, uninerphrectomixed) 的實驗結果不謀而合 [13] 大鼠切除單腎後, 出現糖尿 血脂異常 腎衰竭和腎臟腫瘤等徵狀, 服用 RAS 抑制劑後, 這些徵狀大幅緩解, 腫瘤數量減少, 膽固醇合成和胰島素生長因子 (IGF-1) 的活性恢復正常, 暗示 RAS 系統 膽固醇合成的調控和胰島素生長因子訊號傳遞之間有更深入的相互作用, 影響癌症在二型糖尿病患者的發展 [14] 我們從隨訪跟進的二型糖尿病病例中發現, 糖化血紅素 (HbA1c) 每增加百分之一, 患上癌症的風險相應增加百分之十八 [7] 從香港糖尿病登記中的病例顯示, 約有一半的二型糖尿病癌症病例是消化系統的癌症, 包括肝癌和大腸直腸癌 我們曾經進行研究, 發現有慢性乙型肝炎的二型糖尿病患者患上肝癌的風險大幅增加, 風險比率在血糖控制不善 (HBA1c 7%) 的患者中由 3.74 增至 74.96 [15] 小分子核糖核酸 (microrna) 是一類由 19 至 28 個核苷酸組成可以調控基因表達的非編碼核糖核酸 大概而言,microRNA 通過影響轉錄後的機制來抑制基因表達 microrna 通過和信使核糖核酸 (mrna)3 末端非編碼區 (3 UTR) 上的標靶序列結合, 引發信使核糖核酸降解或抑制合成蛋白質的轉譯作用 [16] 同一種 microrna 可以作用於多個不同基因的信使核糖核酸, 因而調控多個基因和生物途徑, 包括細胞增長 [17] 凋亡作用 [18] 和癌細胞代謝 [19,20], 起關鍵作用 不少研究都發現 microrna 在癌症和一些疾病中表達異常 [21-23] 例如 mir-221/222 在一些腫瘤中水平升高 在前列腺癌中,miR-221/222 針對一個抑制細胞周期的調控基因 p27kip1 起作用, 降低其表達水平, 從而促進癌細胞增長 當 mir-221/222 受到抑制後, 癌細胞增長亦相應受制 [17] 在乳癌 [24] 和肝癌 [25] 細胞中也發現類似 2
的調控機制 另一方面, 常見 mir-16 在一些癌細胞中受到抑制 在白血病細胞中, mir-16 可以抑制有抗凋亡作用的基因 Bcl-2, 低水平的 mir-16 令癌細胞不受凋亡作用影響, 持續生長 [18] microrna 不單在細胞內起作門, 癌細胞還可以分泌 microrna 進入血液中, 形成小囊泡可作用於遠端的細胞和器官 近年的研究顯示檢測血清中 microrna 可以成為癌症的生物指標, 具有臨床應用價值 找尋癌症的生物指標用於預報和早期發現癌症是生物醫學研究中一個快速發展的領域 [26-28] microrna 是近年這方面研究的焦點, 因為癌細胞中 microrna 在各種調控機制的上游起關鍵作用, 是成癌機理的一部份 [16] 再者, 癌細胞常見的染色體缺失區域往往包括聚集一起的 microrna 基因 [29-31] microrna 表達調控失常在癌細胞中頗為常見 [21,32],microRNA 與癌細胞的密切關係令其成為早期發現癌症的研究的主要目標 在 microrna 與癌症的研究中, 已經在癌細胞的分型特徵 [33] 偵測和預後 [23,34] 方面花了不少功夫 最近有研究報告利用實時 PCR 技術在血清中檢測 microrna, 發現和肺癌和大腸直腸癌相關的 microrna 表達特徵 [35] 同一個報告還顯示血清中的 microrna 表達水平穩定可靠, 結合實時 PCR 技術有望發展成一個簡單 識別性高的非侵入性癌症檢測技術 目標 我們的目標是開發一組可以早期預測二型糖尿病患者患上肝癌的小分子 RNA (microrna) 特徵, 並為這組高危患者開發肝癌的早期檢測分析 方法 我們從香港糖尿病登記中選出潛在的肝癌病例的血清樣本提取 microrna 用於微陣列研究, 以發現用於早期檢測二型糖尿病肝癌患者的 microrna 特徵 對於第一步微陣列研究, 選擇了 10 個潛在的二型糖尿病患上肝癌的病例, 對照是 10 個沒有癌症的二型糖尿病病例 兩組在年齡 性別 病齡 身高體重指數 (BMI) 上匹配, 患癌病例的血清樣本在癌症確診之前 1 至 5 年收集 從所選病例的血清樣本中提取 microrna 後, 使用 Affymetrix GeneChip mirna 4.0 微陣列檢測 microrna 在血清中的水平, 利用 GeneSpring 軟件進行數據分析, 選出 5 至 10 個 microrna, 使用實時 PCR(real-time PCR) 在 400 個 T2D 病例中進一步驗證核實 结果 1. 利用微陣列找出二型糖尿病型糖尿病肝癌患者的 microrna 特徵 我們從香港糖尿病登記中選出潛在的肝癌病例的血清樣本提取 microrna 用於微陣列研究, 以期找出二型糖尿病患者患上肝癌的 microrna 早期檢測特徵 表 3
一是所選病例和對照組的比較 利用 10 個肝癌病發前 1 至 5 年收集的二型糖尿病血清樣本, 配合 10 個在年齡 性別 BMI 和病況相若的血清樣本作對照, 我們用 Trizol 試劑從血清中提取核糖核酸 (RNA) 作檢測比較 整個過程遵照標準操作步驟, 並加入外源的 ath-mir-172a ( microrna ) 用作質量監控 我們採用了 Affymetrix 公司 Gene Chip mirna 4.0 微陣列去檢測血清 microrna 水平, 委託香港中文大學李嘉誠健康科學研究所中心實驗室按照標準的步驟進行標記 雜交 清洗和掃描, 測定血清中 microrna 水平 得到的數據用 Gene Spring v.13 軟件進行分析, 以期找出二型糖尿病肝癌患者的 microrna 早期特徵 經過分析,Affymetrix Gene Chip mirna 4.0 微陣列檢測到 4411 種 microrna 和非編碼 RNA 其中 271 個 microrna 和 microrna 前體 (precursor) 統計上在患癌組和對照組之間有顯著差異 當中 17 個 microrna 在患癌組明顯增加了百分之五十或以上, 列於表二 2. 利用實時 PCR 驗證核實 microrna 表達水平 我們從香港糖尿病登記中選出更多的病例去進一步驗證核實從微陣列研究發現的結果 用於驗證的病例包括 109 個二型糖尿病患上肝癌的病例, 以及 236 個和肝癌病例在年齡 性別 BMI HbA1c 水平和病況相若的非癌症病例 此外還包括 139 個潛在大腸癌病例, 以測試在肝癌中找到的 microrna 特徵是否在其它癌症中出現, 表三比較了三組病例的基本參數 我們從收集的血清樣本中提取 RNA, 然後用實時 PCR 定量 microrna 的水平 我們用實時 PCR 技術定量測試了在第一部分微陣列研究中顯示最大增幅的 5 個 microrna, 包括 mir-122-5p mir-4454 mir-486-5p mir-92a-3p 和 mir-4532, 並在每個樣本中加入相同數量的外源 ath-mir-172a, 用以修正誤差 首先用血清中的 RNA 為模板, 用 Taqman Advanced mirna cdna synthesis kit 試劑盒合成 cdna, 然後用 Taqman Advanced mirna assays 嚴格按照生產商規定的步驟進行實時 PCR 定量測試 其中只能在少於百分之十的樣本中檢測到 mir-4454, 因此這一 microrna 不再跟進 其餘 microrna 都能在大部分樣本中檢測到 個別 microrna 在個別樣本中水平太低未能檢測到, 數值上按等於零處理 實時 PCR 定量測試的結果用 SPSS v.22 軟件進行統計分析 我們用方差分析 (ANOVA) 比較三組病例的血清 microrna 水平, 顯示 mir- 122-5p mir-92a-3p 和 mir-4532 平均水平都有明顯差異 二型糖尿病肝癌患者血清中的 mir-122-5p 平均水平比沒有患癌的二型糖尿病患者高 2 倍 (P = 0.0002, 圖一 ) 相較之下, 二型糖尿病肝癌患者血清中的 mir-92a-3p 水平只升高了 48%(P = 0.028, 圖一 ) 而 mir-4532 在二型糖尿病肝癌患者血清中升高了 1.9 倍 (P = 0.0297, 圖一 ) 在二型糖尿病大腸癌患者中, 幾個 microrna 的血清水平都沒有明顯差異 當二型糖尿病肝癌患者和沒有肝癌的二型糖尿病患者 ( 沒有患癌的二型糖尿病患者加上二型糖尿病大腸癌患者 ) 比較, 四種 microrna 水平都有顯著增加 ( 表四 ) 4
如果二型糖尿病肝癌患者加上大腸癌患者加在一起和沒有患癌的二型糖尿病患者作比較,miR-122-5p 和 mir-4532 的血清水平都明顯增加 結論 四個經測試的 microrna(mir-122-5p mir-486-5p mir-92a-3p 和 mir-4532) 在潛在二型糖尿病肝癌患者中的血清水平都有增加, 其中以 mir-122-5p 最明顯突出 mir-122-5p 很有潛力成為預測二型糖尿病患者患上肝癌的生物標記 我們需要進一步深入研究, 證實 mir-122-5p 的重要性和在臨床上的應用, 並以此開發早期發現二型糖尿病患者患上肝癌測試 參巧文獻 1. Chan, J.C., et al., Diabetes in Asia: epidemiology, risk factors, and pathophysiology. JAMA, 2009. 301(20): p. 2129-40. 2. Emerging Risk Factors, C., et al., Diabetes mellitus, fasting glucose, and risk of cause-specific death. N Engl J Med, 2011. 364(9): p. 829-41. 3. Inoue, M., et al., Diabetes mellitus and the risk of cancer: results from a largescale population-based cohort study in Japan. Arch Intern Med, 2006. 166(17): p. 1871-7. 4. So, W.Y., et al., Risk factors in V-shaped risk associations with all-cause mortality in type 2 diabetes-the Hong Kong Diabetes Registry. Diabetes Metab Res Rev, 2008. 24(3): p. 238-46. 5. Yang, X., et al., Development and validation of an all-cause mortality risk score in type 2 diabetes. Arch Intern Med, 2008. 168(5): p. 451-7. 6. Jee, S.H., et al., Fasting serum glucose level and cancer risk in Korean men and women. JAMA, 2005. 293(2): p. 194-202. 7. Yang, X., et al., Associations of hyperglycemia and insulin usage with the risk of cancer in type 2 diabetes: the Hong Kong diabetes registry. Diabetes, 2010. 59(5): p. 1254-60. 8. Yang, X.L., R.C. Ma, and J.C. Chan, Meta-analysis of trial data may support a causal role of hyperglycaemia in cancer. Diabetologia, 2011. 54(3): p. 709-10; author reply 711-2. 5
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No Cancer Colon Cancer Liver Cancer No Cancer Colon Cancer Liver Cancer No Cancer Colon Cancer Liver Cancer No Cancer Colon Cancer Liver Cancer 圖一二型糖尿病患者的血清 microrna 水平 圖示經標準化的血清 mir-122-5p, mir-92a-3p, mir-486-5p 和 mir-4532 在二型糖尿病無癌症組 二型糖尿病肝癌組和二型糖尿病大腸癌組的相對水平, 以 Mean ± SEM 表示 8
表一進行微陣列研究的病例比較 T2D No cancer T2D Liver cancer 糖尿病無癌症糖尿病肝癌 P 數目 (N) 10 10 性別 (F:M) 4 : 6 4 : 6 年齡 ( 歲 ) 62.40 ± 9.81 64.30 ± 7.96 0.640 病齡 ( 年 ) 7.90 ± 5.20 7.00 ± 5.27 0.705 BMI 24.48 ± 2.95 25.02 ± 3.11 0.697 HbA1c (%) 7.83 ± 1.22 8.01 ± 2.91 0.860 總膽固醇 (mmol/l) 5.99 ± 0.82 5.15 ± 1.76 0.214 白血球計數 (10 9 cells/l) 6.58 ± 1.72 7.62 ± 4.88 0.534 癌前期 ( 年 ) 3.07 ± 1.41 以 Mean ± SD 表示 9
表二二型糖尿病潛在肝癌患者血清 microrna 變化綜覽 Micro RNA P 調控方向 變化水平 ( 倍 ) mir-122 122-5p 4.46e-05 上升 3.14 mir-4454 0.0157 上升 2.10 mir-486 486-5p 0.0148 上升 2.10 mir-92a 92a-3p 0.0166 上升 2.09 mir-4532 0.0124 上升 2.09 mir-320b 0.0020 上升 1.96 mir-7110 7110-5p 0.0368 上升 1.85 mir-320c 0.0075 上升 1.78 mir-185 185-5p 5p 0.0156 上升 1.76 mir-320a 0.0103 上升 1.75 mir-4674 0.0225 上升 1.73 mir-3663 3663-3p 3p 0.0161 上升 1.69 mir-93 93-5p 0.0047 上升 1.60 mir-4492 0.0275 上升 1.57 mir-320d 0.0228 上升 1.56 mir-22 22-3p 0.0105 上升 1.55 mir-17 17-5p 0.0073 上升 1.50 10
表三進行 qpcr 驗證的病例比較 T2D T2D T2D ANOVA No cancer Colon cancer Liver cancer P 1 糖尿病無癌症糖尿病大腸癌糖尿病肝癌 P 2 數目 (N) 236 139 109 性別 (F:M) 65 : 171 63 : 76 21 : 88 年齡 ( 歲 ) 60.15 ± 11.23 64.68 ± 8.72 58.92 ± 10.37 0.000 0.333 病齡 ( 年 ) 6.41 ± 6.04 7.37 ± 6.44 6.31 ± 5.56 0.264 0.889 BMI 24.46 ± 3.61 25.47 ± 3.60 23.74 ± 2.85 0.000 0.068 HbA1c (%) 7.92 ± 1.85 7.81 ± 1.744 7.91 ± 1.87 0.838 0.971 總膽固醇 (mmol/l) 5.25 ± 1.01 5.16 ± 1.13 4.90 ± 1.20 0.031 0.008 白血球計數 (10 9 cells/l) 7.37 ± 1.94 7.23 ± 1.91 6.68 ± 2.65 0.030 0.025 癌前期 ( 年 ) 5.92 ± 4.72 5.17 ± 4.53 0.210 以 Mean ± SD 表示 1 用 ANOVA 進行三組比較 2 用 t-test 比較糖尿病無癌組和糖尿病肝癌組 11
表四各組 microrna 血清水平比較 Serum level in T2D no cancer 糖尿病無癌症 Serum level in T2D colon cancer 糖尿病大腸癌 Serum level in T2D liver cancer 糖尿病肝癌 三組 ANOVA P 糖尿病肝癌對糖尿病無癌症 糖尿病肝癌對糖尿病大腸癌 糖尿病肝癌對糖尿病無肝癌 糖尿病有癌症對糖尿病無癌症 P P P P mir-122 122-5p 2.50e-05 ± 3.54e-06 2.58e-05 ± 3.84e-06 7.67e-05 ± 1.30e-05 < 0.0001 0.0002 0.0434 0.0002 0.0014 mir-92a 92a-3p 3.01e-05 ± 3.04e-06 3.10e-05 ± 3.41e-06 4.47e-05 ± 5.83e-06 0.0267 0.0280 0.0002 0.0243 0.1223 mir-486 486-5p 2.65e-05 ± 3.60e-06 2.83e-05 ± 4.16e-06 4.14e-05 ± 6.03e-06 0.0598 0.0347 0.0761 0.0330 0.1325 mir-4532 4.60e-04 ± 1.13e-04 7.32e-04 ± 2.46e-04 1.33e-03 ± 3.80e-04 0.0226 0.0297 0.1871 0.0546 0.0291 血清 microrna 水平為標準化後相對數值, 以 Mean ±SEM 表示 12