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1 Yearbook of Chinese Medicine and Pharmacy, 23(6), ,2005 中 醫 藥 年 報 第 23 期 第 6 冊 編 號 :CCMP93-CT-107 補 中 益 氣 湯 抑 制 多 種 惡 性 細 胞 腫 瘤 生 長 機 轉 的 體 外 細 胞 與 肺 氣 虛 老 鼠 模 型 之 先 驅 研 究 沈 建 忠 長 庚 大 學 中 醫 系 摘 要 本 試 驗 主 要 目 的 為, 補 中 益 氣 湯 BZYQT 抗 腫 瘤 細 胞 株 在 實 驗 室 的 篩 檢 ; 建 立 氣 虛 動 物 模 型 ; 肺 癌 腫 瘤 細 胞 在 氣 虛 動 物 模 型 的 實 驗 ; 補 中 益 氣 湯 對 肺 癌 腫 瘤 的 動 物 療 效 試 驗 本 計 劃 發 現 補 中 益 氣 湯 可 以 抑 制 鼻 咽 癌 腎 細 胞 癌 及 肺 癌 細 胞 株 的 生 長 BABL/C 小 鼠 游 泳 五 日 後 接 種 肺 癌 細 胞 株 於 後 腿 肌 肉 接 種 十 日 後 可 觀 察 到 小 鼠 接 種 處 開 始 有 5mm 腫 塊 出 現, 再 隔 十 日 腫 塊 加 速 生 長, 約 50 天 後 小 鼠 即 陸 續 死 亡, 腫 瘤 會 轉 移 至 肺 臟 心 臟 肝 臟 和 腦 研 究 發 現 補 中 益 氣 湯 可 以 讓 氣 虛 小 鼠 肺 癌 生 長 減 緩 延 長 存 活 期 將 來 可 利 用 本 計 劃 之 結 果 再 進 行 補 中 益 氣 湯 預 防 肺 癌 及 治 療 鼻 咽 癌 腎 細 胞 癌 和 其 他 腫 瘤 生 長 的 實 驗 關 鍵 詞 : 補 中 益 氣 湯 氣 虛 動 物 模 型 肺 癌
2 Number : CCMP93-CT-107 BU ZHONG YI QI TANG(BZYQT) inhibits some tumors growth and pilot study to assess the mechanism of BZYQT in vitro cell lines and Qi vacuity mice model Jiann-Jong Shen School of Traditional Chinese Medicine, Chang Gung University ABSTRACT The objectives of this project are: to screen for anticancer activity of BZYQT on established cancer cell lines, to establish Qi vacuity animal model, to develop a lung cancer model of Qi vacuity model, and to treat the Qi vacuity mice with BZYQT. This study found that BZYQT were able to inhibit the growth of NPC, lung cancer and renal cell carcinoma cell lines in vitro. After swimming for five days BALB/c mice were inoculated with Line-1 lung cancer cells at the hind leg intramuscularly. Ten days after inoculation tumor mass could be observed at the injection site. Tumor grew rapidly in 10 days. Mice became moribund and dead at 50th days. Tumor metastases were observed in the lung, liver, heart and brain. We also found that tumor growth was delayed after treatment with BZYQT. The survival of the tumor-bearing mice were prolonged. In the future we may study the effect of BZYQT on the prevention of lung cancer as well as treatment for NPC, RCC and other malignancies. Keywords: BZYQT, Qi vacuity animal model, lung cancer
3 壹 前 言 最 近 我 們 發 現 BZYQT 不 僅 可 以 提 昇 免 疫 力, 刺 激 T 細 胞 生 長, 更 有 抑 制 腫 瘤 生 長 的 效 果 藉 此 測 驗, 我 們 驗 證 中 藥 方 劑 BZYQT, 是 否 對 其 他 上 皮 癌 症 的 治 療 有 效 隨 著 分 子 生 物 學 技 術 的 進 展 與 應 用, 近 年 來 一 些 研 究 表 明, 多 種 化 療 藥 物 可 以 誘 導 腫 瘤 細 胞 凋 亡 我 們 已 有 能 力 於 實 驗 室 中, 培 養 不 同 種 類 腫 瘤 細 胞, 來 測 量 腫 瘤 的 藥 物 敏 感 度 本 研 究 應 用 MTT 比 色 方 法 及 流 式 細 胞 術 (FCM) 分 析, 探 討 臨 床 常 用 的 藥 物 補 中 益 氣 湯 對 人 鼻 咽 癌 細 胞 B16 細 胞 株 RCC 細 胞 株 體 外 細 胞 增 殖 抑 制 和 凋 亡 的 誘 導 作 用 研 究 BZYQT 抗 癌 藥 物 是 否 對 其 他 的 癌 細 胞 增 殖 有 明 顯 抑 制 作 用, 並 且 是 否 可 以 誘 導 其 細 胞 凋, 也 是 本 研 究 探 討 的 重 點 利 用 MTT 法 RCM 檢 測 細 胞 增 長 抑 制 率 及 凋 亡 指 數 有 助 於 化 療 方 案 的 設 計 並 指 導 臨 床 合 理 用 藥 近 年 研 究 發 現, 中 醫 虛 証 的 發 生 與 超 氧 化 物 SOD 的 活 性 下 降 有 著 密 切 的 關 系, 而 虛 損 及 夾 瘀 的 程 度 越 重,SOD 的 活 性 就 越 低 本 實 驗 發 現, 造 模 組 SOD 活 性 明 顯 降 低 (P< 0.05), 肝 LPO 和 心 肌 Li P 含 量 有 增 高 趨 勢, 表 明 氣 虛 血 瘀 自 由 基 代 謝 異 常, 主 要 表 現 為 SOD 活 性 降 低, 這 與 自 由 基 衰 老 學 說 相 符, 本 結 果 提 示, 氣 虛 血 瘀 証 的 出 現 預 示 著 機 體 衰 老 亡 結 開 始 近 年 來 氣 虛 血 瘀 在 衰 老 過 程 中 的 作 用 倍 受 重 視, 顏 氏 明 確 指 出 : 氣 虛 血 瘀 是 機 體 衰 老 的 主 要 機 中 年 是 機 體 衰 老 過 程 的 重 要 階 段, 故 中 年 小 鼠 氣 虛 血 瘀 証 動 物 模 型 的 建 立, 對 中 年 保 健 及 抗 衰 老 研 究 有 重 大 的 意 義 免 疫 功 能 下 降 機 體 免 疫 功 能 的 改 變 被 視 為 衰 老 的 前 驟, 研 究 表 明, 機 體 在 衰 老 過 程 中, 細 胞 免 疫 功 能 隨 增 齡 而 持 續 下 降, 老 人 細 胞 免 疫 能 力 改 變 是 機 體 免 疫 功 能 減 退 的 主 要 表 現, 中 醫 在 抗 衰 老 研 究 中 認 為, 各 種 虛 証 的 發 生 與 衰 老 有 10 關, 細 胞 免 疫 功 能 的 低 下 可 能 是 虛 証 一 個 共 性 表 現, 對 虛 証 有 定 性 意 義 C57BL/6 小 鼠 黑 色 素 瘤 B16 細 胞 株 在 ICR 小 鼠 腫 瘤 模 型 的 建 立 的 研 究 顯 示, 在 白 色 ICR 小 鼠 建 立 B16 細 胞 株 黑 色 素 瘤 模 型, 以 便 於 接 種 測 量 和 觀 察, 既 能 降 低 研 究 成 本, 又 能 滿 足 不 同 實 驗 目 的 要 求 方 法 : 將 B16 細 胞 株 黑 色 素 瘤 對 數 生 長 期 細 胞 接 種 於 ICR 小 鼠 足 墊 皮 下 腹 腔 和 尾 靜 脈 等 部 位, 建 立 移 植 瘤 模 型 和 肺 部 轉 移 瘤 模 型 觀 察 小 鼠 成 瘤 特 點, 並 作 病 理 和 免 疫 組 化 染 色 檢 查, 分 析 接 種 細 胞 數 與 腫 瘤 生 成 的 關 系 以 及 腫 瘤 生 長 對 小 鼠 生 活 狀 態 和 生 存 時 間 的 影 響 結 論 :B16 細 胞 株 黑 色 素 瘤 在 ICR 小 鼠 具 有 成 瘤 率 高 觀 察 和 測 量 方 便 費 用 低 等 優 點,ICR 小 鼠 B16 細 胞 株 黑 色 素 瘤 模 型 是 較 為 實 用 的 腫 瘤 模 型
4 我 們 認 為 氣 虛 型 小 鼠 (BALB/c 小 鼠 )Qi vacuity(qv) 肺 癌 模 型 可 能 比 較 有 希 望 符 合 第 4 期 惡 性 腫 瘤 表 現, 腫 瘤 模 型 對 研 究 腫 瘤 的 病 因 發 病 機 制 抗 癌 藥 物 篩 選 及 腫 瘤 防 治 等 具 有 非 常 重 要 的 意 義 移 植 性 腫 瘤 模 型 是 目 前 抗 癌 藥 物 和 藥 效 學 研 究 中 使 用 最 多 的 一 類 動 物 腫 瘤 模 型 18 說 明 腫 瘤 動 物 模 型 在 基 礎 研 究 上 佔 有 一 席 地 位, 本 研 究 需 建 立 惡 性 轉 移 肺 癌 的 動 物 模 型, 並 作 為 評 估 中 藥 藥 物 的 效 果 綜 合 上 述, 及 我 們 初 步 的 實 驗 數 據 及 臨 床 經 驗, 我 們 將 以 科 學 化 的 肺 腫 瘤 細 胞 株 動 物 模 型, 進 行 中 藥 方 劑 BZYQT 對 國 人 重 要 疾 病 之 療 效 副 作 用 等 知 比 較 評 估, 並 找 出 指 標 性 評 估 項 目 或 條 件, 因 此 希 望 藉 由 基 礎 研 究 細 胞 株 與 動 物 試 驗 印 證 希 望 能 達 成 推 動 中 草 藥 產 品 的 補 中 益 氣 湯 走 上 國 際 市 場, 並 且 符 合 國 際 規 範 要 求, 完 成 中 醫 證 型 模 式 動 物 ( 注 今 年 申 請 研 究 項 目 ) 與 人 體 療 效 評 估 ( 注 去 年 研 究 項 目 ), 以 及 藥 物 試 驗 貳 材 料 與 方 法 一 實 驗 室 部 分 ( 非 活 體 試 驗 ) 補 中 益 氣 湯 (BZYQT) 抗 腫 瘤 細 胞 株 在 實 驗 室 的 篩 檢 採 用 方 法 如 下 : 1. 利 用 MTT 法 檢 測 細 胞 增 生 情 形 : 針 對 人 體 腎 細 胞 癌 (HH244) 鼻 咽 癌 (NPC-076) 以 及 小 鼠 肺 癌 (Line-1) 等 細 胞 株 做 篩 檢, 分 別 檢 測 BZYQT 對 其 生 長 的 影 響 每 一 種 細 胞 株 先 以 /0.5ml 濃 度 加 入 96 複 孔 盤, 待 於 培 養 箱 培 養 24 小 時 後, 再 個 別 加 入 五 個 不 同 濃 度 的 BZYQT(20mg/ml 10mg/ml 5mg/ml 2.5mg/ml 和 0.625mg/ml) 反 應 48 小 時, 之 後, 移 除 原 先 的 細 胞 培 養 液, 再 加 入 0.25mg/ml 的 MTT 於 每 個 複 孔 中, 放 置 3.5 小 時 後 再 利 用 ELISA 判 讀 機 判 讀 2. 3 H-Thymidine 檢 測 細 胞 增 生 情 形 : 用 96 孔 盤 檢 測 肺 癌 Line-1 細 胞 株 和 黑 色 素 細 胞 瘤 MS-1 細 胞 株 每 一 株 以 /0.1ml 加 入 三 或 四 個 複 孔 中, 再 加 入 0.1ml 不 同 濃 度 的 BZYQT(5mg/ml 2.5mg/ml 1.25mg/ml 0.625mg/ml mg/ml 和 mg/m) 共 兩 盤, 分 別 在 反 應 48 小 時 及 72 小 時 後 加 入 H-Thymidine 再 反 應 6~8 小 時, 再 用 儀 器 判 讀 數 值
5 3. 利 用 細 胞 凋 零 檢 驗 試 劑 組 偵 測 細 胞 凋 零 現 象 : 採 用 NPC-076 MS-1 及 Line-1 等 細 胞 株 ; 每 株 細 胞 取 /ml 加 入 6 孔 盤 中, 一 株 細 胞 設 計 3 個 複 孔 經 過 24 小 時, 加 入 不 同 濃 度 BZYQT (1mg/ml 及 10mg/ml) 於 其 中 在 反 應 48 小 時 後, 將 所 有 細 胞 收 集 於 流 式 細 胞 儀 專 用 試 管 中, 再 以 細 胞 凋 零 檢 驗 試 劑 組 偵 測 細 胞 凋 零 現 象, 並 用 流 式 細 胞 儀 判 讀 結 果 二 動 物 實 驗 部 分 ( 活 體 試 驗 ) 1. 建 立 氣 虛 (QV) 動 物 模 型 (BALB/c 小 鼠 ): 首 先 對 尚 未 游 泳 的 BABL/C 小 鼠 採 血, 休 息 兩 天 後 再 以 三 種 水 溫 (15 20 及 2 6 ) 讓 小 鼠 游 泳 直 到 小 鼠 無 力 快 要 喝 到 水 為 止, 撈 起 小 鼠, 計 算 游 泳 時 間 與 觀 察 小 鼠 結 束 游 泳 後 體 重 ; 共 觀 察 五 日 第 五 日 時, 在 游 泳 完 後 再 採 血, 之 後 再 ELISA 測 量 小 鼠 血 清 游 泳 前 後 IgG 的 變 化 2. 建 立 肺 癌 (lung adenocarcinoma) 在 氣 虛 動 物 模 型 的 實 驗 : BABL/C 小 鼠 在 水 溫 小 於 室 溫 五 度 下 游 泳 五 日 在 第 五 日 時, 接 種 小 鼠 肺 癌 細 胞 株 L ine-1( 濃 度 1x104/ml) 於 後 腿 肌 肉 每 日 觀 察 小 鼠 接 種 處 腫 塊 大 小 變 化, 當 小 鼠 死 亡 ( 約 50 days) 時, 取 出 其 肺 臟 心 臟 肝 臟 和 腦, 觀 察 小 鼠 的 肺 癌 轉 移 情 形, 並 做 石 蠟 包 埋 及 H&E 染 色 觀 察 ) 3. 補 中 益 氣 湯 對 肺 癌 腫 瘤 的 動 物 療 效 試 驗 : 在 小 鼠 氣 虛 模 型 建 立 後, 當 小 鼠 腫 塊 長 50mm 3 時, 先 將 小 鼠 分 成 三 組, 每 組 各 六 隻 ( 腹 腔 注 射 口 服 投 藥 與 對 照 組 ), 分 別 餵 食 和 注 射 BZYQT 於 小 鼠 的 濃 度 為 1.25mg/ml 每 日 餵 食 小 鼠 0.1ml 的 BZYQT 和 每 隔 四 日 腹 腔 注 射 0.1ml 的 BZYQT 一 次 觀 察 其 腫 瘤 大 小 及 體 重 變 化, 並 記 錄 小 鼠 的 存 活 期
6 參 結 果 一 實 驗 室 部 分 ( 非 活 體 試 驗 ): 補 中 益 氣 湯 (BZYQT) 抗 腫 瘤 細 胞 株 在 實 驗 室 的 篩 檢, 先 培 養 各 種 癌 細 胞 株 於 96 孔 盤 中 培 養 24 小 時 後, 加 入 不 同 濃 度 的 BZYQT 反 應 48 小 時, 最 後 以 MTT 比 色 法 檢 測 補 中 益 氣 湯 抑 制 癌 細 胞 株 生 長 情 形 結 果 BZYQT 具 有 明 顯 (p<0.05) 抗 腎 細 胞 癌 ( 如 圖 一 ) 鼻 咽 癌 ( 如 圖 二 ) 肺 癌 細 胞 株 ( 如 圖 三 ) 的 效 果 H-Thymidine uptake 實 驗 也 顯 示 BZYQT 對 黑 色 細 胞 瘤 ( 如 圖 四 ) 和 肺 癌 細 胞 株 ( 如 圖 五 ) 的 明 顯 抑 制 癌 細 胞 株 生 長 效 果 (p<0.05) 另 外, 在 細 胞 凋 零 的 研 究 初 步 發 現, 經 BZYQT 處 理 後 的 黑 色 素 細 胞 瘤, 細 胞 凋 零 百 分 比 最 高 為 對 照 組 的 2.7 倍, 且 與 BZYQT 的 濃 度 有 關,1mg/ml 以 及 10 mg/ml BZYQT 對 黑 色 素 細 胞 瘤 誘 發 產 生 細 胞 凋 零 的 分 別 11.48% 以 及 24.25%, 而 對 照 組 僅 8.97% 然 而 此 現 象 並 未 表 現 於 肺 癌 細 胞 株 ( 如 圖 六 ) 二 實 驗 動 物 部 分 ( 活 體 試 驗 ): 1. 建 立 氣 虛 動 物 模 型 (BALB/c 小 鼠 ): 小 鼠 分 成 三 組, 每 組 2 隻 每 日 於 不 同 溫 度 (15 20 及 26 ) 的 水 中 游 泳, 至 小 鼠 筋 疲 力 竭 ( 即 小 鼠 沉 入 水 中 ) 時, 撈 到 保 溫 箱 中, 紀 錄 從 下 水 游 泳 到 沉 下 去 的 時 間 ( 如 圖 七 ), 觀 察 小 鼠 的 毛 色 活 動 力 及 體 重 的 變 化, 連 續 五 日 結 果 發 現 小 鼠 在 及 26 水 中 會 產 生 體 重 下 降, 毛 色 雜 亂, 游 泳 耐 受 時 間 日 漸 縮 短 然 這 些 變 化 在 20 及 26 時 較 不 明 顯 另 外, 結 果 除 了 15 組 之 外, 小 鼠 於 20 及 26 游 泳 後, 其 血 清 中 IgG 的 濃 度 確 實 如 預 期 明 顯 下 降 (p<0.05)( 如 圖 八 ) 2. 肺 癌 腫 瘤 細 胞 (lung adenocarcinoma) 在 氣 虛 動 物 模 型 實 驗 : 肺 癌 細 胞 株 Line-1 接 種 於 氣 虛 小 鼠 ( 即 於 水 溫 低 於 室 溫 五 度 下 游 泳 五 日 後 之 小 鼠 ) 後 腿 肌 肉, 接 種 十 日 後 可 觀 察 到 小 鼠 接 種 處 開 始 有 直 徑 5mm 腫 塊 出 現, 再 隔 十 日 腫 塊 加 速 生 長, 約 50 天 後 小 鼠 即 陸 續 死 亡, 腫 瘤 會 轉 移 至 肺 心 臟 腦 和 肝 臟, 以 石 蠟 包 埋 處 理 並 做 H&E 染 色 後 觀 察 ( 如 圖 九 及 圖 十 ) 3. 補 中 益 氣 湯 對 肺 癌 腫 瘤 的 動 物 療 效 試 驗 : 氣 虛 小 鼠 肺 癌 模 型 經 接 受 BZYQT 治 療 方 面, 腹 腔 注 射 (n=3) 治 療 後 腫 瘤 生 長 比 對 照 組 (n=3) 平 均 稍 慢, 但 未 達 統 計 效 力 (p>0.05) 口 服 (n=4) 治 療 後 腫 瘤 生 長 比 對 照 組 (n=4) 平 均 稍 慢, 但 未 達 統 計 效 力 (p>0.05) 經 實 驗 後 發 現 腹 腔 注 射 組 腫 瘤
7 生 長 較 對 照 組 稍 慢 ( 如 圖 十 一 ) 口 服 組 較 對 照 組 生 長 稍 慢 ( 如 圖 十 二 ), 然 均 未 達 統 計 標 準 (p>0.05) 治 療 組 與 對 照 組 體 重 變 化 無 明 顯 差 別 (p>0.05)( 如 圖 十 三 ) 但 是 兩 組 治 療 後 存 活 期 均 較 對 照 組 延 長 (p=0.0007)( 如 圖 十 四 ) 肆 討 論 在 實 驗 室 方 面, 發 現 人 類 腎 細 胞 癌 鼻 咽 癌 及 小 鼠 肺 癌 細 胞 株 在 MTT 檢 測 中 細 胞 增 生 皆 有 受 到 BZYQT 的 抑 制 現 象 ( 如 圖 一 圖 二 和 圖 三 ), 而 用 3 H-thymidine 檢 測 時, 黑 色 素 細 胞 瘤 和 肺 癌 細 胞 瘤 也 受 到 BZYQT 抑 制 其 細 胞 增 生 ( 如 圖 四 和 圖 五 ) 由 細 胞 凋 零 研 究, 觀 察 到 BZYQT 可 誘 發 黑 色 素 細 胞 瘤 進 行 細 胞 凋 零, 且 與 BZYQT 的 濃 度 有 關, 因 此 推 論 BZYQT 的 抑 癌 機 轉 可 能 經 由 誘 發 細 胞 凋 零 而 產 生, 然 而 細 胞 凋 零 現 象 在 小 鼠 肺 癌 細 胞 株 Line-1 卻 未 發 生, 因 此 BZYQT 對 小 鼠 肺 癌 細 胞 株 的 抑 制 機 轉 仍 待 進 一 步 探 討 在 動 物 實 驗 部 分, 氣 虛 模 型 建 立 時 發 現 小 鼠 游 泳 後, 血 清 中 IgG 濃 度 確 實 下 降, 符 合 龐 樹 玲 高 金 亮 等 人 在 大 鼠 實 驗 中 的 結 論 相 同 (11), 但 是 我 們 卻 意 外 發 現 在 過 度 低 溫 時 (15 ),IgG 濃 度 反 而 上 升 是 否 因 極 度 寒 冷 疲 累 時 誘 發 腎 上 腺 素 或 其 他 細 胞 素 的 分 泌 而 導 致 IgG 濃 度 上 升 仍 需 近 一 步 研 究 證 實 治 療 肺 癌 氣 虛 小 鼠 時, 為 減 少 個 人 主 觀 判 斷 誤 差 ; 所 以 測 量 小 鼠 腫 瘤 大 小 時, 除 操 作 者 外, 另 有 一 人 在 場 一 起 測 量 為 增 加 客 觀 性, 將 來 可 用 小 鼠 電 腦 斷 層 或 正 子 葡 萄 糖 攝 影 來 做 測 量 補 中 益 氣 湯 對 於 小 鼠 肺 癌 治 療 的 療 效 部 分, 可 延 長 存 活 期 (p=0.0007), 此 種 效 果 可 能 與 小 鼠 體 內 的 N K LAK 細 胞 活 性 增 加 有 關 因 為 去 年 我 們 曾 經 證 實 BZYQT 在 試 管 內 具 有 增 加 NK LAK 細 胞 活 性, 給 予 黑 色 素 瘤 患 者 服 用 後 其 體 內 NK LAK 細 胞 活 性 也 增 加 我 們 已 收 集 小 鼠 的 脾 臟 細 胞, 若 有 機 會 將 繼 續 探 討 研 究 BZYQT 對 活 體 免 疫 細 胞 功 能 的 影 響
8 伍 結 論 與 建 議 此 一 小 規 模 研 究 發 現 補 中 益 氣 湯 可 以 抑 制 鼻 咽 癌 腎 細 胞 癌 及 肺 癌 細 胞 株 的 生 長 而 且 補 中 益 氣 湯 具 有 誘 導 黑 色 素 細 胞 瘤 細 胞 株 及 鼻 咽 癌 細 胞 株 產 生 細 胞 凋 零 現 象, 但 是 在 小 鼠 肺 癌 細 胞 株 則 無 另 外, 補 中 益 氣 湯 治 療 肺 癌 氣 虛 小 鼠 時, 皆 出 現 肺 癌 生 長 減 緩 維 持 體 重 及 延 長 存 活 期 的 現 象 本 計 劃 之 實 驗 動 物 數 目 屬 小 族 群, 統 計 稍 嫌 不 足, 但 由 初 步 結 果 顯 示, 仍 可 歸 納 出 BZYQT 具 有 抑 癌 功 效, 未 來 可 考 慮 繼 續 申 請 計 劃, 完 成 具 體 結 果, 相 信 可 以 提 供 未 來 癌 症 新 療 法 的 參 考 指 標 之 一, 期 望 造 福 更 多 癌 症 患 者 誌 謝 本 研 究 計 畫 承 蒙 行 政 院 衛 生 署 中 醫 藥 委 員 會, 計 畫 編 號 CCMP93-CT-107 提 供 經 費 贊 助, 使 本 計 畫 得 以 順 利 完 成, 特 此 誌 謝
9 陸 參 考 文 獻 1. Ishihara K, Saida T, Yamamoto A: Nationwide survey of malignant melanoma ( ). Skin Cancer (japan) 15:7-14, Seiji M, Takahashi M: Acral melanoma in Japan. Human Pathology 13(7): 607-9, DeVita, Hellman, Rosenberg: Cancer principal and practise of oncology, 6th edition, Philadelphia, 2001: p DeVita, Hellman, Rosenberg: Cancer principal and practise of oncology, 6th edition, Philadelphia, 2001: p John WC Chang, Hsieh-Fong Chiang, Chi-Shin Yang, Kun-Yub Yeh, Cheng-Hsu Wang, Tsai-Shen Yang, Fu-Chan Wei: Malignant melanoma in Taiwan: A metaanalysis of 422 cases. 第 七 屆 台 灣 癌 症 聯 合 學 術 年 會 May 4, 2002 ~ May 5, 2002, p Eton O, Legha SS, Bedikian AY, et al: Sequential biochemotherapy versus chemotherapy for metastatic melanoma: results from a phase III randomized trial. J Clin Oncol 20: , 淩 卓 瑩 李 佳 荃 淩 鴻 英, 補 中 益 氣 湯 對 細 胞 抗 腫 瘤 活 性 的 加 強 作 用 8. 鄭 文 龍, 中 藥 方 劑 的 藥 理 與 應 用, 第 一 版, 重 慶, 重 慶 出 版 社 1990: , 梁 嶸, 日 本 對 外 補 中 益 氣 湯 的 應 用 與 研 究 日 本 醫 學 介 紹 1991: (8): 陳 惠 新, 許 岸 高 黃 參 方 劑 誘 導 胃 癌 癌 前 病 變 細 胞 凋 亡 和 影 響 BCL-2 蛋 白 表 達 的 研 究 廣 州 醫 藥,2000 年 第 31 卷 第 6 期 11. 龐 樹 玲 高 金 亮, 中 年 大 鼠 氣 虛 血 瘀 証 的 模 擬 及 其 機 制 探 討 天 津 市 中 醫 藥 研 究 院,1997 年 9 月 第 1 6 卷 第 3 期 12. 李 桂 圓 陳 龍 邦,C57BL6 小 鼠 黑 色 素 瘤 B16 細 胞 株 在 ICR 小 鼠 腫 瘤 模 型 的 建 立 醫 學 研 究 生 學 報,2003 年 4 月 13. 田 維 毅 周 愛 麗 劉 燕, 脾 虛 証 ", 大 鼠 模 型 紅 細 胞 免 疫 功 能 的 探 討 貴 陽 中 醫 學 院 學 報,1999 年 6 月 14. 李 傳 英 等, 脾 虛 泄 瀉 証 動 物 模 型 的 研 究 浙 江 中 醫 雜 志,1982,(8):
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