1 : PCR 97 As1.1594) (V. alginolyticus, TrH020801) (V. harveyi, EcGY )(V. anguillarum, E3-11) (Flabobacterium columnare, GQYgc 0711) (Aeromonas
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1 2011 1, 18(1): Journal of Fishery Sciences of China 研 究 论 文 DOI: /SP.J PCR 林 强 1,2, 李 宁 求 1, 付 小 哲 1, 刘 礼 辉 1, 石 存 斌 1 1, 吴 淑 勤 1., ; 2., 摘 要 : (toxin regulations, toxr), TaqMan, toxr, C T, toxr (Ostrea),, CFU/mL 180 CFU /ml 30, 0.95% 1.5 %, PCR, [, 2011,18(1): ] : ; PCR; toxr 中 图 分 类 号 : S94 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : (2011) (Vibrio parahaemolyticus, VP),, [1],,,, [2], [3 4],,,, [5] (MPN),, 3~7 d, PCR, [6] PCR tlh(thermolabile hemolysin) [7] gyrb(gyrase subunit) [8] toxr(toxin regulations) [9] toxr,, PCR ( Vibrio parahaemolyticus) ATCC17802 ATCC33846, (V. cholerae, As1.1833) (V. vulnificus, As1.1758) (V. neresis, As1.1623) (V. campbellii, As1.1597) (V. fluvialis, As1.1610) (V.splendidus, As1.1606) (Listonella anguillarum, As1.1590) (V.o natriegens, As1.1617) (V. natriegen, 收 稿 日 期 : ; 修 订 日 期 : 基 金 项 目 : 863 (2006AA100308); ( ). 作 者 简 介 : (1983 ),,. lin @163.com 通 讯 作 者 : wushuqin001@21cn.com
2 1 : PCR 97 As1.1594) (V. alginolyticus, TrH020801) (V. harveyi, EcGY )(V. anguillarum, E3-11) (Flabobacterium columnare, GQYgc 0711) (Aeromonas hydrophila, LYK080701) (Edwardsiella tarda, GhAn080314) (Streptococcus agalactiae, Lf080802) 1.2 TaqMan GenBank toxr, Vector NTI Suite 9.0 toxr, Premier 5.0, Forward 5 -ATTGACGC CTCTGCTAATGAG-3, Reverse 5 -TACGCAAATC GGTAGTAATAGTG-3, : 5 -(FAM)AG CCGCCTTTAACGACGACTTCTGA(Eclipse)-3 BLAST, 1.3 Premix Ex Taq TM (DRR039A, Takara),,, Premix(Takara) Ex Taq TM ROX Reference Dye (50х), ABI7500 PCR PCR PCR, C T 0.2 μmol/l 0.4 μmol/l 0.8 μmol/l 1.2 μmol/l 0.2 μmol/l 0.2 μmol/l 0.4 μmol/l 0.6 μmol/l 0.8 μmol/l, , DNA,, 1.3 PCR, PCR, 1.5 ATCC17802 DNA,, 180 bp PCR PCR,, PMD18-T(Takara), PCR (Spectrophotometer UV-6000, Metash), 1 μl 10, PCR, 3,, C T 1.6 PCR toxr 10, PCR, 1.6.2, ATCC17802, CFU /ml, 10, 1 ml, bacterial DNA kit DNA ( 50 μl) PCR, [10] 25 g 225 ml3%,, 10 ml 7, ~ CFUATCC17802, 1 ml DNA, PCR, 1.7 PCR ATCC17802DNA 1
3 , C T 30 C T , (Ostrea),,, 25 g,, 3% 225 ml 90 s, 1: 10 1: 10 1 ml, bacterial DNA kit(d , Omega) DNA 1.3 MPN, SN [10], 3, 1 ml 1 ml, 10 mlb,, h, PCR,, 1 gmpn PCR 0.4 μmol/l, C T : Premix(Takara) Ex Taq TM (2 ) 10 μl; PCR Forward Primer(10 μmol/l) 0.4 μl; PCR Reverse Primer (10 μmol/l) 0.4 μl; ROX Reference Dye (50 ) 0.4 μl ; Taqman (10 μmol/l) 0.4 μl; DNA 2.0 μl; 6.4 μl, 20 μl 60, : s; 95 5 s, s( FAM ) 40, 54 min 2.2 toxrgenbank toxr (Spectrophotometer UV-6000, Metash), ng/μl, OD 260 /OD , : /μl 15~ /μl, R 2 = , 3.355, , Eff (%)=98.642% (X) C T : C T = 3.355lg X ( 1) 1 (C T ) Fig.1 Standard curve of Vibrio parahaemolyticus plasmid copies and threshhold cycle (C T ) PCR, ATCC17802 ATCC33846 S, ; 16 S, C T, ( 2), toxr PCR 2.4 toxr, 15 DNA ( 1), 18 CFU /ml( 2), 180 CFU/mL( 2) 2.5 C T, 30 ( 3), C T 23.8, 0.061,
4 1 : PCR 99 2 PCR 1. ATCC17802; 2. ATCC33846; 3.,. Fig.2 Specificity of real-time PCR for Vibrio parahaemolyticus detection 1.VP ATCC17802; 2. VP ATCC33846; 3.Strains with no positive signal including Vibrio cholerae As1.1833, Vibrio vulnificus As1.1758, Vibrio neresis As1.1623, Vibro campbellii As1.1597, Vibrio fluvialis As1.1610, Vibrio splendidus As1.1606, Listonella anguillarum As1.1590, Vibrio natriegens As1.1617, Vibrio natriegen As1.1594, Vibrio alginolyticus TrH020801, Vibrio harveyi EcGY020401, Vibrio anguillarum E3-11, Flabobacterium columnare GQYgc0711, Aeromonas hydrophila LYK080701, Edwardsiella tarda GhAn080314, Streptococcus agalactiae Lf and blank. 0.95% 30 C T, C T 24.18, , 1.5%, PCR 2.6 PCR , PCR, 168, 10 CFU/g, CFU/g 3 11, 72 CFU/g 213 CFU/g 678 CFU/g CFU/g 894 CFU/g CFU/g 408 CFU/g 71 CFU/g 54 CFU/g,, 8, 11 ( 4) MPN 3 CFU/g, CFU/g PCR MPN, PCR MPN ( 3) 3,,, MPN, 3~7 d, tlh gyrase PCR [11 12],, toxr 2, Yung [13] toxr, Tab. 1 表 1 副 溶 血 弧 菌 质 粒 荧 光 定 量 PCR 检 测 的 灵 敏 度 Sensitivity of real-time PCR for Vibrio parahaemolyticus plasmid detection copy number 1 replicate 1 2 replicate 2 3 replicate 3 mean SD :. Note: - represent undected. C T
5 Tab. 2 /(CFU ml 1 ) bacterium concentration :. 表 2 副 溶 血 弧 菌 样 品 荧 光 定 量 PCR 检 测 的 灵 敏 度 Sensitivity of real-time PCR for detection of Vibrio parahaemolyticus samples detect of pure culture of bacteria /(CFU ml 1 ) C T measured concentration detect of simulated Ostrea sample /(CFU ml 1 ) C T measured concentration NTC Note: represents undetected. 3 PCR 30 Fig.3 Results of 30 repetitious Vibrio parahaemolyticus detections by real-time PCR 4 Fig.4 Detection results of Vibrio parahaemolyticus in oyster samples,, toxr,, [9] PCR, toxr PCR,,, C T, 3.355, %, R 2 = , C T 15 DNA, [9] CFU/mL 180 CFU/mL, [9] 21 CFU/mL 210 CFU/mL, [8] 10 CFU/mL 100 CFU/mL Linda [14] PCR, 10 4 CFU/mL, C T 28.29±0.26, 10 3 CFU/mL, PCR,,,, PCR MPN,, PCR MPN
6 1 : PCR 101 表 3 荧 光 定 量 PCR 和 MPN 培 养 法 检 测 牡 蛎 样 品 中 副 溶 血 弧 菌 的 拷 贝 数 Tab. 3 Vibrio parahaemolyticus copy number in oyster samples detected by real-time PCR and MPN culture methods sample PCR real-time PCR detection method MPN MPN culture ND ND ND ND : ND. Note: ND represents no positive signal was detected., MPN, PCR,, PCR MPN, MPN PCR, 8, 11 [15] [16], 6 10, 9, [17 18] DePaola [19], (P<0.05),, (P< , r= 0.51), PCR MPN,,,, 参 考 文 献 : [1] Venkateswaran K, Kiiyukia C, Nakanishi K, et al. The role of sinking particles in the overwintering process of Vibrio parahaemolyticus in a marine environment[j]. FEMS Microbiol Ecol, 1990,73: [2] Akio Y, Jun ichiro I, Varaporn V, et al. Quantitative modeling for risk assessment of Vibrio parahaemolyticus in bloody clams in southern Thailand[J]. Internat J Food Microbiol, 2008, 124: [3] Doyle M P. Foodborne bacterial pathogens[m]. New York: Marcel Dekker Inc, 1989: [4] Altekruse S F, Bishop R D, Baldy L M, et al. Vibrio gastroenteritis in the US Gulf of Mexico region: the role of raw Ostrea[J]. Epidemiol Infect, 2000, 124: [5],,,. [J]., 2007, 22(9): [6] Espy M J, Uhl J R, Sloan L M, et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing[j]. Clin Microbiol Rev, 2006, 19(1):
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