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1 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2014, 39(11) DOI: /j.issn FAT10 表达与乳腺浸润性导管癌生物学行为的关系 郭慧, 谭平萍 ( 湖南省肿瘤医院病理科, 长沙 ) [ 摘要 ] 目的 : 研究双泛素 (diubiquitin,fat10) 表达与乳腺浸润性导管癌生物学行为的关系 方法 : 免疫组织化学检测 50 例乳腺浸润性导管癌组织中 FAT10, 雌激素受体 (estrogen receptor,er) 孕激素受体(progesterone receptor, PR) 及人表皮生长因子受体 (c-erbb2) 的表达 ;Western 印迹检测 FAT10 在乳腺癌细胞系 MB-MDA-435 和转染 FAT10 sirna 表达质粒的 MB-MDA-435,MCF-7 和转染 FAT10 表达质粒的 MCF-7 中的表达 ;Transwell 小室检测 4 种乳腺癌细胞系的侵袭能力 结果 : 乳腺浸润性导管癌中,FAT10 的阳性表达强度与病理学分级 淋巴结转移 远处转移及 TNM 分期有关 (P<0.01), 而与患者年龄及肿瘤大小无关 (P>0.05); 受体阴性组中 FAT10 的阳性表达强度显著高于受体阳性组 (P<0.01), 三阴乳腺癌中 FAT10 的阳性表达强度率显著高于受体阳性组和受体阴性组 (P<0.01);FAT10 表达阳性组生存率明显低于 FAT10 表达阴性组 (P<0.05);Western 印迹结果显示高侵袭性乳腺癌细胞系中 FAT10 阳性表达强度显著高于低侵袭乳腺癌细胞系 ; 上调 FAT10 表达能增强乳腺癌细胞系的侵袭能力, 而下调其表达能降低乳腺癌细胞系的侵袭能力 (P<0.01) 结论:FAT10 可能具有直接或间接增加乳腺癌细胞的侵袭能力的作用, 在乳腺癌患者的侵袭和转移中起重要的作用, 它有可能作为判断乳腺癌预后的又一独立指标及靶向治疗乳腺癌特别是三阴乳腺癌的潜在靶点 [ 关键词 ] 乳腺 ; 浸润性导管癌 ;FAT10; 侵袭 ; 转移 Relationship between FAT10 expression and biological behaviors in infitrating ductal carcinoma of breast GUO Hui, TAN Pingping (Department of Pathology, Hunan Cancer Hospital, Changsha , China) ABSTRACT Objective: To study the relationship between FAT10 expression and biological behaviors in infitrating ductal carcinoma of breast. Methods: The expressions of diubiquitin (FAT10), estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR) and c-erbb2 in 50 cases of infitrating ductal carcinoma of breast were detected by immunohistochemistry. Western blot was used to detect FAT10 expression in MB-MDA-435, MB- MDA-435-transfected with FAT10 sirna expression plasmid, MCF-7 and MCF-7-transfected with FAT10 expression plasmid, respectively. Transwell was used to detect invasion capability of MB- MDA-435, MB-MDA-435-transfected with FAT10 sirna expression plasmid, MCF-7 and MCF- 收稿日期 (Date of reception): 作者简介 (Biography): 郭慧, 硕士, 主治医师, 主要从事肿瘤病理方面的诊断及研究 通信作者 (Corresponding author): 郭慧, gh_xysm@163.com

2 1126 中南大学学报 ( 医学版 ), 2014, 39(11) 7-transfected with FAT10 expression plasmid. Results: The expression intensity of FAT10 was significantly correlated to patho-grading, lymph nodes metastasis, distant metastasis and TNM staging (P<0.01), but not to age of patients and tumor sizes in infitrating ductal carcinoma of breast (P>0.05). The expression intensity of FAT10 in receptor- negative group was obviously stronger than that in receptor- positive group (P<0.01). The expression intensity of FAT10 in triple-negative breast cancer was significantly stronger than that in non- triple-negative breast cancer (P<0.01). The survival rate of patients with FAT10 positive expression was significantly lower than negative ones (P<0.05). Western blot results showed that FAT10 intensity in MB-MDA-435 significantly higher than that in MCF-7. Up-regulation expression of FAT10 could obviously increase the invasion capability of MCF-7, and downregulation of FAT10 could significantly decrease the invasion capability of MB-MDA-435 (P<0.01). Conclusion: FAT10 might increase the invasion capability of breast cancer cells by direct or indirect ways, and play an important role in invasion and metastasis of breast cancer. FAT10 might be an independent index for evaluation of breast cancer prognosis, and a potential target for breast cancer therapy, especially for triple-negative breast cancer. KEY WORDS breast; infitrating ductal carcinoma; FAT10; invasion; metastasis 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一, 严重 影响妇女身心健康甚至危及生命, 其发病率占全 身各种恶性肿瘤的 7%~10% 外科手术切除 放 疗 化疗及靶向治疗是乳腺浸润性导管癌患者获 得长期生存首选的最行之有效的治疗措施 对于 雌激素受体 (estrogen receptor,er) 孕激素受体 (progesterone receptor,pr) 及人表皮生长因子受体 (c-erbb2) 表达阳性的患者可采用靶向治疗, 而对 于三阴 (ER,PR 及 c-erbb2 表达均阴性 ) 乳腺癌由于 缺乏理论支持, 成为制约临床治疗的瓶颈 [1-2] 近 [3-8] 来研究发现双泛素 (diubiquitin,fat10) 的表达上 调参与多种肿瘤的发生发展 FAT10 由 165 个氨基 酸残基组成, 属于泛素蛋白家族中的泛素样修饰 蛋白 (ubiquitin-like proteins,ubls), 分子质量 18 kd, 由两个泛素样部分前后融合而成, 它的 N 端 有 29% 与泛素相同, 而 C 端有 36% 相同 [9-10] 本研究 拟通过检测 FAT10 的表达与乳腺浸润性导管癌生物 学行为的关系, 旨在为乳腺癌的预防和早期诊断 提供理论依据, 并为基因治疗提供新的靶点 1 材料与方法 1.1 材料 标本 收集湖南省肿瘤医院 年具有完整 随访资料的 50 例浸润性导管癌患者的临床资料 患者平均年龄 42.4(36~62) 岁, 其中病理分型 I 级 12 例,II 级 30 例,III 级 8 例 ; 有淋巴结转移者 32 例 乳腺根治手术中切除的正常乳腺组织 20 例作为正常对照 所有标本经 10% 中性福尔马林固定液固定, 常规石蜡包埋, 连续切片, 病理学确诊 细胞系及质粒人乳腺癌高转移细胞系 MB-MDA-435 和人乳腺癌细胞系 MCF-7 均购自中南大学肿瘤研究所 pcdna3-fat10 表达质粒由新加坡国立研究所 Caroline Lee 教授馈赠 ;FAT10 sirna 表达质粒购自美国 Santa Cruz 公司 试剂鼠抗人 FAT10 抗体购自美国 Santa Cruz 公司 ; ER,PR,c-erbB2 抗体及 EbVision TM 二步法免疫组织化学染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司 ; 脂质体 Lipofectamine TM 2000 转染试剂盒购自美国 Invitrogen 公司 ; 质粒抽提试剂盒系北京天根生物化学科技公司产品 1.2 方法 免疫组织化学染色石蜡切片脱蜡水化 ; 用 3%H 2 O 2 封闭内源性过氧化物酶 ;PBS 洗后, 乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液微波修复 6 min, 滴加一抗 37 孵育 1 h; PBS 洗后, 滴加过氧化物酶标记的二抗,37 孵育 45 min;pbs 洗后, 对氨基联苯胺 (DAB) 显色 ; 苏木精复染 脱水 透明 中性树胶封片 以 PBS 替代一抗或二抗作阴性对照 采用 Bresalier [11] 半定量

3 FAT10 表达与乳腺浸润性导管癌生物学行为的关系郭慧, 等 1127 公式判断染色结果 每张切片中随机选取 10 个视野, 根据细胞染色强度分为 4 级, 并分别计分 :0 分为阴性, 细胞无着色 ;1 分为弱阳性, 细胞着浅黄色 ;2 分为中度阳性, 细胞着棕黄色 ;3 分为强阳性, 细胞着棕褐色 计数每一强度的视野数 根据下列公式计算每张切片的平均染色强度 : 强度计分 (intensity score,is)= {(0 F0)+(1 F1)+(2 F2)+ (3 F3)},F 表示 10 个视野中各分值所占百分比 细胞培养及 Western 印迹乳腺癌细胞系 MB-MDA-435 和 MCF-7 用含 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培养液于 37,5%CO 2 条件下培养 细胞长满培养瓶后, 收集细胞抽提总蛋白, 电泳 转膜后, 将 PVDP 膜置于封闭液中室温封闭 2 h, 加入抗 FAT10 一抗室温孵育 1 h,pbs 清洗后加入过氧化物酶标记的二抗室温孵育 1 h,pbs 清洗后 DAB 显色 细胞转染及侵袭转移能力的检测按试剂盒说明书分别将 FAT10 表达质粒和 sirna 表达质粒转染 MCF-7 和 MB-MDA-435; 转染 24 h 后将细胞传代至新鲜培养液,1 d 后换成含 G418 的培养液进行筛选, 每 3 d 换液 1 次, 筛选 14 d 在 24 孔培养板中加入 500 μl 无血清 DMEM 培养基, 将膜上室侧铺上一层基质胶的 Transwel l 小室放入孔中, 调整细胞密度为 / 孔, 分别接种未转染和转染 sirna 表达质粒的 MB-MDA-435 细胞 未转染及转染 FAT10 质粒的 MCF-7 细胞,37 培养 36 h 吸出培养板中液体 PBS 轻洗, 甲醇固定 20 min, 加入 Gimsa 工作液室温染色 30 min,pbs 轻洗后, 用棉签小心擦出微孔膜上层细胞, 在倒置显微镜下于 200 倍计数移至微孔膜下层的细胞, 每个样本随机计数 5 个视野, 取其均数 1.3 统计学处理计量资料所有数据均采用均数 ± 标准差 (x±s) 表示 采用 SPSS 15.0 统计软件分析数据 计量资料进行 t 检验, 多组两两比较前行 F 检验, 计数资料用卡方检验 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 乳腺浸润性导管癌组织中 FAT10 阳性表达率及表达强度 FAT10 蛋白阳性信号位于细胞核 ( 图 1) 50 例浸润性导管癌中 FAT10 阳性表达率和阳性表达强度分别为 56.0%(28/50) 和 (1.51±0.52) 20 例正常乳腺组织 FAT10 阳性表达率和阳性表达强度分别为 10%(2/10) 和 (0.2±0.18) FAT10 在乳腺浸润 性导管癌中的阳性表达率和阳性表达强度显著高 于正常乳腺组织 (P<0.01) 2.2 乳腺浸润性导管癌组织中 FAT10 阳性表达强度与 临床病理资料的关系 图 1 FAT10 在乳腺浸润性导管癌中的表达 ( 200) Figure 1 表 1 乳腺浸润性导管癌组织中 FAT10 阳性表达强度与临床 病理资料的关系 (x±s) Table 1 Relationship between FAT10 positive expression and clinical pathological data in infitrating ductal carcinoma of breast (x±s) 在乳腺浸润性导管癌组织中 FAT10 的阳性表达 强度与病理学分级 有无淋巴结转移 有无远处 转移及 TNM 分期有关 (P<0.05, 表 1), 而与患者年 龄及肿瘤大小无关 (P>0.05, 表 1) 临床病理 Expression of FAT10 in infitrating ductal carcinoma of breast ( 200) n FAT10 阳性表达阳性数阳性表达强度 年龄 / 岁 < ± ±0.61 >0.05 肿瘤大小 <5 cm ± cm ±0.66 >0.05 病理学分级 I ±0.55 II ±0.74 <0.01 III ±0.79 淋巴结转移 有 ±0.88 无 ±0.63 <0.01 远处转移 有 ±0.87 无 ±0.65 <0.01 TNM 分期 I+II ±0.52 III+IV ±0.71 <0.01 P

4 1128 中南大学学报 ( 医学版 ), 2014, 39(11) 乳腺浸润性导管癌组织中 FAT10 表达与 ER,PR 及 c-erbb2 表达的关系将 ER 和 PR 其中之一表达阳性者纳入 ER, PR 表达阳性组 ( 受体阳性组 ), 受体阳性组和阴性组分别为 22 例和 28 例, 三阴乳腺癌 15 例 受体阳性组 受体阴性组及三阴组中 FAT10 阳性表达率和表达强度分别为 31.8%(7/22), 75%(21/28), 86.7%(13/15) 和 (1.13±0.45),(1.81±0.67), (2.01±0.89) 受体阴性组中 FAT10 的阳性表达强度显著高于受体阳性组 ( P<0.01), 三阴乳腺癌中 FAT10 的阳性表达率和表达强度显著高于受体阳性组和受体阴性组 (P<0.01) 2.4 FAT10 表达与乳腺癌患者术后生存率的关系 50 例乳腺癌患者均有 5 年以上完整随访资料 17 例乳腺癌患者在术后 5 年随访期间内死于乳腺癌复发 生存率采用 Kaplan-Meier 法作图, 再用 Logrank(Mantel-Cox) 时序检验分析两组生存率的统计学意义 FAT10 表达阴性患者平均生存期为 51.4 个月, 而 FAT10 表达阳性患者的平均生存期为 29.3 个月,FAT10 表达阳性组生存率明显低于 FAT10 表达阴性组, 两组之间生存率差异有统计学意义 (P<0.01, 图 2) 性乳腺癌细胞系 MCF-7 中 FAT10 的表达呈非常弱的阳性 ( 图 3) 将 FAT10 表达质粒转染 MCF-7 后, 其 FAT10 表达呈强阳性 ( 图 4); 将 FAT10 sirna 质粒转染 MB-MDA-435,FAT10 表达显著降低 ( 图 4) MB-MDA-435 MCF-7 FAT10 β-actin 图 3 FAT10 在 MB-MDA-435 和 MCF-7 中的表达 Figure 3 Expression of FAT10 in MB-MDA-435 and MCF FAT10 β-actin 累计生存率 生存时间 / 月 FAT10 + 图 4 FAT10 在未转染 转染 FAT10 sirna 表达质粒的 MB-MDA-435 和未转染 转染 FAT10 表达质粒的 MCF-7 中的表达 Figure 4 Expression of FAT10 in MB-MDA-435, MB- MDA-435-transfected with FAT10 sirna expression plasmid, MCF-7 and MCF-7-transfected with FAT10 expression plasmid 1: MB-MDA-435; 2: MB-MDA-435-transfected with FAT10 sirna expression plasmid; 3: MCF-7; 4: MCF-7-transfected with FAT10 expression plasmid 图 2 FAT10 的表达与患者生存率的关系 ( χ 2 =42.955, P<0.01) Figure 2 Relationship between FAT10 expression and the survival rate of patients (χ 2 =42.955, P<0.01) 2.5 乳腺癌细胞系 MB-MDA-435 和 MCF-7 中 FAT10 的表达 Western 印迹结果显示高侵袭性乳腺癌细胞系 MB-MDA-435 中 FAT10 的表达呈强阳性, 而低侵袭 2.6 乳腺癌细胞系的侵袭能力 MB-MDA-435 跨膜细胞数显著高于 MCF-7, 而转染 FAT10 表达质粒的 MCF-7 的跨膜细胞数显著高于 MCF-7(P<0.05), 且与 MB-MDA-435 差异无统计学意义 (P>0.05); 转染 FAT10 sirna 质粒的 MB-MDA-435 的跨膜细胞数显著低于未转染的 MB- MDA-435 细胞 (P<0.01, 图 5)

5 FAT10 表达与乳腺浸润性导管癌生物学行为的关系郭慧, 等 1129 图 5 未转染 转染 FAT10 sirna 表达质粒的 MB- MDA-435 和未转染 转染 FAT10 表达质粒的 MCF-7 细胞 的侵袭能力 Figure 5 跨膜细胞数 / 个 Invasion capability of MB-MDA-435, MB- MDA-435-transfected with FAT10 sirna expression plasmid, MCF-7 and MCF-7-transfected with FAT10 expression plasmid 0 1: MB-MDA-435; 2: MB-MDA-435-transfected with FAT10 sirna expression plasmid; 3: MCF-7; 4: MCF-7-transfected with FAT10 expression plasmid 组别 性表达显著高于非三阴乳腺癌者 随访资料结果 显示,FAT10 表达阳性组生存率明显低于 FAT10 表 达阴性组 提示 FAT10 有可能作为判断乳腺浸润性 导管癌预后的又一独立指标 癌细胞的侵袭性与淋巴结转移存在内在的联 系 FAT10 是否具有增加癌细胞的侵袭性的能力 [14] 黄健等通过 RNAi 技术阻断 FAT10 的表达, 可抑 制舌鳞癌细胞系 Tca8l13 的生长 增殖 迁徙 本 文利用高侵袭性和低侵袭性的乳腺癌细胞系 MB- MDA-435 和 MCF-7 进行体外实验,Western 印迹结 果显示, 高侵袭性细胞株中 FAT10 表达强度显著高 于低侵袭性者, 而将 FAT10 表达质粒转染低侵袭性 细胞系, 其侵袭能力显著增高, 将 FAT10 sirna 质 粒转染 MB-MDA-435,FAT10 表达显著降低, 且其 侵袭能力显著降低 推测 FAT10 可能具有促进乳腺 癌细胞侵袭的能力, 在乳腺癌患者的侵袭和淋巴 结转移中起着重要的作用, 它有可能成为治疗乳 腺癌特别是三阴乳腺癌的潜在靶点 参考文献 3 讨论 FAT10 基因是一种癌基因, 定位于 6q21.3, 其表达的蛋白 FAT10 是泛素样修饰蛋白家族的成 员, 在多种上皮性恶性肿瘤中表达上调 [3-4,6-7], 在 细胞分裂前中期通过干扰着丝粒的定位导致细胞 染色体的不稳定性增加 [12] [3] 研究发现在胃癌中 FAT10 mrna 和蛋白质表达显著高于癌旁组织中和 正常胃组织, 且与肿瘤的淋巴结转移 TNM 分期 [4] 及患者的生存期显著相关 ; 在舌鳞癌的研究中 已获得相似的结果 ; 新近研究显示, 在 HBV 相关 性肝细胞癌 (HCC) 中 FAT10 的表达明显高于癌旁肝 组织 肝硬变组织和正常肝组织, 且其表达与复 发和预后不良密切相关 ; 其异位表达能促进细胞 增殖 抑制细胞凋亡 诱导细胞周期进展和上皮 - 间质转化等, 而且发现 FAT10 是通过 Akt/GSK3β 信 号通路发挥其生物学效应 [7] FAT10 主要在胞核中 表达, 进一步提示其有可能参与了细胞周期的调 节 [13] 在乳腺浸润性导管癌中 FAT10 的阳性表达 率和阳性表达强度显著高于正常乳腺组织, 且其 表达强度与病理学分级 有无淋巴结转移 有无 远处转移 TNM 分期 受体及 c-erbb2 表达有关 高级别浸润性导管癌 受体阴性及有淋巴结转移 者,FAT10 表达均高于低级别浸润性导管癌 受体 阳性及无淋巴结转移者 ; 三阴乳腺癌中 FAT10 的阳 1. Irvin WJ Jr, Carey LA. What is triple-negative breast cancer?[ J]. Eur J Cancer, 2008, 44(18): Greenwood C, Metodieva G, Al-Janabi K, et al. Stat1 and CD74 overexpression is co-dependent and linked to increased invasion and lymph node metastasis in triple-negative breast cancer[ J]. J Proteomics, 2012, 75(10): Ji F, Jin X, Jiao CH, et al. FAT10 level in human gastric cancer and its relation with mutant p53 level, lymph node metastasis and TNM staging[ J]. World J Gastroenterol, 2009, 15(18): 黄健, 李德怀. 舌癌组织 FAT10 mrna 表达与临床病理特征关系的研究 [ J]. 口腔颌面外科杂志, 2010, 20(6): HUANG Jian, LI Dehuai. Expression and clinical significance of FAT10 in carcinoma of tongue[ J]. Chinese Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 2010, 20(6): Yuan J, Tu Y, Mao X, et al. Increased expression of FAT10 is correlated with progression and prognosis of human glioma[ J]. Pathol Oncol Res, 2012, 18(4): Qing X, French BA, Oliva J, et al. Increased expression of FAT10 in colon benign, premalignant and malignant epithelial neoplasms[ J]. Exp Mol Pathol, 2011, 90(1): Liu L, Dong Z, Liang J, et al. As an independent prognostic factor, FAT10 promotes hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma progression via Akt/GSK3β pathway[ J]. Oncogene, 2014, 33(7): 高芸, 李少一, 商雪莹, 等. FAT10 过表达对肝癌细胞 HepG2 侵袭

6 1130 中南大学学报 ( 医学版 ), 2014, 39(11) 及迁移能力的影响 [ J]. 实用预防医学杂志, 2013, 20(5): GAO Yun, LI Shaoyi, SHANG Xueying, et al. Effect of FAT10 Overexpression on Migration and HepG2 Hepatocellular Carcinoma Cells[ J]. Practical Preventive Medicine, 2013, 20(5): Ren J, Kan A, Leong SH, et al. FAT10 plays a role in the regulation of chromosomal stability[ J]. J Biol Chem, 2006, 281(16): Snyder A, Alsauskas Z, Gong P, et al. FAT10: a novel mediator of Vprinduced apoptosis in human immunodeficiency virus-associated nephropathy[ J]. J Virol, 2009, 83(22): Bresalier RS, Ho SB, Schoeppner HL, et al. Enhanced sialylation of mucin associated carbohydrate structures In human colon cancermentastasis[ J]. Gastroenterology, 1996, 110(5): Schmidtke G, Kalveram B, Weber E, et al. The UBA domains of NUB1L are required for binding but not for accelerated degradation of the ubiquitin-like modifier FAT10[ J]. J Biol Chem, 2006, 281(29): Zhang SH, Xu AM, Chen XF, et al. Clinicopathologie significance of mitotic arrest defective protein 2 overexpression in hepatocellular carcinoma[ J]. Hum Pathol, 2008, 39(12): 黄健, 李德怀. RNA 干扰 FAT10 基因对舌癌细胞系 Tca8113 增殖和侵袭的影响 [ J]. 口腔颌面外科杂志, 2011, 21(3): HUANG Jian, LI Dehuai. Effect of RNA interference of FAT10 gene on the proliferation and invasion of human tongue carcinoma Tca8113 cells[ J]. Chinese Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 2011, 21(3): ( 本文编辑郭征 ) 本文引用 : 郭慧, 谭平萍. FAT10 表达与乳腺浸润性导管癌生物学行为的关系 [ J]. 中南大学学报 : 医学版, 2014, 39(11): DOI: /j.issn Cite this article as: GUO Hui, TAN Pingping. Relationship between FAT10 expression and biological behaviors in infitrating ductal carcinoma of breast[ J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2014, 39(11): DOI: /j.issn

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