中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2013, 35(8): DOI: /cjcb 临床细胞生物学 Oct4 在乳腺癌组织中的表达及其对乳腺癌细胞侵袭

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1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 201, 5(8): DOI: /cjcb 临床细胞生物学 Oct4 在乳腺癌组织中的表达及其对乳腺癌细胞侵袭性的影响曹勇 1 张蕴蕴 2 谢佳 1 曾晓华吴诚义 1* ( 1 重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科, 重庆 ; 2 重庆医科大学附属第一医院肿瘤内科, 重庆 ; 重庆市肿瘤研究所, 重庆 40000) 摘要探讨转录因子 Oct4(octamer-binding transcription factor 4) 在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌细胞侵袭性的影响该研究选取 27 例乳腺癌组织病人的肿瘤组织及癌旁组织, 通过 Western blot 方法检测 Oct4 的蛋白水平通过慢病毒介导的是 shrna 干扰技术靶向沉默 oct4 基因的表达, Western blot 方法验证 oct4 基因沉默效果细胞划痕实验和细胞侵袭实验检测 oct4 沉默对细胞迁移及侵袭能力的影响 Western blot 检测 oct4 沉默对上皮间质转化 (EMT) 的多个标志物的影响结果显示, 74% 病人 (20/27) 中 Oct4 蛋白在乳腺癌组织的表达显著高于癌旁组织慢病毒介导的 shrna 能显著抑制细胞 Oct4 蛋白的水平 oct4 基因沉默能抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力 oct4 沉默后上皮细胞标志物 E-cadhrin alpha-catenin 明显上调 ; 而间质细胞标志物 vimentin N-cadherin 则明显下降以上结果表明, Oct4 蛋白在乳腺癌组织的表达明显增高 ; oct4 沉默可以显著抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭关键词乳腺癌 ; 肿瘤细胞系 ; 肿瘤侵袭 ; Oct4 Expression of Oct4 in Breast Cancer Tissue and Its Effect on Cell Invasion of Breast Cancer Cao Yong 1, Zhang Yunyun 2, Xie Jia 1, Zeng Xiaohua, Wu Chengyi 1 * ( 1 Department of Endocrine Surgeons, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing , China; 2 Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing , China; Chongqing Cancer Institute, Chongqing 40000, China) Abstract This paper examined the expression level of Oct4 in breast cancer tissue and further investigate its effect on cell invasion of breast cancer. Western blot analysis was used to detect the protein level of Oct4 in 27 paired breast cancer tissue and adjacent non-tumoral breast tissue. Oct4 expression in breast cancer cells was knockdown by lentivirus-mediated shrna interference technology. The effect of oct4 silencing on the cell invasion was determined by wound-healing assay and cell invasion assay. Four EMT markers (E-cadhrin, alpha-catenin, vimen- 收稿日期 : 接受日期 : 重庆市科委攻关计划 ( 批准号 : CSTC2011AC5189) 资助的课题 * 通讯作者 Tel: , @qq.com Received: April 15, 201 Accepted: May 14, 201 This work was supported by the Key Projects of Chongqing Science and Technology Commission (Grant No.CSTC2011AC5189) *Corresponding author. Tel: , @qq.com 网络出版时间 : :0 URL:

2 1162 临床细胞生物学 tin and N-cadherin) were analyzed by Western blot analysis. The results demonstrated that 74% (20/27) patients showed elevated Oct4 expression in breast cancer tissue compared with that in adjacent non-tumoral breast tissue. Lentivirus-mediated shrna significantly suppressed Oct4 expression. Gene silencing of oct4 markedly inhibited invasion of breast cancer cells. Knockdown of oct4 in breast cancer cells induced the expression of epithelial markers E-cadherin and α-catenin that was accompanied by a concomitant reduction of mesenchymal marker N-cadherin and vimentin. These finding suggested that Oct4 expression was upregualted in breast cancer tissue. Gene silencing of oct4 inhibited cell invasion of breast cancer through regulating EMT. Key words breast cancer; breast cancer cell line; cell invasion; Oct4 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤, 近年来有发病年轻及发病率上升的趋势, 严重威胁着女性的健康乳腺癌后期出现的全身系统性的转移是导致患者死亡的主要原因, 也是目前临床治疗的瓶颈因此, 研究乳腺癌细胞的侵袭与转移, 是目前乳腺癌研究领域的热点之一 Oct4 是一种在全能性胚胎细胞中表达的转录 [1] 因子, 也是参与调控胚胎干细胞自我更新和维持 [2] 其全能性的最为重要的转录因子之一表达 Oct4 的细胞是具有潜在多能性的干细胞, 这些细胞可能 [-4] 是引发肿瘤发生的靶细胞目前已有研究报道, Oct4 在调控乳腺癌细胞的增值及凋亡中发挥着重要 [5] 作用, 然而关于其在肿瘤侵袭及迁移中的作用的报道还非常少本研究检测了 Oct4 在肿瘤组织中的表达, 并将表达靶向 Oct4 的慢病毒感染乳腺癌细胞, 观察 Oct4 沉默对肿瘤细胞侵袭及迁移的影响 1 材料与方法 1.1 材料乳腺癌细胞系 MD-MBA-21 购自 ATCC(American Type Culture Collection) 公司 ; 表达针对 Oct4 及对照 shrna 的慢病毒质粒载体 plko.1-puro 来自 Sigma-Aldrich 公司 ; 慢病毒包被质粒 plp1 plp2 和 plp/vsvg 来自于 Invitrogen 公司生产的 BLOCK-iT Lentiviral RNAi Expression System; Oct4 的一抗 (#2750) 购自 Cell Signaling Technology 公司 ; β-actin(a516) 购 Sigma-Aldrich; E-cadherin(BS1098) α-catenin(bs2040) N-cadherin(BS2224) Vimentin(BS182) 购自 Bioworld 公司 ; 辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP) 标记的驴抗兔 IgG 抗体购自 GE healthcare 公司 ; BioCoat TM Matrigel TM Invasion Chamber(#54480) 购自 BD 公司 1.2 标本及处理收集重庆市肿瘤医院 2008 年 1 月 ~2009 年 12 月乳腺癌手术切除标本 27 例, 患者均为女性, 术前未行放化疗将冰冻乳腺癌组织破碎后提取总蛋白 1. 细胞培养 MD-MBA-21 细胞培养于含 10% 胎牛血清 100 U/mL 青霉素 100 μg/ml 的 DMEM 培养基中, 在含 5% CO 2 7 C 孵箱中常规培养 1.4 Western blot 方法裂解细胞后提取细胞的总蛋白后用 BCA 法测定蛋白浓度取等量 (50 μg) 蛋白上样, 于 10% 的 SDS-PAGE 胶中分离蛋白后, 以 90 V 电转膜 4 h 转膜好的 NC 膜用 5% 脱脂奶粉封闭 1 h, 一抗 4 C 孵育摇床过夜, TBST 洗膜, 洗次 ( 每次 5 min), 二抗 (1: 000 稀释 ) 室温孵育 2 h, 用 TBST 洗膜后, ECL 显影, 以 β-actin 为内参 1.5 慢病毒介导的 RNA 干扰技术将 plp1 plp2 pvsvg 及表达靶向 Oct4 shrna 的质粒或对照 shrna 经过磷酸钙转染法共转染 HEK29T 细胞, 使细胞分泌高滴度的靶向 Oct4 shrna 的慢病毒和表达对照 shrna 的慢病毒作为对照按照优化的感染条件将慢病毒感染生长状态良好的 MD-MBA-21 细胞接种细胞到 6 孔细胞板, 置于 7 C 5% CO 2 培养箱培养, 当细胞密度约 70% 时, 用含有 8 g/ml 聚凝胺和 2% FBS 的细胞培养液稀释到相应滴度的病毒液进行感染 1.6 细胞划痕实验接种细胞到 6 孔细胞板中, 每孔接种数为过夜培养后, 用枪头尽量垂直的划细胞 PBS 洗次后加入无血清的培养基, 20 h 后取样, 拍照 1.7 细胞侵袭实验将包被 Matrigel 的小室放入 24 孔板中, 并于小室中加入 DMEM 培养基, 置于 7 C 5% CO 2 培养箱培养 2 h 将细胞悬液( ) 加入小室内侧, 并于小室外侧加入培养基 ( 含 5% FBS) 将 24 孔板置于 7 C

曹勇等 : Oct4 在乳腺癌组织中的表达及其对乳腺癌细胞侵袭性的影响 116 表 1 27 例乳腺癌病例资料 Tabel 1 The clinical data of 27 patients with breast cancer 年龄 Age 单纯癌 Carcinoma simplex 硬癌 Scirrhoous arcinoma 浸润性导管癌 Breast invasive ductal

h 后, 固定细胞后用 0.1% 结晶紫染色 1.8 统计学分析数据以 x _ ±s 形式表示, 采用 SPSS 11.0 统计软件进行统计学处理, 两样本均数比较用配对 t-test 分析, P<0.05 为差异具有统计学意义 2 结果 2.

3 曹勇等 : Oct4 在乳腺癌组织中的表达及其对乳腺癌细胞侵袭性的影响 116 表 1 27 例乳腺癌病例资料 Tabel 1 The clinical data of 27 patients with breast cancer 年龄 Age 单纯癌 Carcinoma simplex 硬癌 Scirrhoous arcinoma 浸润性导管癌 Breast invasive ductal 侵润性小叶癌 Invasive lobular 髓样癌 Medullary carcinoma 总计 Total carcinoma carcinoma 0~ ~ ~ ~ ~ Total % CO 2 培养箱培养 22 h 后, 固定细胞后用 0.1% 结晶紫染色 1.8 统计学分析数据以 x _ ±s 形式表示, 采用 SPSS 11.0 统计软件进行统计学处理, 两样本均数比较用配对 t-test 分析, P<0.05 为差异具有统计学意义 2 结果 2.1 乳腺癌组织和癌旁组织中 Oct4 蛋白的表达水平提取 27 位乳腺癌病人的肿瘤组织和癌旁组织中的总蛋白 ( 病人资料见表 1), 通过 Western blot 方法, 我们发现 20 位 (74%) 病人肿瘤组织中 Oct4 的蛋白水平显著高于癌旁组织 ( 图 1) 以上结果显示, Oct4 在乳腺癌组织中表达明显上调, 提示 Oct4 可能参与了乳腺癌的发生发展过程 2.2 Western blot 检测慢病毒介导的 RNA 干扰技术效果在乳腺癌细胞 MD-MBA-21 感染表达 shrna- Oct4 或 shrna-control 慢病毒, 转染 72 h 后提取细胞总蛋白进行 Western blot 检测结果显示, shrna- Oct4 显著降低 Oct4 蛋白的表达, 成功地沉默了乳腺癌细胞中 oct4 基因的表达, 为下游实验打下了良好的实验基础 ( 图 2) 2. Oct4 沉默对乳腺癌细胞体外侵袭能力的影响为了进一步研究 Oct4 对乳腺癌细胞表型的影响, 我们选择了具有侵袭性的乳腺癌细胞 MD- MBA-21 作为细胞模型细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法通过细胞划痕实验, 我们发现划痕后 20 h 后, oct4 基因沉默的肿瘤细胞的转移能力显著降低, 划痕愈合较慢 ( 图 ) 为了进一 1 2 Oct4 β-catin 1-27: 病人号码 ; T: 乳腺癌组织 ; N: 癌旁组织 1-27: patient number; T: breast cancer tissue; N: adjacent non-tumrol tissue. 图 1 Western blot 检测 27 对乳腺癌肿瘤组织和癌旁组织中 Oct4 蛋白的表达 Fig.1 Western blot analysis of Oct4 expression in breast cancer tissue and adjacent non-tumoral tissue in 27 pairs HCC patients 1: 空白对照 ; 2: shrna-control; : shrna-oct4 1: blank; 2: shrna-control; : shrna-oct4. 图 2 Western blot 检测表达靶向 Oct4 shrna 的慢病毒的感染效果 Fig.2 Western blot analysis of Oct4 expression in cells infected lentivirus expressing shrna-oct4 or shrna-control

临床细胞生物学 1164 0h 20 h 图细胞划痕实验检测oct4沉默对细胞迁移能力的影响 Fig.

5 Western blot analysis of oct4 silencing on expression of EMT markers shrna-oct4 (B) Relative percentage of invaded cells (%) (A) 1: shrna-control; 2: shrna-oct4.

4 临床细胞生物学 h 20 h 图细胞划痕实验检测oct4沉默对细胞迁移能力的影响 Fig. The effect of oct4 knockdown on breast cancer cell motility was examined by wound-healing assay shrna-control 图5 Western blot分析oct4沉默对emt标志物的影响 Fig.5 Western blot analysis of oct4 silencing on expression of EMT markers shrna-oct4 (B) Relative percentage of invaded cells (%) (A) 1: shrna-control; 2: shrna-oct4. * shrna- shrnacontrol Oct4 A: 穿过滤膜的细胞的显微镜图片; B: 穿过滤膜的细胞数的定量分析 *P<0.05, 与对照相比 A: microscopy ﬁgure of cells invased through matrigel; B: quantiﬁcation of invased cells. *P<0.05 vs shrna-control. 图4 细胞侵袭实验检测oct4沉默对细胞侵袭能力的影响 Fig.4 The effect of oct4 knockdown on breast cancer cell invasion was examined by cell invasion assay 步验证oct4在肿瘤侵袭中的作用, 我们采用了肿瘤细 EMT标志物的影响 Western blot结果显示, oct4沉胞侵袭实验结果显示, oct4基因沉默的肿瘤细胞穿默后上皮细胞标志物E-cadhrin alpha-catenin明显过带Matrigel小室滤膜的细胞数显著低于对照组细上调; 而间质细胞标志物Vimentin N-cadherin则明胞 (P<0.05)(图4) 通过对穿过滤膜的细胞数进行定显下降(图5) 量分析, 我们发现oct4基因沉默的肿瘤细胞中穿过滤膜的细胞数降低近50%(图4) 2.4 Oct4沉默对上皮间质转化(EMT)的影响上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞受到细胞外因子刺激后向问质细胞转化的现象; 通过EMT, 上皮细胞失去了细胞极讨论 Oct4是由Pou5F1基因编码产生的, 定位于人类染色体6p21., 其编码的蛋白Oct4(也叫Oct)是一种 POU转录因子, 属于V类POU蛋白 Oct4表达于卵母细胞原始生殖细胞和胚胎干细胞小鼠植入性, 失去与基底膜的连接等上皮表型, 获得了较高的前胚胎原肠胚的外胚层, 提示其与细胞的多能性迁移与侵袭抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间分化密切相关[6] 研究发现, Oct4仅在未分化的胚质表型 EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获胎干细胞中表达, 当这些细胞向体细胞分化的过程得迁移和侵袭能力的重要生物学过程鉴于以上的中, Oct4的表达下降或缺如[7] 因此, Oct4表达水平发现, 我们进一步通过Western blot检测oct4对多个的高低直接影响着干细胞的分化方向[8] 肿瘤细胞

5 曹勇等 : Oct4 在乳腺癌组织中的表达及其对乳腺癌细胞侵袭性的影响 1165 生长转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似, 因此部分研究者提出了肿瘤干细胞理论肿瘤干细胞是指肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞, 肿瘤的生长转移复发是靠少数的肿瘤干细胞不断自我更新以及繁衍来 [9] 维持和促成的因此, 检测调控干细胞自我更新的关键基因在肿瘤细胞中的表达具有非常重要的意义本研究首先分析转录因子 Oct4 在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达水平乳腺癌及其癌旁组织中均可检测 Oct4 蛋白的表达, 并且乳腺癌癌组织中 Oct4 蛋白的表达水平明显高于癌旁组织, 但 Oct4 蛋白的表达与乳腺癌干细胞的关系有待我们深入进一步研究上皮细胞间质转化是指上皮细胞在正常生理和特定病理情况下向间质细胞转化的现象乳腺恶性肿瘤细胞借助 EMT 方式增加癌细胞的迁移和运动能力, 从而促进乳腺癌细胞的侵袭及转移 EMT 主要的特征有细胞黏附分子 ( 如 E- 钙黏蛋白 alphacadherin) 表达的减少细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白 (Vimentin) 为主的细胞骨架及形态上具 [10] 有间充质细胞的特征等近年研究发现, 肿瘤细胞发生转移, 伴随着 EMT 发生的同时获得自我更 [11] 新并形成新的肿瘤的能力, 与肿瘤干细胞特点非常类似, 该研究证实 EMT 可以诱导上皮来源的肿瘤产生肿瘤干细胞目前, 已有研究报道 Oct4 参与乳 [12] 腺癌细胞的 EMT 过程 Hu 等报道 Mir145 通过下调 oct4 基因的表达, 从而抑制了乳腺癌细胞的 EMT 过程我们的研究证实 Oct4 参与了乳腺癌细胞的 EMT 过程, 但是 Oct4 在 EMT 中的具体作用尚存争议本研究发现, oct4 的基因沉默明显抑制了乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力, 并进一步发现 Oct4 参与调控了多个与 EMT 过程密切相关的关键蛋白这一研究发现进一步为肿瘤发生的肿瘤干细胞学说提供新的证据, 并对于 Oct4 在乳腺癌组织中表达规律的研究及其是否参与乳腺癌的发生发展均有积极的指导作用参考文献 (References) 1 Hattori N, Nishino K, Ko YG, Hattori N, Ohgane J, Tanaka S, et al. Epigenetic control of mouse Oct-4 gene expression in embryonic stem cells and trophoblast stem cells. J Biol Chem 2004; 279(17): Deev IE, Polianovskiĭ OL. oct-genes and oct-proteins. Mol Biol (Mosk) 2004; 8(1): de Jong J, Looijenga LH. Stem cell marker OCT/4 in tumor biology and germ cell tumor diagnostics: History and future. Crit Rev Oncog 2006; 12(/4): Tai MH, Chang CC, Kiupel M, Webster JD, Olson LK, Trosko JE. Oct4 expression in adult human stem cells: Evidence in support of the stem cell theory of carcinogenesis. Carcinogenesis 2005; 26(2): Hu T, Liu S, Breiter DR, Wang F, Tang Y, Sun S. Octamer 4 small interfering RNA results in cancer stem cell-like cell apoptosis. Cancer Res 2008; 68(16): Pan GJ, Chang ZY, Schöler HR, Pei D. Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4. Cell Res 2002;12(5/6): Hansis C. Totipotency, cell differentiation and reprogramming in humans. Reprod Biomed Online 2006; 1(4): Buitrago W, Roop DR. Oct-4: the almighty POUripotent regulator? J Invest Dermatol 2007; 127(2): Al-Hajj M, Clarke MF. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene 2004; 2(4): Tiwari N, Gheldof A, Tatari M. EMT as the ultimate survival mechanism of cancer cells. Semin Cancer Biol 2012; 22(): Eastham AM, Spencer H, Soncin F, Ritson S, Merry CL, Stern PL, et al. Epithelial-mesenchymal transition events during human embryonic stem cell differentiation. Cancer Res 2007; 67(2): Hu J, Guo H, Li HY, Liu Y, Liu J, Chen L, et al. MiR-145 regulates epithelial to mesenchymal transition of breast cancer cells by targeting Oct4. PLoS One 2012; 7(9): e45965.

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot