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铄体灵廖
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1 引物设计和 Primer-BLAST 的应用 Lv Peng

2 CONTENT 1.PCR- 引物设计目的 2. 引物设计原则 3. 设计引物软件 4. 在线设计工具 5.probeBase 简介

3 1.1PCR(Polymerase Chain Reaction) 聚合酶链式反应 1971 Khorana 提出设想 1985 Kary Mullis 发明了 PCR 1986 年 5 月 Mullis 在冷泉港实验室做专题报告冷泉港实验室 (The Cold Spring Harbor Laboratory, 缩写 CSHL), 又译为科尔德斯普林实验室

4 几不同的 PCR 技术 1. 扩增已知序列两侧 DNA 的 PCR: 反向 PCR(Inverse PCR, IPCR) 锚定 PCR(anchored PCR) RACE(Rapid Amplification of cdna Ends) 连接介导的 PCR(ligationmediated PCR,LM-PCR); 2. 检测有限量稀有靶序列, 即一对引物扩增产物不足以以通过凝胶电泳观察到的时 : 巢式 PCR(nested PCR); 3. 快速灵敏特异而准确定量的 PCR: 实时荧光定量 PCR (real-time quantitative PCR,RQ-PCR)

5 1.2 引物设计原则引物特性及优化设计特性优化碱基组成 (G+C) 含量应在 40%-60%,4 种碱基要分布均匀 ; 长度一般为个核苷酸长度上下游引物长度差别不能大于 3bp; 重复和自身互补序列不能有大于 3bp 的反向重复序列或自身互补序列存在 ; 上下游引物互补性一个引物的 3 末端序列不能结合到另一个引物的任何位点上 ; 解链温度 (Tm) 两个引物的 Tm 值相差不能大于 5, 扩增产物与引物的 Tm 值相差不能大于 10 3 末端引物 3 末端碱基尽量为 G 或 C, 不能使 3 末端有 NNGC 或 NNCG 序列引物序列不要有局部的 GC rich 或 AT rich( 特别是 3 端 ), 避开 T/C 或 A/G 的连续结构

6 1.3 常用引物设计软件 Primer Premier 6(P6) Beacon Designer 8(DB)( 自动搜索 ) Oligo 6( 引物评价 ) Vector NTI Suit( 综合分析 ) Primer Express( 实时定量 PCR 引物和探针设计 ) *Omiga *Dnastar

7 1.3.1 Primer 6 和 BD 8 设计引物参数斑马鱼基因 serpine1 : 抑制血管生成和新陈代谢 NCBI Reference Sequence: NM_ Primer Premier 6(PP6) 参数 Tm:57 +2 Length: bp Amplicon Length: bp (G+C)%=40% 60% Beacon Designer 8(BD8) 参数 Tm:66 +2 Length: bp Amplicon Length: bp (G+C)%=40% 60%

8 1.3.2 Beacon Designer 8(BD 主界面 ) 功能选择区设计结构选项序列基本信息序列碱基详细信息窗口引物特征其他信息所有引物和结构选择引物显示区

9 1.3.3 BD 8 操作流程 (1) 序列导入 (2) 参数选择 (3) 结果分析 (4) 引物检验序列名称序列长度 1789 mrna 碱基序列

10 1.3.3 BD 8 操作流程 (1) 序列导入 (2) 参数选择 (3) 结果分析 (4) 引物检验引物长度产物片段长度引物 Tm 值 ΔG 值 :DNA 双链形成时所需的自由能, 反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性应选择 3 端 ΔG 值较低 ( 绝对值不超过 9), 而 5 端和中间 ΔG 值过高, 容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应 ( 能值越高越容易结合 ) GC 含量基本参数高级参数

11 1.3.3 BD 8 操作流程 (1) 序列导入 (2) 参数选择 (3) 结果分析 (4) 引物检验外显子信息得分长度 Tm 值 GC%

12 1.3.3 BD 8 操作流程 (1) 序列导入 (2) 参数选择 (3) 结果分析 (4) 引物检验所有引物引物二级结构同向引物二聚体引物得分降序发夹结构交叉二聚体连续序列 AA 重复序列 GCGC FP:AGTGAAGATGGAGTGGAGGTAG RP:TCTGGCTGGCTGAAGTCTATC

1.4 常用在线设计引物工具 http://www.idtdna.com/site(integrated DNA Technologies) Web Primer:http://www.yeastgenome.

13 1.4 常用在线设计引物工具 DNA Technologies) Web Primer: 酵母基因组数据库提供 ) Primer Design: primer_design/primer_design.htm ( 较基础全面 ) NCBI Primer-Blast 引物设计验证 )

14 1.4.1NCBI Primer-Blast 简介 Primer-BLAST, 能在线设计引物, 并验证设计好的引物整合了目前流行的 Primer3 软件, 同时进行 NCBI 的 Blast 进行引物特异性验证 Primer-BLAST 免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤, 设计好的引物直接用 Blast 进行引物特异性验证并且,Primer-BLAST 能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物这是用来衡量基因在特定组织中特异性表达的重要特征引物设计 Primer 3 Primer- Blast 引物验证 Blast

15 1.4.2NCBI Primer-Blast 引物设计模版链序列或登录号选择上下游引物的范围已设计引物 PCR 产物大小引物 Tm 值热力学参数表盐度修正公式 The Tm calculation is controlled by Table of thermodynamic parameters and Salt correction formula (under advanced parameters). The default Table of thermodynamic parameters is "SantaLucia 1998" and the default Salt correction formula is "SantaLucia 1998" as recommended by primer3 program.

16 外显子连接跨度物种限定检索数据库选择增加物种

17 引物 GC 含量 PCR 产物 Tm 值引物长度最大单核苷酸聚合体最大 3 端稳定性最大 3 端 GC 含量 GC clamp:gc 夹, 在一侧引物的 5 端加上一个 30-40bp 的 GC 结构, 这样在 PCR 产物的一侧可产生一个高熔点区, 使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析能极大提高突变检出率

19 1.4.3NCBI Primer-Blast 引物验证如果你已经设计好了引物, 要验证引物的好坏可以在 Primer-Blast 中进行, 在 Primer Parameters 区填入你的一对引物选择好验证的目标据库 ( 在 specificity check 区选择 ) 根据需要可设置产物的大小,Tm 值等

20 特异性参数选择同前面引物设计

22 1.5 Primer-Blast 小结 (1)Primer-Blast 设计的引物软件设计的引物, 经 Primer-Blast 验证 (2) 数据库是经过专家注释的数据, 这样可以给出更准确的结果特别是 Tm 值 GC 含量计算, 引物二级结构引物互补预测 ; (3) 尽量使用没有冗除的数据库 ( 如 refseq_rna 或 genome database),nr 数据库包括了太多的冗余的序列, 会干扰引物的设计

1.6 probebase 2016 简介 http://probebase.csb.univie.ac.

23 1.6 probebase 2016 简介简介 :probebase is a curated database of rrna-targeted oligonucleotide probes and primers. probebase 是一个针对设计 rrna 的寡聚核苷酸探针和引物的精选数据库主要用于设计 rrna 探针和引物

24 1.6 probebase 2016 功能 Search Search probebase for target organisms, probe names, primers, target sites, references, etc. Match Match rrna sequence(s) against probebase and find all published probes targeting your sequence(s). Proxy Match partial rrna sequence(s) against full-length sequences in SILVA and find published probes potentially targeting your sequence(s). Lists View lists of probes (according to probe categories), primers, microarrays, references, etc. Submission Submit new or missing probes to probebase. Links Websites relevant to ribosomal RNA 高质量 rrna 数据库搜索探针和引物匹配 rrna 序列找探针匹配部分 rrna 序列参考列表提交

25 1.6 probebase 应用实例 1) 菌种鉴定 : 收集已培养或未培养微生物的 16S rrna 序列信息, 常用于鉴定新分离的菌株 probebase 可用来检索与 16S rrna 有关的探针 (2) 原位杂交 :FISH 技术成功应用的关键在于设计和获得具有高灵敏性和专一性的寡核苷酸探针以减少干扰, 可使用 ARB 软件包结合 probebase 数据库等多种方法进行探针分析和设计

26 1.7 参考文献 1.Alexander Loy, Frank Maixner, Michael Wagner and Matthias Horn*(2006)probeBase an online resource for rrna-targeted oligonucleotide probes: new features 2007,Nucleic Acids Research, Vol. 35, D800 D804 Database issue 2. Loy,A., Horn,M. and Wagner,M. (2003) probebase: an online resourcefor rrna-targeted oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res.,31, Jian Ye1*, George Coulouris1, Irena Zaretskaya1, Ioana Cutcutache2, Steve Rozen2 and Thomas L Madden1,Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction, Ye et al. BMC Bioinformatics 2012, 13: 刘驰, 李家宝, 芮俊鹏, 安家兴, 李香真.16S rrna 基因在微生物生态学中的应用. 生态学报, 2015, 35(9):

27 附 1: 反向 PCR(Inverse PCR, IPCR) 反向 PCR 可用于研究与已知 DNA 区段相因此又可称为染色体缓移或染色体步移这时选择的引物虽然与核心 DNA 区两末端序列互补, 但两引物 3 端是相互反向的扩增前先用限制性内切酶酶切样品 DNA, 然后用 DNA 连接酶连接成一个环状 DNA 分子, 通过反向 PCR 扩增引物的上游片段和连接的未知染色体序列, 下游片段

28 附 2: 实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR, RQ-PCR) 1.SYBRGreenⅠ 法 : 在 PCR 反应体系中, 加入过量 SYBR 荧光染料,SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后, 发射荧光信号, 而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步 PCR 产物熔解曲线图 ( 单一峰图表明 PCR 扩增产物的单一性 ) 2.TaqMan 探针法 : 探针完整时, 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 ;PCR 扩增时,Taq 酶的 5-3 外切酶活性将探针酶切降解, 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离, 从而荧光监测系统可接收到荧光信号, 即每扩增一条 DNA 链, 就有一个荧光分子形成, 实现了荧光信号的累积与 PCR 产物的形成完全同步

29 附 3: 微滴式数字 PCR(Droplet Digital PCR, ddpcr) ddpcr 系统在传统的 PCR 扩增前对样品进行微滴化处理, 即将含有核酸分子的反应体系分成数万个纳升级的微滴, 其中每个微滴或不含待检核酸靶分子, 或者含有一个至数个待检核酸靶分子经 PCR 扩增后, 对每个微滴的荧光信号进行逐一分析, 有荧光信号的微滴判读为 1, 没有荧光信号的微滴判读为 0, 根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度

30 THANKS!

实时定量, 定量PCR 探针

实时定量, 定量PCR 探针实时定量 PCR 探针的合成 (Real-time PCR Probes) 名称 2 OD 5 OD 10 OD Taqman probes with Black 元 / 条元 / 条元 / 条 Hole Quencher 5' -FAM and 3'- BHQ-1 600 700 900 5'- HEX and 3'-BHQ-1 750 900 1200 5' -TET and 3' BHQ-1