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1 片段分析原理及应用 Field Application Scientist Tel : / The world leader in serving science 1

2 测序 vs. 片段分析 测序 = 检测 DNA 片段中的碱基序列 片段分析 = 分离荧光标记的片段并检测其相对大小 2

3 片段分析流程 标记引物 5 端 生成荧光标记的 DNA 片段 电 泳 数据分析 ( 大小 ) 标记 ddntp 数据分析 ( 基因型 ) T A G 3

4 片段分析流程 生成荧光标记的 DNA 片段 电 泳 数据分析 ( 大小 ) 数据分析 ( 基因型 ) 4

5 片段分析流程 生成荧光标记的 DNA 片段 分子量标准 电 泳 数据分析 ( 大小 ) 数据分析 ( 基因型 ) 标准曲线 5

6 片段分析流程 生成荧光标记的 DNA 片段 电 泳 数据分析 ( 大小 ) 数据分析 ( 基因型 ) 6

7 片段分析应用 微卫星 /STR 人类鉴定 嵌合体研究 定制微卫星 不稳定性 /RER 相对荧光定量 MLPA QF-PCR SNP 分型 SNaPshot 指纹图谱分析 AFLP TILLING 其他 :B 和 T 细胞克隆研究 7

8 微卫星 /STR Locus X (CA) n CA CA CA CA CA CA CA CA 等位基因 1 等位基因 2 Also known as: STR = Short Tandem Repeat 短串联重复 SSR = Simple Sequence Repeat 简单重复序列 SSLP = Simple Sequence Length Polymorphisms 简单序列长度多态性 VNTR = Variable Number of Tandem Repeats 可变数目串联重复序列 (VNTRs 通常指 碱基重复的小卫星 DNA) 每个重复单位长 2~7 nt 等位基因根据重复数不同加以区别 8

9 Identifiler Kit 试剂盒的主要应用 Identifiler D18S51 TPOX vwa D19S433 D2S1338 D16S539 D13S317 TH01 D3S1358 CSF1PO D7S820 D21S11 D8S1179 FGA D5S818 Amelogenin 亲子鉴定 骨髓移植监测 ( 嵌合体研究 ) 临床样品的同一性认定 失踪人口调查 法医鉴定 - 嫌疑犯证据配型 遇难者辨识 - 残骸鉴定 重罪犯 DNA 数据库 历史调查 9

10 Allelic Ladder 的结果 10

11 Identifiler Kit 结果 11

12 同种异体移植后的嵌合现象 12

13 MSI/RER (microsatellite instability/replication error, 微卫星不稳定性 / 复制错误 ) 正常样品 肿瘤组织样品 微卫星不稳定性是指重复 DNA 序列复制过程中的保真性下降, 常发生在肿瘤细胞中 原因 :DNA 复制过程中错配造成的突变引起 DNA 不稳定性 MSI 造成微卫星位点多态性 复制错误通常被定义为多个微卫星标记或位点的微卫星不稳定性 13

14 基因重排检测 鉴定与 B 和 T 细胞恶性肿瘤相关的特定基因克隆重组 有助于白血病辅助诊断及检测, 评估疾病的复发 14

15 相对荧光定量 片段分析应用领域常用的技术, 比较样本间峰高 ( 或峰面积 ) 常用技术 : MLPA QF-PCR 应用 : 拷贝数变异 (CNV) 染色体数量异常 15

16 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, 多重连接探针扩增技术 ) 1 个 PCR 反应可检测 个基因组 DNA 序列 能鉴别只相差 1 个碱基的序列 用于检测缺失, 插入,CNV 和 SNPs MLPA 也应用于 : mrnas 相对定量 检测已知突变 From 16

17 MLPA 举例 X-linked gene Male CNV 检测 Female Triple X 插入或缺失 From 17

18 MLPA 试剂盒汇总 18

19 染色体数量异常 ( 非整倍体 ) 检测 利用定量分析荧光 PCR 产物峰高的技术分析是临床实验室检测染色体数量异常的常用方法 常见染色体数量异常 :13 18 和 21 号染色体三倍体 21- 三倍体检测 19

20 SNP (Single Nucleotide Polymorphism, 单核苷酸多态性 ) SNP 在人基因组中的发生频率比较高, 大约平均每 300 个碱基中就有 1 个多态位点 与遗传特性, 疾病易感性和药物治疗效果有关 构建高分辨遗传图谱很好的遗传标记 20

21 SNaPshot _SNP 位点检测 ddt ddg ddc Primer Enzyme dda Primer A Template Allele 1 G Template Allele 2 T C Single Base Extension Reaction( 单碱基延伸反应 ) 21

22 SNaPshot _SNP 位点检测 T wt C mut rfu wt rfu wt/mut rfu mut Homozygote = wt Heterozygote Homozygote = mut 22

23 SNaPshot Multiplex System 不同位点的引物带不同长度的尾巴 T T C A A G Primer Template C ddgtp ddctp ddutp ddatp Extend and Terminate Primer G A T A T G C G C T A T A C G C G 大小 = 位点 颜色 = 基因型 23

24 基因功能的验证 TILLING Targeting Induced Local Lesions in Genomes 定向诱导基因组局部突变技术 逆向遗传学方法, 用于鉴定某个基因谱的突变文库 植物学家应用日益增多 流程 : 用化学方法诱导产生突变群体 诱导突变群体扫描 : 核酸内切酶 Cel I 试验 + 电泳分离 + 检测 鉴定目标序列的突变 24

25 TILLING 技术流程 25

26 TILLING 数据 TILLING 技术的应用 拟南芥 Arabidopsis Homoduplex 玉米 maize 水稻 rice Heteroduplex Homoduplex Size = ~590 百脉根 Lotus japonicus 小鼠 mouse 斑马鱼 Zebrafish 果蝇 Drosophila 线虫 C. elegans 26

27 设计片段分析实验 选择片段分析试剂 选择染料组合和光谱校准标准品 选择分子量标准品 PCR (AB 试剂盒或定制引物 ) 电泳 310, 3130 系列,3730 系列, 3500 系列基因分析仪 数据分析 GeneMapper 软件 27

28 提供的染料组合 染料组合 滤光片 Blue Green Yellow Red Orange DS-33 G5 6-FAM VIC NED PET LIZ DS-02 E5 dr110 dr6g dtamra drox LIZ DS-32 F 5-FAM JOE NED ROX - DS-30 D 6-FAM HEX NED ROX - DS-31 D 6-FAM VIC NED ROX - DS-34 C 6-FAM TET HEX TAMRA - 28

29 染料组合与应用类型 染料组合滤光片组合应用类型 DS-02 E5 SNaPshot Multiplex SNaPshot Primer Focus DS-30 D Custom Oligos DS-31 DS-32 DS-33 D F G5 Linkage Mapping Sets v2.5 Mouse Mapping Primers StockMarks Kit* Custom Oligos AmpFlSTR Kits StockMarks Kits AFLP Plant Mapping Kit AFLP Microbial Fingerprinting Kit 5-Dye Linkage Mapping Set v2.5 AmpFlSTR Identifiler Kit Custom Oligos 29

30 荧光标记 PCR 产物 染料标记不影响 PCR 扩增效率 选择的染料组合 A max 相差应该越大越好 更容易进行光谱校准 染料应该越稳定越好 VIC 染料比 HEX 染料稳定 合成应该尽可能容易 比如 :JOE 和 5-FAM 染料合成困难 FGA D5S818 D18S51 TPOX vwa D19S433 D2S1338 D16S539 D13S317 THO1 D3S1358 CSF1PO D7S820 D21S11 D8S

31 分子量标准 分子量标准是什么? 已知大小的染料标记 DNA 片段 和样品同时电泳 分析软件生成分子量标准曲线计算未知样品的片段大小 Basepair Additional Notes: Scan # 若使用 AB 试剂盒, 使用推荐的分子量标准 若是用户自制实验, 根据需要检测的最小和最大片段来选择分子量标准以及合适的染料组合 同一实验用相同的分子量标准 33

32 常用的分子量标准 分子量标准 分子量范围 峰的数目 GeneScan 120 LIZ bp 9 GeneScan 500 LIZ bp 16 GeneScan 600 LIZ bp 36 GeneScan 1200 LIZ bp 68 GeneScan 500 ROX bp 16 34

33 绝对分子量 vs. 相对分子量 片段大小为 bp 是什么意思? 片段的大小是根据分子量标准计算的 染料标记的 DNA 片段不同大小 不同仪器 不同胶 不同长度毛细管 与其他分子量标准 Note: 片段分析产生的片段 只是 相对分子量!

34 运行的样品准备 准备上样混合液 1.0 µl 单一或混合 PCR 产物 ( 如有必要稀释 PCR 产物 ) µl GeneScan 分子量标准 µl Hi-Di 甲酰胺 变性 95 C, 5 min, 置冰上 组装反应板, 并置于基因分析仪上待运行 运行样品, 检验结果 调整 PCR 产物比例 调整 PCR 产物的量 调整反应运行条件 36

35 可能的实验流程 A) 1 x 单重 PCR 反应 B) 1 x 多重 PCR 反应 C) 多管单重 PCR 反应 37

36 1) PCR 产物的比例? 1:1:3 1:3:1 1:3:3 3:1:1 3:1:3 3:3:1 38

37 2) PCR 产物的量? 未稀释 1:4 稀释 1:16 稀释 分子量标准的峰高为 PCR 产物峰高的 % 39

38 3) 样品运行条件? 10 sec at 1 kv 20 sec at 1 kv 30 sec at 1 kv 100 RFU < 峰高 < 4000 RFU 40

39 Questions? 41

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