期 李徐奇 雷建军 徐勤鸿 等 %&' 在缺氧诱导乳腺癌 细胞上皮 间质转分化中的重要作用 细胞丧失上皮细胞 细胞间连接 细胞 细胞接触的蛋白如 1*#)'! 等的下调 和获得间质标志如 ' #!'! 等蛋白的表达上调 大量研究表明 在包括结肠癌 乳腺癌 前列腺癌及肝癌等多种肿瘤侵袭转移过程中均可观

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1 第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& '& 基础研究 在缺氧诱导乳腺癌 细胞上皮 间质转分化中的重要作用 李徐奇 雷建军 徐勤鸿 段万星 盛 薇 王 康 魏光兵 西安交通大学医学院第一附属医院 普通外科 肝胆外科 陕西西安 $ 摘要 目的 探讨 %&' 在缺氧诱导乳腺癌 细胞上皮 间质转分化 ( 及侵袭中的重要作用 方法 通过缺氧培养乳腺癌 细胞 以常氧培养作为对照 ()*!+#& 小室侵袭试验检测各组 细胞的侵袭能力,#+#)!&- 检测./0%&'1*#)'! 和 '#!'! 蛋白的表达水平 通过 + 稳定转染乳腺癌细胞 再次通过 ()*!+#& 小室侵袭试验检测缺氧对乳腺癌细胞侵袭能力的影响,#+#)!&- 检测./0%&'1*#)'! 和 '#!'! 蛋白的表达水平 结果 缺氧可明显诱导乳腺癌 细胞侵袭 并上调./0%&' 和 '#!'! 蛋白 下调 *#)'! 蛋白 靶向沉默 %&' 基因后 缺氧失去了对乳腺癌细胞侵袭和 ( 的诱导作用 结论 缺氧通过上调 %&' 表达活化.##- 通路 诱导乳腺癌细胞侵袭及 ( 过程 关键词 乳腺癌 侵袭 上皮 间质转分化 缺氧 %&'.##- 通路中图分类号 $$ 文献标志码 $!"#$%#"!!&%'!$%#$%'$ #"$%#!%!&"$#$%"% 2/3"4' 2/5'*!"! 36 7'!-! 6,*!'! 8.%,#',% 9*!,/%"*!'! #*)#!-:%#!#)*&8")#)#*)#!-:.#*-'&'*)8")#)#0')+ :'&'*#.-+'*&#'*&8--&-:3';*!5'*--!6!'#)+'3';*!$1'!* ()* ("#"# )###!*+!,&-" )###!*+!,.#""(# (##"&/'+.) #"!*+!,#&0!*+!,."#"). &(10- ""."") )&1 (# "#"!*+!, #"( 10- " " "." ( " &-# ". ) )" ("#"# "#"!*+!,#& 1 ("## "#)### ("#1". & +,-.)( )## # (". 肿瘤细胞上皮 间质转分化 #'#&'*&#+#! *&)*!+''-!( 是肿瘤细胞侵袭转移的一 个关键过程 是肿瘤细胞以上皮表型向狭长状成纤 维样表型转化 以获得间质表型的复杂过程 ( 是启动恶性肿瘤侵袭转移的重要途径之一 最终导致细胞活性和侵袭性增强 在 ( 特征获得过程中 收稿日期 修回日期 基金项目 国家自然科学基金资助项目 - 中央高校基本科研业务费专项资金资助项目 - 8"-)##*'-!*&*")*&8'#!#0-"!*'-!-:1'!*-*!#0"!*#!*&#+#*)0"!+:-)#1#!)*& 6!'#)+''#+'!3';*!5'*--!6!'#)+'- 通讯作者 魏光兵 主治医师 *'&#'"*!'!- 作者简介 李徐奇 男 汉族 博士 助理研究员 研究方向 消化系统及乳腺肿瘤的发病机制与治疗策略 *'&&'"4'- 网络出版时间 $$ 网络出版地址!'!# +#*'&$$&!"#"!

2 期 李徐奇 雷建军 徐勤鸿 等 %&' 在缺氧诱导乳腺癌 细胞上皮 间质转分化中的重要作用 细胞丧失上皮细胞 细胞间连接 细胞 细胞接触的蛋白如 1*#)'! 等的下调 和获得间质标志如 ' #!'! 等蛋白的表达上调 大量研究表明 在包括结肠癌 乳腺癌 前列腺癌及肝癌等多种肿瘤侵袭转移过程中均可观察到 ( 的发生 而且发生 ( 的 癌细胞数量直接与肿瘤侵袭转移程度相关 缺氧诱导因子 -'*'!"'&#:*-)./0 作为一种氧应答调控因子 在肿瘤侵袭转移 过程中起着关键的作用 研究显示 ( 相关转录因子在低氧微环境中存在过表达 这些转录因子的 上调可能是由./0 所介导的 然而到目前为止 缺氧诱导肿瘤发生 ( 从而促进侵袭的具体分子机制仍不清楚 本研究旨在通过靶向沉默乳腺癌细胞的 %&' 基因 探讨 %&' 在缺氧诱导乳腺癌 细胞 ( 过程中的重要作用 材料与方法 材料与分组 人乳腺癌细胞株 细胞购自中国科学院上海生命研究所 细胞培养基 胰蛋白酶购自.&-!# 公司 胎牛血清购自杭州四季青公司 兔抗人./0%&'1*#)'! 和 '#!'! 多克隆抗体均购自 '--)& 公司 鼠抗人 *'! 单克隆抗体. 标记山羊抗鼠 /% 山羊抗兔 /% 二抗均购自北京中衫金桥公司 聚偏二氟乙烯膜 0 膜 ()*!+#& 小室均购自 '&' -)# 公司 %&'+ 和对照 + 1-!)-& 质粒购自上海吉玛公司 %&'+ 的有效序列为 <%%161%166%6%6%66((< 转染试剂 2'-:#*'!# 购自 /!')-#! 公司 1 引物合成于北京鼎国生物公司 #*&'#1 试剂盒购自大连 (*9** 公司 实验分组 常氧对照组 -)-'* 缺氧组.-'* 常氧 = 对照 + 干扰组 -)-'*=+#-) 常氧 =%&'+ 干扰组 -)-'*=+%&' 缺氧 = 对照 + 干扰组.-'*=+#-) 缺氧 =%&'+ 干扰组.-'*=+%&' 细胞培养与转染 人乳腺癌细胞株 于含 22 胎牛血清的 培养液中 $>221? 培养 用 2 胰酶消化传代 取对数生长期的细胞进行实验 参照 2' -:#*'!# 转染试剂盒说明书进行转染 瞬时转染 后消化细胞 按 接种于 孔板后加 2% 进行稳定转染筛选 每 换液 次 后 出现多个 % 抗性的克隆 由于质粒带有绿色荧光蛋白 %0 的表达 在荧光显微镜下可 看到带绿色荧光的阳性克隆 显微镜下挑取带绿色荧光的单个克隆移入 孔培养板 继续 % 维持培养 经过 周可以获得稳定转染的细胞克隆 /"$%0 小室侵袭实验 按实验目的 将细胞在常氧条件 22? 或缺氧条件 22? 下培养 以预冷的 与 *)'#& 胶 稀释后 取 2 稀释胶加到 ()*!+#& 上层小室中 于 $> 孵育 收集各组细胞 个 2 的细胞密度 2 接种于 ()*!+#& 上层小室 含 22 胎牛血清的 培养基 2 加入 ()*!+#& 下层小室 置于 $>221? 的培养箱中培养 用棉签沾 8 轻轻地擦去小室上层聚碳酸酯膜上贴壁生长但未能穿过膜的细胞 将膜取出固定 '!2 的结晶紫染色 '! 后小心洗去 倍放大倍数下随机观察并计 个视野内穿过聚碳酸酯膜的细胞数 照相记录 重复 次 /1 蛋白印记法.#"%!# 检测蛋白表达 $ 个 蛋白裂解液裂解细胞 提取细胞总蛋白 1 法测定蛋白浓度 88% 凝胶电泳 半干转膜法转至 0 膜 2 脱脂牛奶室温封闭 加一抗稀释液 > 孵育过夜 (8( 缓冲液洗膜后加入二抗稀释液室温孵育 12 化学发光 暗室显影 /*) 检测 ) 的转录 用 ()'-& 氯仿 异丙醇法提取各组细胞总 取 按反转录试剂盒说明反转录为 以 为模板 1 扩增./0%&'1*#)'! 和 '#!'! 以 %. 为内参照 各基因引物序列如下./0<% (1(%%%(%1%1<<1%(111 %1(1(%<%&'<%%%(%(1111( 11(1%(1<<1(%%%1% %( <1*#)'!<((1(%((1(%1(%1(1( (%<<%(11(%%(11(1((1(11<'#! '! <(%11%1((1%111< <11% 1(1(11(11(1%(%< %. <%( %11(1((%11(1<<%%1(1(1 %(1(11(%1(<1 反应条件 预变性 > +> +>+$>+ 共 个循环 溶解曲线条件 > +> +> + 基因相对表达水平通过 1( 法计算 统计学处理 应用 888 软件处理数据 实验数据以均数 A 标准差 A 表示 采用 检验或单因素方差分析 其中多组资料两两比较采用 28 多重检验 认为差异有统计学意义!"#"!

3 西安交通大学学报 医学版 第 卷 结 果 / 缺氧显著促进乳腺癌 细胞的侵袭能力 (*!+#& 实验结果显示 常氧对照组与缺氧组 细胞穿过 ()*!+#& 小室的细胞数分别为 A 个和 A$ 个 差异有统计学意义 B 图 结果提示 缺氧能显著促进乳腺癌 细胞侵袭能力 图 缺氧对乳腺癌 细胞, *$"% 和 2%#% 表达的影响 0'(##:#+-:-'*-!./0%&'1*#)'! 图 缺氧显著促进乳腺癌 细胞的侵袭 0'.-'*+'!':'*!&)--##'!*+'-!-:)#*+ *)'!-* #&&'!# 常氧组 缺氧组 缺氧显著促进乳腺癌 细胞的侵袭 1()*!+#& 小室穿膜细胞计数 与常氧组比较 / 缺氧促进乳腺癌细胞侵袭与活化 并诱导细胞, 有关 在常氧条件和缺氧条件下培养 细胞,#+#)!&- 检测其蛋白表达 结果显示 缺氧组 细胞的./0 蛋白水平 A$ 比常氧对照组 A 显著上调 图 而 #*&'# 1 检测未能发现缺氧组 细胞的./0 量与常氧对照组之间有明显差异 图 缺氧组的 细胞 %&' 蛋白水平 A 较常氧对照组 A 明显上调 缺氧组 '#!'! 蛋白水平 A 较常氧组 A 明显上调 然而 缺氧组 1*#)'! 蛋白水平 A 较常氧组 A 显著下调 说明缺氧促进乳腺癌细胞 %&' 表达并诱导细胞 ( / 特异性 ) 干扰载体 ) 对 细胞 蛋白和 ) 表达的抑制作用 *!'#!'!#)#++'-!+'! #& 缺氧培养的 细胞的./0%&' 和 '#!'! 蛋白比常氧培养时显著上调 1*#)'! 显著下调 缺氧培养的 细胞的./0 无明显变化 %&' 和 '#! '! 比常氧培养时显著上调 1*#)'! 显著下调 与常氧组比较,#+#)!&- 结果显示 常氧组 常氧 = 对照 + 干扰组 常氧 =%&'+ 干扰组的 %&' 蛋白相对表达量分别为 A$A$ 和 A 组间差异具有统计学意义 稳定转染后 %&' 靶向沉默的细胞 %&' 蛋白表达受到了显著的抑制 抑制率达 C 图 # *&'#(1 结果显示 常氧组 常氧 = 对照 + 干扰组 常氧 =%&'+ 干扰组的 %&' 相对表达量分别为 AA 和 A 组间差异具有统计学意义 稳定转染后 %&' 靶向沉默的细胞 %&' 表达受到了显著的抑制 抑制率为 C 图 /1 沉默逆转了缺氧对乳腺癌细胞侵袭的促进作用 ()*!+#& 实验显示 常氧 = 对照 + 干扰组与缺氧 = 对照 + 干扰组穿膜细胞数分别为 A 和 A 差异具有统计学意义 表明缺氧对乳腺癌 细胞有明显的促进侵袭作用 与此同时 常氧 =%&'+ 干扰组与缺氧 =%&'+ 干!"#"!

4 期 李徐奇 雷建军 徐勤鸿 等 %&' 在缺氧诱导乳腺癌 细胞上皮 间质转分化中的重要作用 扰组穿膜细胞数分别为 $A 和 A 差异没有统计学意义 表明当乳腺癌细胞 %&' 被阻断后 缺氧失去了对乳腺癌细胞的侵袭诱导作用 图 本结果提示 %&' 在缺氧促进乳腺癌细胞侵袭过程中扮演重要作用 图 靶向沉默对 细胞 表达的抑制作用 0' (#'!''-)#:#-!+*)#'!:-)%&' -!##)#++'-!-:%&''! #& %&' 靶向沉默对 细胞 %&' 蛋白表达的抑制作用 %&' 靶向沉默对 细胞 %&' 表达的抑制作用 / 缺氧通过上调 后诱导乳腺癌细胞, 提取细胞总蛋白 经,#+#)!&- 检测发现 图 缺氧 = 对照 + 干扰组与常氧 = 对照 + 干扰组./0 相对表达量分别为 A A%&' 的相对表达量分别为 $ AA'#!'! 蛋白相对表达量分别为 AA 差异具有统计学意义 缺氧 = 对照 + 干扰组与常氧 = 对照 + 干扰组 1*#)'! 蛋白水平分别是 $A$A 差异具有统计学意义 而缺氧 =%&'+ 干扰组与常氧 =%&'+ 干扰组比较./0 蛋白水平分别是 AA 尽管缺氧导致./0 蛋白明显上调 但 %&' 蛋白的相对表达量分别为 A A'#!'! 蛋白相对表达量分别为 AA1*#)'! 蛋白相对表达量分别为 AA 差异无统计学意义 本结果说明 %&' 的激活是缺氧通过./0 上调诱导乳腺癌细胞 ( 的关键环节 图 的激活是缺氧通过 上调诱导乳腺癌细胞, 的关键环节 0''*'-!-:%&'*+##--'*;+'!"'! )#*+ *)'!-* #&( 讨 论 图 1 缺氧促进乳腺癌细胞侵袭依赖于 0'.-'*)--##'!*+'-!-:)#*+ *)'!-* #&##!'!'%&' 1 常氧组 缺氧组 ()*!+#& 试验显示 缺氧条件可诱导 +#-) 细胞侵袭 但对 %&' 靶向沉默后的 +%&' 细胞没有作用 ()*!#& 实验各组穿膜细胞数分析 与常氧组比较 $ 乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一 在我国居女性恶性肿瘤死亡率之首 其侵袭和转移途径多样 是 造成死亡率居高不下的重要原因 大多数实体瘤具有缺氧的微环境 在肿瘤发生发展过程中一个关键的步骤是肿瘤细胞对缺氧的适应 缺氧微环境可通过调控多种基因表达 从而促进恶性肿瘤发生浸润转移 其中./0 在这一过程中发挥重要作用./0 由 和 亚基组成 其中./0 是受氧!"#"!

5 西安交通大学学报 医学版 第 卷 分子调节的主要功能亚基 人体肿瘤组织中./0 高水平表达 表达程度与肿瘤的进展程度 转移等正相关./0 在常氧条件下不断通过泛素 蛋白酶体途径水解 在缺氧条件下则降解受阻而在胞质内聚集 随后转运入核 与缺氧反应元件结合 启动下游靶基因转录 最新研究表明./0 高表达能引起胰腺癌 卵巢癌 前列腺癌 胆囊癌 肝细胞癌等多种肿瘤细胞发生 ( 特征的转变 提高其侵袭转移能 力 我们的研究发现 乳腺癌 细胞在缺氧条件下其侵袭能力显著提高 同时发现 缺氧的乳腺癌细胞./0 蛋白水平较正常对照显著上调 但 水平未明显增高 说明缺氧是从转录后水平调节细胞./0 表达 9/8.1.D 等发现./0 是肿瘤细胞 ( 的一个重要上游信号 缺氧诱导的./0 高表达激活 8!*'& 通路上调 导致细胞发生 1*#)'! 等上皮标志丢失和 '#!'! 等间质标志获得的 ( 改变 我们检测了 细胞上皮细胞标志性蛋白分子 1*#)'! 和间质细胞标志性蛋白分子 '#!'! 表达水平 通过,#+#)! &- 观察到 随着缺氧诱导乳腺癌细胞./0 蛋白上调 随之发生丢失 1*#)'! 并获得 '#!'! 事件 即细胞失去上皮表型 开始向间质表型转化 导致侵袭能力增强.##- 信号通路是乳腺癌发展的重要机制之一 在乳腺癌患者的组织中 该通路成员 8.. 8?(1.%&' 均高表达 表明此通路的激活与乳腺癌的发生 发展相关 配体 8.. 可与受体 (1. 结合 解除 (1. 对 8? 的抑制 活化的 8? 激活其下游转录因子 %&'%&' 进入细胞核 内促进其下游基因转录 促进肿瘤细胞迁徙浸润 因此 %&' 不仅是.##- 信号通路的关键环节 其上调激活也是该通路活化的标志 研究发现 在体内外髓母细胞瘤 神经胶质瘤 乳腺癌 前列腺癌 基底细胞癌等均存在不经过活化 8? 而直接激活 %&' 促进肿瘤进展的现象 此外 有报道提示.##- 信号通路的活化可能与肿瘤细胞侵袭过 程中的 ( 转变有关 为了阻断乳腺癌细胞.##- 信号通路的活化 我们选择了 %&' 基因沉默的方法 通过对稳定转染 %&' + 的 细胞 利用,#+#)!&- 和 #*&'#(1 分别检测对 %&' 蛋白和 的抑制效果 结果发现 抑制效率约 $CC 与无效对照组和正常细胞 %&' 的表达具有明显的差异性 说明 + 靶向沉默 %&' 基因的效果满意 随即 ()*!+#& 小室实验发现 %&' 干扰的细胞和空载体对照细胞在缺氧条件下其侵袭行为的变化有着明显的差异 空载体对照细胞的侵袭能力能被缺氧诱导 而 %&' 干扰的乳腺癌细胞在常氧和缺氧条件下 其侵袭能力没有明显的变化 提示.##- 通路的活化是缺氧诱导乳腺癌细胞侵袭中的一个关键环节 此外 我们又检测了 ( 相关分子的表达变化 我们发现 在 %&' 干扰的乳腺癌细胞中 尽管缺氧诱导了./0 蛋白上调 但因为 %&' 蛋白上调被抑制 *#)'! 和 ' #!'! 的表达水平并未发生相应变化 因此 可以认为缺氧是通过活化.##- 通路来诱导乳腺癌细胞发生 ( 和增加其侵袭能力的 综上所述 我们运用 %&' 沉默技术抑制乳腺癌 细胞 %&' 表达 抑制.##- 通路活性 可以阻断缺氧诱导的肿瘤细胞 ( 过程及侵袭能力上调 提示了.##- 通路在乳腺癌浸润转移机制中的重要作用 该通路的活化与乳腺癌的侵袭转移潜能密切相关 并为其作为乳腺癌治疗靶点的选择提供了新的理论和实验依据 参考文献 +*/' 2&! # " )#&'/#& +'+ 1/$ /-+,/+ +&!# #34# "#(&# $$& 0!+!+ 5&1" ("#"# " #####"""&!#& 李四光 刘凯歌 常远鸿 & 肝星状细胞经趋化因子 $*- / 轴途径促进肝癌细胞侵袭的作用及其机制 & 吉林大学学报 医学版 $$& 巴云鹏 张晓 宋瑞彪 & 喉鳞状细胞癌组织中缺氧诱导因子 和人表皮生长因子受体 的表达 & 郑州大学学报 医学版 & $+067 2&1 ("#" &,"$#& $$0/'+0$1+*1+! *!++&#$# &+ #& 周灿 王珂 何建军 等 & 不同年龄段女性乳腺癌患者临床病理特征的回顾性分析 & 西安交通大学学报 医学版 $& 0+!'+' 2&+# #) ("#"# "#####& 0#& 下转第 页!"#"!

6 期 童方念 罗 超 罗 丹 等 山奈酚对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用 $ 映自由基损伤引发的脂质过氧化情况 研究结果显示 模型组肝细胞 含量明显高于对照组 说明肝细胞发生明显的脂质过氧化反应 山奈酚组与模型组相比 肝组织中 明显降低 表明山奈酚具有减少自由基生成 减轻肝细胞损伤的作用 8? 是体内主要的抗氧化酶 属于金属蛋白酶 能够清除体内氧自由基 保护组织细胞免受自由基的攻击 其水平高低间接反映机体清除自由基的能力 其水平的 变化又间接反映机体氧自由基含量的变化 与模型组比较 山奈酚组使 8? 活性增加 表明其具有清除自由基 进而减轻肝细胞氧化损伤的作用 病理组织学显示 山奈酚可明显减轻肝细胞变性 坏死程度及损伤范围 减轻炎细胞浸润 其对肝组织形态的改善与生化指标一致 进一步证实了山奈酚对 11& 所致肝损伤有保护作用 文献报道含酚羟基的化合物具有明显的清除氧 自由基作用 其作用可能与所带酚羟基数目有关 山萘酚又称 <$ 四羟基黄酮 其 个羟基均可与活性自由基相结合 这可能正是山奈酚减轻氧化性肝损伤的机制 还有文献报道黄酮类化合物对各种实验性肝损伤均有不同的保护作用 其作用与其清 除自由基 抗脂质过氧化 调节免疫功能等有关 由此推断 黄酮类物质山奈酚正是通过减少自由基生成 减轻氧化损伤 进而发挥了对抗 11& 所致肝损伤的作用 另外 阳性药水飞蓟宾是水飞蓟素中具有生物活性的主要成分 是经典的肝损伤修复药物 有明显的保护和稳定肝细胞膜的作用 本研究结果与文献报道 一致 而山奈酚也具有良好的肝保护作用 有望 成为治疗肝病的药物 参考文献 +*/'!'+'!,/$!/'7/8 /// &+. " " &!/!"& 张燕玲 薛小平 & 山萘酚的作用机理研究 & 化学与生物工程 & 陈卫华 郭松超 & 肝脏损伤动物模型及观察指标研究现状 & 广西医科大学学报 $& 罗奕 刘文 & 齐墩果酸对四氯化碳所致大鼠肝纤维损伤的保护作用 & 中国药师 $$&!+'+6!+*/$!++* +$&0 )## ## #," #&(+ 7#& 8+$1+' 1+!/$1 $0'1 $&1# "("# "#"(# &# & $ 戚世媛 熊正英 & 女贞子提取物对大鼠肝组织自由基代谢和运动能力的影响 & 西安交通大学学报 医学版 $ & 孙晓晶 王允 王毅刚 等 & 苏肝清对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用 & 中药材 & 张媛媛 管棣 谢青兰 等 & 酮体外抗氧化作用研究 & 中成药 $& 郭菁菁 杨秀芬 & 黄酮类化合物对动物实验性肝损伤保护作用的研究进展 & 中国药理学通报 & -/+ 21+1'!/$ 1&! $) "&+/ & 编辑 国 荣 上接第 页 ###1" 2/0$1'+!+1+/6,8+8+ *'++$++ 1 &1 ("#)#""#" 1"## # "" ) -8-1+" 8-1, & #/$$& $0!$!/+*+6+'*/$2+0&* ###")##) ")""#"&,",#$& 0!+ 5 5&$*-/"#. &#$& 0!+ 5*+' &7##" ""# ###&/ ($& +'$'-'+*&0)#". "# # #### ####&0# & 编辑 卓选鹏 ## ## # " #!"#"!

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