5989_5672.qxd

Size: px

Start display at page:

Download "5989_5672.qxd"

弓翘时
5 years ago
Views:

1 采用三重串联四极杆 GC/MS 的联用和反吹技术快速筛选和确认婴儿奶粉及大豆产品中的三聚氰胺及其类似物应用食品作者 Stephan Baumann Agilent Technologies, Inc Stevens Creek Blvd Santa Clara CA USA 摘要通过利用安捷伦 7890A/7000A 系列带 Ultimate Union 吹扫的三重串联四极杆 GC/MS 联用和反吹技术, 开发了一种快速筛选和确认婴儿奶粉和豆制品中的三聚氰胺三聚氰酸一酰胺三聚氰酸二酰胺和氰尿酸的方法该方法中的提取及衍生过程与 FDA( 美国食品和药物管理局 ) 的 GC/MS 方法相同在 0.16 到 2.5 ppm 的浓度范围内可获得卓越的线性度 (R 2 >0.99), 且运行时间不到 15 分钟

2 前言由于在美国生产的奶粉分布于加拿大市场的巧克力在荷兰销售的饼干在泰国销售的炼乳以及在香港销售的鸡蛋中均检测到了三聚氰胺, 在食品中搀杂三聚氰胺已迅速成为一个国际问题对此, 许多国家已经建立了针对三聚氰胺的许可浓度限制, 如 FDA 要求婴儿奶粉中三聚氰胺的最高残留限量 (MRL) 为百万分之一 (1 ppm), 其他产品则为 2.5 ppm FDA 的 GC-MS 筛选法 [1] 能够检测的三聚氰胺及其类似物 ( 三聚氰酸一酰胺三聚氰酸二酰胺和氰尿酸 ) 的灵敏度为 2.5 ppm 然而,FDA 在 2009 年 2 月的进口警报要求所采用的测试方法对于三聚氰胺及其类似物的检测灵敏度必须达到 0.25 ppm, 以保证检测结果符合 MRL 规定因此, 在新的规定下,FDA 的 GC-MS 筛选法已不能适用于筛选三聚氰胺及其类似物, 其确认也需要通过额外的正交法进行本应用中说明的方法对 FDA 的 GC MS 筛选法进行了改进, 采用了新型 Agilent 7000A 系列三重串联四极杆 GC/ MS 联用技术改进后的新方法不改变样品的提取和衍生程序, 通过使用带吹扫接头的气相色谱柱和反吹技术, 使得运行时间在 15 分钟以内该方法可以使三聚氰胺及其类似物的检测精度达到 0.25 ppm, 其定量也具有高度的重现性和准确性最重要的是, 这种方法经一次短时间运行就能实现三聚氰胺及其类似物的筛选定量和确认实验标样和试剂所使用的标样和试剂列于表 1 中三聚氰胺三聚氰酸一酰胺三聚氰酸二酰胺和氰尿酸分别制成 DEA/H20 ( 体积比为 20/80) 混合溶剂的溶液, 浓度均为 1000 µg/ml, 储存温度为 4 C 内标物 (2,6- 二氨基 -4- 氯嘧啶,DAPC) 配制成浓度为 57.7 ng/ml 的吡啶溶液, 该溶液用于制备 FDA 方法 [1] 中的基质匹配标准物基质样品由 FDA 无偿提供表 1. 标样与试剂标样三聚氰胺 Sigma-Aldrich >99% 纯度氰尿酸 TCI-America >98.0% 三聚氰酸一酰胺 TCI-America >98.0% 三聚氰酸二酰胺 TCI-America >95.0% 内标 Sigma-Aldrich 98% 溶剂二乙胺 Sigma-Aldrich Sigma 超纯级 (DEA) 吡啶 Fisher 认证的 A.C.S. Scientific 试剂乙腈 Fisher 高效液相色谱级甲基硅烷化试剂 BSTFA 含 Sigma-Aldrich 衍生化级 1% TMCS* (SYLON BFT) DAPC (2,6- 二氨基 -4- 氯嘧啶 ) * BSTFA: 双 ( 三甲基硅烷基 ) 三氟乙酰胺, TMCS: 三甲基氯硅烷仪器实验所采用的仪器包括配置分流 / 不分流毛细管进样口的安捷伦 7890A 气相色谱仪配置三重离轴检测器的安捷伦 7000A 系列三重串联四极杆 GC / MS 联用仪以及安捷伦 7683B 全自动液体进样器 (ALS) 分流 / 不分流进样口装有一个长寿命隔垫 ( 部件号 ) 和一个去活的分流单锥形注射衬管 ( 部件号 ) 用 10 µl 注射器 ( 部件号 ) 注射各仪器使用条件列于表 2 表 2. 气相色谱仪和质谱仪条件气相色谱运行条件色谱柱两根 15 m 0.25 mm 0.25 µm HP-5 ms 色谱柱 (p/n 19091S-431) 进样温度 280 C 进样压力 12.9 psi 载气氦气, 恒流模式,1.2 ml/min 脉冲不分流 25 psi at 0.5 min 柱箱升温程序 100 C ( 保持 1 min), 以 10 C/min 升至 210 C 柱流速 41 cm/s 注射体积 1 µl 传输线温度 290 C 气相色谱后运行条件反吹装置由压力控制模块 ( 部件号 G ) 控制的吹扫 Ultimate Union( 部件号 G ) 反吹装置条件 3.6 ml/min, 于 300 C 保持 1.3 min 质谱运行条件调谐方式自动调谐 Delta 电子倍增器电压 400 V 采集参数 EI; 选择性反应监测溶剂延迟 6 分钟质谱温度离子源温度 230 C; 四极杆温度 150 C 2

3 样品制备称取 0.5 g 样品于 50 ml 聚丙烯离心管中用 DEA / 水 / 乙腈按体积比 10:40:50 配制提取溶剂, 并取 20 ml 加入到称量好的样品中其中,DEA 能够分离三聚氰胺 - 氰尿酸混合物, 从而降低了假阴性检测的风险 DEA 还提高了三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的溶解度, 而在传统的提取溶剂中, 它们的溶解度是极低的将样品密封好, 进行涡旋混合后经超声波处理 30 分钟然后以 5000 转 /min 或更高的速度下离心分离样品 10 分钟后, 将上层清液通过 0.45 µm 孔径尼龙过滤器过滤衍生处理取 160 µl 滤液到一个 GC 玻璃样品瓶中, 在 70 C 的氮吹蒸发干燥, 加入 600 µl 的 ISTD 和 200 µl 含 1%TMCS 的 BSTFA 样品在注入前, 经涡旋混合, 并在 70 C 下恒温 45 分钟分析参数三聚氰胺及其类似物以及内标的相关分析参数列于表 3 中表 3. 分析参数三重串联四极杆气相色谱 / 质谱联用驻留时间碰撞能量化合物 RT SRM (ms) (EV) 三聚氰胺三聚氰酸一酰胺三聚氰酸二酰胺氰尿酸 DACP (ISTD) ,6-Diamino chloropyrimidine 结果与讨论带 Ultimate Union 吹扫系统的反吹技术反吹技术可以从色谱柱中除去高沸点物质, 通过将后流出的组分从进样口的分流放空口中反吹出去, 而使高沸点组分不经过整个色谱柱, 也不进入 MSD 反吹可以降低化学噪音和分析周期时间, 从而提高检测效率由于减少色谱柱和质谱检测器的维护时间, 系统的正常运行时间也有所增加安捷伦微板流路控制技术模块包括一个专有的解决方案, 能够快速简便地实现反吹, 死体积小, 从而提高分离度该模块还包含垫圈和接头以消除漏气所有微板流路控制技术模块都需要使用辅助电子气动控制 (EPC) 模块或气动控制模块 (PCM) 来提供精确控制的第二气源, 以引导色谱柱气流能流向正确的色谱柱或检测器在正常操作时,PCM 的压力等于或略高于通过色谱柱的载气压力在反吹过程中, 进口压力下降到 1 psi, 而 PCM 压力增加, 从而驱使色谱柱气流反向流经色谱柱, 并吹扫出进样口一个替代反吹的独特方法是在分析柱的中部使用微板流路控制技术装置此时, 采用两个 15 米色谱柱替代 30 米色谱柱, 两个色谱柱由超低死体积吹扫 Ultimate Union 连接 ( 如图 1 所示 ), PCM 则只提供足够的补充气与从第一个色谱柱中的气体流量相匹配由于只有最优的载气流量进入质谱仪, 因此需要增加的气流很小, 不会发生灵敏度降低该配置的反吹过程, 是通过降低第一个色谱柱的流量和压力, 增加第二个色谱柱的流量和压力来完成的图 2 给出了具有吹扫终端配置的反吹的例子图中上端的图谱显示了六个标样, 其中第三个峰被认为是最后一个感兴趣的峰, 第四个峰是第一个高沸点组分干扰物中图显示了 (a) 相同标样在 10.1 分钟开始反吹, 其中流量在第一个 15 米色谱柱中下降,(b) 3

4 不降低灵敏度的快速反吹技术 / 7000A GC/MS 在第二个色谱柱上升 a 和 b 点之间的时间是最后要分析的组分在第二个色谱柱中的停留时间最后的组分被保留, 但后洗脱物不会进入到质谱检测器中下图说明在接下来的空白运行中没有交叉污染或者, 可以在最后一个感兴趣的峰被流出 (b 点 ) 后开始反吹这就避免了需要通过实验来确定最后流出的目标化合物在第二色谱柱中的停留时间, 从而缩短运行时间周期 15 HP-5ms (0.25 mm id 0.25 µm) 15 HP-5ms (0.25 mm id 0.25 µm) 7890A 图 1. 带 Ultimate Union 吹扫的 GC/MS 配置示意图没有交叉污染, 缩短分析周期 a b a = 1 b = 4 ml/min 图 2. 带 Ultimate Union 吹扫反吹示意图上图 : 没有进行反吹中图 :10.1 min 开始反吹 (a) 直到第三个组分从第二色谱柱中洗脱 (b) 下图 : 空白进样显示没有交叉污染 4

5 三聚氰胺及其类似物的分析基于三重串联四极杆 GC/MS 联用系统, 我们开发了一种一次运行就能出色的分离和分析三聚氰胺三聚氰酸一酰胺三聚氰酸二酰胺和氰尿酸的新方法, 且运行时间不到 15 分钟 ( 图 3) 新的三重串联四极杆 GC/MS 法显著提高了检测灵敏度和选择性, 图 4 给出了其与 GC/MS 选择离子检测 (SIM) 的对比新方法能够在 0.25 ppm 灵敏度下对三聚氰胺进行非常干净地定量 MRM 分析, 而不管采用何种 SIM 离子,GC/MS SIM 法都难以在 2.5 ppm 灵敏度下有效地减少化学噪音一次运行分析三聚氰胺及其类似物图 3. 由 SRM 分析得到的重构总离子流色谱 (RTICC), 表明对三聚氰胺及其类似物的分辨率安捷伦三重串联四级杆 GC/MS 联用系统提供卓越的灵敏度和选择性图 4. 分别采用三重串联四极杆 GC/MS(a) 和 GC/MS SIM 法检测豆粉中 0.25 ppm 三聚氰胺的结果对比采用三重串联四极杆 GC/MS 法的定量离子通道为 m/z , 而定性离子通道为 m/z ( 定量离子峰面积的 2.5%) 和 m/z ( 峰面积的 4.8%) 不确定性范围也列于 (a) 中 GC/MS 法中使用的 SIM 离子则为 m/z 和 (b) 5

6 灵敏度与定量在基质 ( 包括婴儿奶粉和豆粉 ) 中分别加入三聚氰胺及其三种类似物的标准品, 浓度分别为和 12.5 ng/ml, 对应于 0.16 到 2.5 ppm 的检测水平并针对每种基质中的四种化合物建立校准曲线图 5 和图 6 表明, 三聚氰胺及其三个类似物的曲线均显示出了极好的线性度,R2 的值非常接近 1.00 表 4 和表 5 表明, 对两种基质中四种化合物的定量准确性也非常高即使在 0.25 ppm 浓度以下, 也可以获得可靠的灵敏度图 5. 在婴儿奶粉中的三聚氰胺及其衍生物的定量校准曲线线性拟合即使在 0.25 ppm 浓度以下, 也可以获得可靠的灵敏度图 6. 在豆粉中三聚氰胺及其衍生物定量的校准曲线线性拟合 6

7 表 4. 婴儿奶粉中的三聚氰胺及其衍生物基于基质匹配标样的定量校准数据标样浓度测试物浓度定量准确度 (ng/ml) (ng/ml) (%) 三聚氰胺聚氰酸一酰胺三聚氰酸二酰胺氰尿酸表 5. 豆粉中基于基质匹配标样的三聚氰胺及其衍生物定量校准数据标样浓度测试物浓度定量准确度 (ng/ml) (ng/ml) (%) 三聚氰胺三聚氰酸一酰胺三聚氰酸二酰胺氰尿酸确认为了确定一套可广泛接受的程序来对限定物质进行科学确认, 欧盟科学家开发了识别点系统分析方法提供的识别点越多, 越能肯定所确认的化合物的存在确定化合物的 MRL 要求有三个识别点当由于化合物的毒性而无法界定其 MRL 时, 则该化合物在所有级别上都是被禁止的这些化合物要求有四个识别点当 GC/MS 需要监测四个离子以提供四个识别点时, 使用三重串联四极杆的 GC/MS/MS 联用仪则只需监测两个选择反应监测 (SRM) 通道利用三重串联四极杆 GC/MS 系统分析三聚氰胺及其类似物需要利用至少两个 SRM 通道, 可以在单次运行中获得有效筛选和完全确认图 7 和图 8 显示了婴儿奶粉和豆粉中的四种化合物 GC 分离的定量和定性离子通道的色谱图每一种情况定性离子都对定量离子进行了归一化处理, 以便从两个离子的轮廓图中能更好的显示出一致的峰形因此, 这些离子轮廓图为每个样品基质中的四种化合物都给出了完全的确认结论为了在一次短时间运行中就实现对三聚氰胺三聚氰酸一酰胺三聚氰酸二酰胺和氰尿酸的筛选定量和确认, 通过应用安捷伦科技公司的三重串联四极杆 GC/ MS 联用系统, 对 FDA 的 GC/MS 筛选方法进行了改进该方法不改变原有的提取或衍生程序, 且其运行周期时间仅约为 15 分钟此外, 该方法符合新的 FDA 测试要求, 即测试灵敏度应达到 0.25 ppm, 并且在 2.5 ppm 的浓度范围内表现出了优异的定量线性, 定量精度达到 97% 以上为了对阳性确认提供有效的识别点, 分别给出了四种化合物的两个 SRM 通道 7

8 安捷伦三重串联四极杆 GC/MS 联用系统能在一次运行中实现确认和筛选 DACP ( ) 图 7. 安捷伦三重串联四极杆 GC/MS 联用系统能在一次运行中实现确认和筛选 : 婴儿奶粉中浓度为 0.78 ng/ml 的三聚氰胺及其类似物的定量离子和归一化定性离子 8

9 安捷伦三重串联四极杆 GC/MS 联用系统能在一次运行中实现快速筛选和确认 DACP ( ) 图 8. 豆粉中浓度为 0.78 ng/ml 的三聚氰胺及其类似物的定量离子和归一化的定性离子 9

10 致谢感谢 Greg Mercer 西北太平洋地区实验室以及食品和药物管理局的指导和在材料方面的援助参考文献 1. U.S. Food and Drug Administration, GC-MS Screen for the Presence of Melamine, Ammeline, Ammelide, and Cyanuric Acid, LIB No. 4423, Volume 4, October H. Prest, C. Foucault and Y. Aubut, Capillary Flow Technology for GC/MS: Efficacy of the Simple Tee Configuration for Robust Analysis Using Rapid Backflushing for Matrix Elimination, Agilent Technologies publication EN. 3. H. Prest, Capillary Flow Technology for GC/MS: A Simple Tee Configuration for Analysis at Trace Concentrations with Rapid Backflushing for Matrix Elimination, Agilent Technologies publication EN. 了解更多信息有关我们产品和服务的更多信息, 请访问安捷伦对本资料中出现的错误, 以及由于提供或使用本资料所造成的相关损失不承担责任本资料中涉及的信息说明和规格, 如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技公司,2009 中国印刷 2009 年 5 月 22 日 CHCN

fundamentals_book.book

fundamentals_book.book Agilent Technologies 安捷伦科技公司版权所有 2002 根据美国联邦政府和国际著作权的有关法律未经安捷伦公司许可和书面授权不得对本书的任何部分以任何形式或手段进行复制包括电子版储存和检索或翻译成外文 G1176-97000 2002 年 5 月第 1 版美国印刷安捷伦科技公司 2850 Centerville Road Wilmington, Delaware 19808-1610