1 : PCR 97 As1.1594) (V. alginolyticus, TrH020801) (V. harveyi, EcGY )(V. anguillarum, E3-11) (Flabobacterium columnare, GQYgc 0711) (Aeromonas

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1 2011 1, 18(1): Journal of Fishery Sciences of China 研 究 论 文 DOI: /SP.J PCR 林 强 1,2, 李 宁 求 1, 付 小 哲 1, 刘 礼 辉 1, 石 存 斌 1 1, 吴 淑 勤 1., ; 2., 摘 要 : (toxin regulations, toxr), TaqMan, toxr, C T, toxr (Ostrea),, CFU/mL 180 CFU /ml 30, 0.95% 1.5 %, PCR, [, 2011,18(1): ] : ; PCR; toxr 中 图 分 类 号 : S94 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : (2011) (Vibrio parahaemolyticus, VP),, [1],,,, [2], [3 4],,,, [5] (MPN),, 3~7 d, PCR, [6] PCR tlh(thermolabile hemolysin) [7] gyrb(gyrase subunit) [8] toxr(toxin regulations) [9] toxr,, PCR ( Vibrio parahaemolyticus) ATCC17802 ATCC33846, (V. cholerae, As1.1833) (V. vulnificus, As1.1758) (V. neresis, As1.1623) (V. campbellii, As1.1597) (V. fluvialis, As1.1610) (V.splendidus, As1.1606) (Listonella anguillarum, As1.1590) (V.o natriegens, As1.1617) (V. natriegen, 收 稿 日 期 : ; 修 订 日 期 : 基 金 项 目 : 863 (2006AA100308); ( ). 作 者 简 介 : (1983 ),,. lin @163.com 通 讯 作 者 : wushuqin001@21cn.com

2 1 : PCR 97 As1.1594) (V. alginolyticus, TrH020801) (V. harveyi, EcGY )(V. anguillarum, E3-11) (Flabobacterium columnare, GQYgc 0711) (Aeromonas hydrophila, LYK080701) (Edwardsiella tarda, GhAn080314) (Streptococcus agalactiae, Lf080802) 1.2 TaqMan GenBank toxr, Vector NTI Suite 9.0 toxr, Premier 5.0, Forward 5 -ATTGACGC CTCTGCTAATGAG-3, Reverse 5 -TACGCAAATC GGTAGTAATAGTG-3, : 5 -(FAM)AG CCGCCTTTAACGACGACTTCTGA(Eclipse)-3 BLAST, 1.3 Premix Ex Taq TM (DRR039A, Takara),,, Premix(Takara) Ex Taq TM ROX Reference Dye (50х), ABI7500 PCR PCR PCR, C T 0.2 μmol/l 0.4 μmol/l 0.8 μmol/l 1.2 μmol/l 0.2 μmol/l 0.2 μmol/l 0.4 μmol/l 0.6 μmol/l 0.8 μmol/l, , DNA,, 1.3 PCR, PCR, 1.5 ATCC17802 DNA,, 180 bp PCR PCR,, PMD18-T(Takara), PCR (Spectrophotometer UV-6000, Metash), 1 μl 10, PCR, 3,, C T 1.6 PCR toxr 10, PCR, 1.6.2, ATCC17802, CFU /ml, 10, 1 ml, bacterial DNA kit DNA ( 50 μl) PCR, [10] 25 g 225 ml3%,, 10 ml 7, ~ CFUATCC17802, 1 ml DNA, PCR, 1.7 PCR ATCC17802DNA 1

3 , C T 30 C T , (Ostrea),,, 25 g,, 3% 225 ml 90 s, 1: 10 1: 10 1 ml, bacterial DNA kit(d , Omega) DNA 1.3 MPN, SN [10], 3, 1 ml 1 ml, 10 mlb,, h, PCR,, 1 gmpn PCR 0.4 μmol/l, C T : Premix(Takara) Ex Taq TM (2 ) 10 μl; PCR Forward Primer(10 μmol/l) 0.4 μl; PCR Reverse Primer (10 μmol/l) 0.4 μl; ROX Reference Dye (50 ) 0.4 μl ; Taqman (10 μmol/l) 0.4 μl; DNA 2.0 μl; 6.4 μl, 20 μl 60, : s; 95 5 s, s( FAM ) 40, 54 min 2.2 toxrgenbank toxr (Spectrophotometer UV-6000, Metash), ng/μl, OD 260 /OD , : /μl 15~ /μl, R 2 = , 3.355, , Eff (%)=98.642% (X) C T : C T = 3.355lg X ( 1) 1 (C T ) Fig.1 Standard curve of Vibrio parahaemolyticus plasmid copies and threshhold cycle (C T ) PCR, ATCC17802 ATCC33846 S, ; 16 S, C T, ( 2), toxr PCR 2.4 toxr, 15 DNA ( 1), 18 CFU /ml( 2), 180 CFU/mL( 2) 2.5 C T, 30 ( 3), C T 23.8, 0.061,

4 1 : PCR 99 2 PCR 1. ATCC17802; 2. ATCC33846; 3.,. Fig.2 Specificity of real-time PCR for Vibrio parahaemolyticus detection 1.VP ATCC17802; 2. VP ATCC33846; 3.Strains with no positive signal including Vibrio cholerae As1.1833, Vibrio vulnificus As1.1758, Vibrio neresis As1.1623, Vibro campbellii As1.1597, Vibrio fluvialis As1.1610, Vibrio splendidus As1.1606, Listonella anguillarum As1.1590, Vibrio natriegens As1.1617, Vibrio natriegen As1.1594, Vibrio alginolyticus TrH020801, Vibrio harveyi EcGY020401, Vibrio anguillarum E3-11, Flabobacterium columnare GQYgc0711, Aeromonas hydrophila LYK080701, Edwardsiella tarda GhAn080314, Streptococcus agalactiae Lf and blank. 0.95% 30 C T, C T 24.18, , 1.5%, PCR 2.6 PCR , PCR, 168, 10 CFU/g, CFU/g 3 11, 72 CFU/g 213 CFU/g 678 CFU/g CFU/g 894 CFU/g CFU/g 408 CFU/g 71 CFU/g 54 CFU/g,, 8, 11 ( 4) MPN 3 CFU/g, CFU/g PCR MPN, PCR MPN ( 3) 3,,, MPN, 3~7 d, tlh gyrase PCR [11 12],, toxr 2, Yung [13] toxr, Tab. 1 表 1 副 溶 血 弧 菌 质 粒 荧 光 定 量 PCR 检 测 的 灵 敏 度 Sensitivity of real-time PCR for Vibrio parahaemolyticus plasmid detection copy number 1 replicate 1 2 replicate 2 3 replicate 3 mean SD :. Note: - represent undected. C T

5 Tab. 2 /(CFU ml 1 ) bacterium concentration :. 表 2 副 溶 血 弧 菌 样 品 荧 光 定 量 PCR 检 测 的 灵 敏 度 Sensitivity of real-time PCR for detection of Vibrio parahaemolyticus samples detect of pure culture of bacteria /(CFU ml 1 ) C T measured concentration detect of simulated Ostrea sample /(CFU ml 1 ) C T measured concentration NTC Note: represents undetected. 3 PCR 30 Fig.3 Results of 30 repetitious Vibrio parahaemolyticus detections by real-time PCR 4 Fig.4 Detection results of Vibrio parahaemolyticus in oyster samples,, toxr,, [9] PCR, toxr PCR,,, C T, 3.355, %, R 2 = , C T 15 DNA, [9] CFU/mL 180 CFU/mL, [9] 21 CFU/mL 210 CFU/mL, [8] 10 CFU/mL 100 CFU/mL Linda [14] PCR, 10 4 CFU/mL, C T 28.29±0.26, 10 3 CFU/mL, PCR,,,, PCR MPN,, PCR MPN

6 1 : PCR 101 表 3 荧 光 定 量 PCR 和 MPN 培 养 法 检 测 牡 蛎 样 品 中 副 溶 血 弧 菌 的 拷 贝 数 Tab. 3 Vibrio parahaemolyticus copy number in oyster samples detected by real-time PCR and MPN culture methods sample PCR real-time PCR detection method MPN MPN culture ND ND ND ND : ND. Note: ND represents no positive signal was detected., MPN, PCR,, PCR MPN, MPN PCR, 8, 11 [15] [16], 6 10, 9, [17 18] DePaola [19], (P<0.05),, (P< , r= 0.51), PCR MPN,,,, 参 考 文 献 : [1] Venkateswaran K, Kiiyukia C, Nakanishi K, et al. The role of sinking particles in the overwintering process of Vibrio parahaemolyticus in a marine environment[j]. FEMS Microbiol Ecol, 1990,73: [2] Akio Y, Jun ichiro I, Varaporn V, et al. Quantitative modeling for risk assessment of Vibrio parahaemolyticus in bloody clams in southern Thailand[J]. Internat J Food Microbiol, 2008, 124: [3] Doyle M P. Foodborne bacterial pathogens[m]. New York: Marcel Dekker Inc, 1989: [4] Altekruse S F, Bishop R D, Baldy L M, et al. Vibrio gastroenteritis in the US Gulf of Mexico region: the role of raw Ostrea[J]. Epidemiol Infect, 2000, 124: [5],,,. [J]., 2007, 22(9): [6] Espy M J, Uhl J R, Sloan L M, et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing[j]. Clin Microbiol Rev, 2006, 19(1):

7 [7],,. TLH TDH[J]., 2007, 22(4): [8],,,. FQ-PCR [J]., 2005, 34(4): [9],,,. toxr PCR TaqMan [J]., 2008, 24(10): [10]. SN [S]. :, 1992: 1 9 [11] Cai T, Jiang L, Yang C, et al. Application of real-time PCR for quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus from seafood in eastern China[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2006, 46(2):180. [12] Jessica L, Michael C L, George M B, et al. Development of a multiplex real-time PCR assay with an internal amplification control for the detection of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus bacteria in ostrea[j]. Appl Environ Microbiol, 2007,73(18): [13] Yung B K, Jun O, Chiho M, et al. Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxr gene[j]. J Clin Microbiol, 1999, 37(4): [14] Linda N, Asim K. Detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of multiplexed real-time PCR with TaqMan fluorescent probes[j]. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(3): [15]. 94 [J]., 2006, 18(3): [16],. 10 [J]., 1998, 1: [17] DePaola A, Hopkins L H, Peeler J T, et al. Incidence of Vibrio parahaemolyticus in US coastal waters and Ostrea[J]. Appl Environ Microbiol,1990, 56: [18] FAD. Draft risk assessment on the public health impact of Vibrio parahaemolyticus in raw molluscan shellfish[z] [19] DePaola A, Jessica L, John C, et al. Seasonal abundance of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus in Alabama oysters[j]. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(3): Development and application of a real-time PCR assay for detection of Vibrio parahaemolyticuss in oyster LIN Qiang 1,2, LI Ningqiu 1, FU Xiaozhe 1, LIU Lihui 1, SHI Cunbin 1, WU Shuqin 1 1. Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou , China; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai , China Abstract: Vibrio parahaemolyticus (VP) is a pathogen that is the leading cause of shellfish-associated cases of bacterial food poisoning. To establish a real-time PCR for quantitative analysis of toxr gene, a pair of specific primers and TaqMan fluorescent probe of toxr gene of VP were designed. The positive recombinant plasmids of toxr gene served as templates to establish standard curve, which showed corresponding relationship between the copies of plasmids and threshold cycle (C T ) values. The lowest limit detection was 15 copies of toxr gene for plasmid, and the sensitivity of pure cultures and simulated oyster sample was 18 CFU/mL and 180 CFU/g, respectively. The coefficient of variation was 0.95% for intra-assay test and 1.5% for inter-assay test. One hundred and sixty eight positively established samples were detected from 178 oysters collected from a farm in Guangdong Province. The result showed that the real-time PCR assay for VP had high specificity, sensitivity, repeatability and it was time saving, so it can be used for detecting and monitoring VP in aquatic products. [Journal of Fishery Sciences of China, 2011, 18(1): ] Key words: Vibrio parahaemolyticus; real-time PCR; toxr gene Corresponding author: WU Shuqin. wushuqin001@21cn.com

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