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十扶
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1 荧光定量 PCR 应用实例上海启因生物科技有限公司

2 1. 概述荧光定量 PCR 技术产生并成熟于上世纪 90 年代, 由于该技术实现了 PCR 从定性到定量的飞跃, 能够对 PCR 反应的全过程进行实时监控, 并且自动化程度高, 所以该技术从产生到现在短短的十几年时间, 在科研及检验领域获得了广泛的应用, 成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术原理 : 荧光定量 PCR 技术是在 PCR 反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号随着 PCR 反应的积累来实时监控 PCR 反应的进程, 并通过分析软件对 PCR 的反应进行检测分析的技术 Page 2

3 2. 应用实时荧光定量 PCR 技术已经广泛地应用于基因表达的定量 ( 细胞因子生长因子转录因子等 ) 和等位基因的鉴定 ( 单核苷酸多态性的检测 ) 等分子生物学基础研究领域同时, 由于其能够快速简便地扩增微量 DNA 序列, 且特异性好灵敏度高和操作简单等特点, 被广泛地用于各种病原体的检测 ( 病毒细菌真菌寄生虫等 ) 的检测监控以及定量分析 Page 3

4 荧光定量 PCR 技术一般应用核酸的定量 (RNA DNA 的定量 ) 核酸定性分析, 如 SNP 分析基因型分析 RNA 变异分析溶解曲线分析 (HRM) Page 4

5 定性分析 : 杂合或纯合子鉴定, SNP 分析, 与疾病相关的等位基因点突变检测绝对定量 : 病毒和病原菌定量分析, 基因拷贝数定量,GMO 定量检测等, 基因表达研究, 转基因食品检测相对定量 :mirna 表达量分析, 基因在不同样本中的表达差异药物疗效考核其他应用 microrna 分析基因拷贝数分析 (CNV) 表观遗传学 ( 甲基化 ) 蛋白质分析肿瘤稀有突变检测 Page 5

6 micro RNA HRM PCR 芯片荧光定量 PCR 在 mirna, PCR 芯片等方面均有较广应用 ; CNV SNP DNA 甲基化 Page 6

7 microrna 研究策略 Page 7

8 非编码 RNA 生物离不开的垃圾 RNA 非编码 RNA 是指不编码蛋白质的 RNA; 包括 :rrna,trna,snrna,snorna,microrna 等 ; 特点 : 从基因组转录但不翻译成蛋白, 在 RNA 水平行使生物学功能 ; 研究工作 :1, 大规模的鉴定新的非编码 RNA;2, 通过各种方法研究非编码 RNA 的功能意义 : 广泛参与生命现象的各个环节, 如生长分化发育免疫, 甚至在肿瘤的形成中也具有重要的调控作用 ; Page 8

9 microrna 热点研究 1993 年在线虫内首次发现 RNA:lin-4 / 其前体大概是 70~100 nt 左右, 形成标准的 stem 结构, 加工后成为 21~23 nt 的单链 RNA / microrna 的作用机制是与 mrna 互补, 让 mrna 沉默或者降解 Page 9

10 microrna 生物学功能 mirna 异常表达可引起 : 动物中 : 发育问题 ; 抑制细胞死亡, 参与脂肪代谢 ; 心脏疾病癌症, 神经紊乱 ; 植物中 : 介导其靶 mrna 降解 ; 近年 microrna 研究热点 : mirna 研究种类及其调控通路疾病类别及诊断和治疗 mirna 的治疗应用 mirna 与干细胞研究相关研究技术 ; Page 10

11 microrna 常用研究方法 Page 11 Northern Blot Microarray qrt-pcr 初始样本量 5-10ug 5ug 1-10ng 敏感度低中等高特异性低中等高动态范围 2logs 4logs 7logs 通量低高中等高实验时间几天几天几小时是否区分前体与成熟 mirna 能否区分序列差别小的 mirna 是, 少数无法否, 需额外步骤是不能不能能 Northern Blot- 基于探针杂交技术 Microarray- 微阵列芯片 Quantitative Real-time PCR- 荧光定量 PCR

12 A: 引物延伸法 B:poly(A) 聚合酶加尾法 C: 茎 - 环状引物反转录法 3 种荧光定量 PCR 技术检测 microrna 原理图 Page 12

13 microrna 检测流程提取总 RNA 加尾反转录引物设计 RT-PCR 扩增数据分析运用 SYBR Green 荧光染料以及 RT-PCR 中,Poly 聚合酶加尾法, 我们可对低至 100ul 的血清 / 血浆样本进行非编码 RNA 片段的高特异性定量检测, 并且还对 517 种 mirna 进行了优化 Page 13

14 CNV 研究策略 Page 14

15 CNV 人类基因组变异研究新热点拷贝数变异 (Copy number variation, CNV) 是一种大小介于 1kb 到 3Mb 之间的 DNA 片段的缺失重复倒位和易位, 广泛存在于基因组中, 被认为个体间基因差异的重要来源特点 : 每个人都有 CNV, 自然发生的基因敲除和增加突变率高, 比 SNP 高万倍致病性,CNV 和疾病间大都为因果关系 ( 而非易感性 ) Page 15

16 CNV 研究意义 CNVs 广泛存在于正常人群基因组 ; CNV 与人类疾病神经和精神系统疾病, 如老年痴呆 ; 免疫系统疾病, 如艾滋病, 红斑狼疮 ; 罕见疾病和遗传病, 如先天性心脏病 ; 其他疾病, 如各种癌症 ; 人类基因组 CNV 图谱 (Conrad 等,Nature 2010) Page 16

测序的覆盖深度会马上显示出片段的增多或缺失, 成本最贵 ; 全基因组测序利用 ABI7900/7300 的绝对定量实时 PCR 系统, 对检测样本的目标基因 (

17 CNV 检测方法覆盖整个基因组, 为高通量分析法,aCGH 一般包括了两方面的杂交 : 细菌人工染色体和寡核苷酸探针 ; 比较基因组杂交 (acgh) 通过比较测试样本的信号强度与其他个体的强度, 而确定每个位点的相对基因组拷贝数 ; SNP 芯片最直接, 当一个地方有片段缺失, 或者片段增多的时候, 测序的覆盖深度会马上显示出片段的增多或缺失, 成本最贵 ; 全基因组测序利用 ABI7900/7300 的绝对定量实时 PCR 系统, 对检测样本的目标基因 ( 具有拷贝数多态 ) 以及参照基因 ( 没有拷贝数多态, 通常每个基因组只有 1 个拷贝 ) 进行绝对定量, 通过比较这两个检测值的比值可以估计检测样本候选基因的拷贝数荧光定量实时 PCR Page 17

18 CNV TaqMan 法 (RT-PCR) 用 TaqMan 测 CNV 原理图 Page 18

19 CNV TaqMan 法 (RT-PCR) 流程 Combine and load plate Run on real-time PCR instrument Analyze with software The complete TaqMan Copy Number Assay workflow takes only 3 4 hours Page 19

20 SNP 研究策略 Page 20

21 SNP 持续不断的热门研究 SNP( 单核苷酸多态性 ) 是由于单个核苷酸改变而导致基因组核苷酸水平上的变异引起的 DNA 序列多态性, 包括单碱基的转换颠换插入缺失等 SNP 研究意义遗传标记, 具有已知性可遗传性可检测性, 用于疾病基因的定位克隆和鉴定 ; 基因多态与疾病相关性 ; 研究 SNPs 本身对机体的影响, 尤其是疾病的易感性个性化医疗 ; Page 21

22 SNP 研究思路 1. 寻找研究相关的 SNP 位点 1) 通过参考资料锁定研究相关的基因, 通过数据库查到基因内部的 SNP 位点 ; 若数据库没有查到相关基因的 SNP 位点, 需要提供实验组样本进行外显子测序比对, 找到 SNP 位点 ; 2) SNP 芯片二代测序检测找到相关 SNP 位点 ; 3) 查找相关的参考文献, 找到研究相关的 SNP 位点 2. 验证 SNP 位点采用对照组和实验组的大量样本, 验证寻找到的实验相关的 SNP 位点 ; 3. 关联性分析根据已有的对照组合实验组的 SNP 分型结果, 与实验目的进行关联分析 1) 与疾病的关联分析等 ; 2) LOH 分析 ; 3) 遗传连锁分析 Page 22

23 SNP 检测方法 SNP 检测技术基于以下 4 种基本原理 : 等位基因特异性杂交 ; 内切酶酶切技术 ; 引物延伸法 ; 寡核苷酸连接反应 ; 测序方法 : 常规测序,Pyrosequencing( 焦磷酸测序 ), 微测序 (SNaPshot) 基于杂交的方法 :Taqman 探针法,Microarray 芯片法, 引物延伸 :MALDI-Tof,dHPLC( 变性高效液相色谱技术 ) 以构象为基础的方法 :RFLP,SSCP,DGGE 溶解曲线 :HRM( 高分辨率溶解曲线分析技术 ) Page 23

24 SNP TaqMan (RT-PCR) 利用 TaqMan 探针分析 SNP 原理图 Taqman 探针技术步骤 : 序列比对 -- 引物和特异探针设计 -- DNA 提取 -- PCR - - 结果分析优点 : 准确度高, 适合样本多位点数量少的检测缺点 : 价格昂贵 ( 探针合成费用高, 并且 DNA 提取引物合成,PCR 扩增均需费用 ), 仅检测已知 SNP 位点, 不能同时发现未知 SNP Page 24

25 SNP TaqMan (RT-PCR) Eg. 运用 TaqMan 探针实时荧光 PCR 技术检测 AKAP10 基因 2073A/G 单核苷酸多态性 * TaqMan 探针实时荧光 PCR 结果不同的等位基因对应不同的荧光, 根据 2 种荧光的不同 Ct 值便可区分出不同的基因型如果是纯合子, 则其中一种荧光占主导, 相对应 Ct 值较小 ; 如果是杂合子, 则 2 种荧光都有, 两者 Ct 值亦相近由于每个样品扩增效率不完全相同, 所以结果显示同一基因型的个体聚集成簇, 而不是一个点另一种常用方法 HRM, 在后面章节有说明 ; Page 25

26 PCR 芯片研究策略 Page 26

27 PCR 芯片概念运用高通量荧光定量 PCR 方法, 在一张 96 孔或 384 孔板上同时对某个信号通路相关的 84 个或 372 个基因的表达量变化进行检测 96 孔板 384 孔板 Page 27

28 PCR 芯片优势及功能优势免去引物设计和实验条件的摸索过程 ; 可以直接了解某信号通路或某疾病中的关键基因, 不需要再检索大量文献和进行前期实验验证 ; 实验结果可进行在线分析, 得出准确的数据分析图 ; 可提供准确而可靠的实验数据, 节约大量的时间和精力生物学功能用于检测某信号通路或某生物学功能相关的一系列重要基因的表达量变化, 即信号通路 Page 28

29 PCR 芯片用于信号通路提供上百种不同信号通路和疾病相关基因功能分类的 PCR 芯片, 种属包括人小鼠大鼠果蝇猪兔鸡等, 格式分为 96 孔和 384 孔两种, 并且还有个性化定制芯片服务 Page 29

30 PCR 芯片研究方法实验流程样品 RNA 提取反转录为 cdna 配制 PCR 反应体系进行 RT- PCR 反应数据分析 RNA 质量检测 ( 分光光度计检测, 琼脂糖凝胶电泳测 RNA 浓度和纯度 ) 按照逆转录酶使用说明将 RNA 逆转录为 cdna 需使用与 PCR Array 配套的 RT² SYBR Green Master mixes 参数设置, 向含有基因特异性引物的 96 孔 /384 孔加入等量的反应液计算 PCR 芯片各个基因的 Ct 值, 采用公认的 ΔΔCt Page 30

31 DNA 甲基化研究策略 Page 31

(Sadenosylmethionine, SAM) 提供甲基, 在 CpG 二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程 DNA

32 DNA 甲基化概念及特点何为 DNA 甲基化? 是在 DNA 甲基转移酶 (DNA Methyltransferase, DNMT) 催化作用下, 利用 S- 腺苷甲硫氨酸 (Sadenosylmethionine, SAM) 提供甲基, 在 CpG 二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程 DNA 甲基化特点不改变 DNA 的一级结构, 但能引起染色质结构 DNA 构象 DNA 稳定性及 DNA 与蛋白质相互作用方式的改变 ; 因此在基因的表达及其调控 DNA 的复制细胞的生长发育 X 染色体失活衰老以及许多人类疾病发生过程中发挥重要作用 Page 32

33 DNA 甲基化生物学功能 DNA 甲基化是基因表达调控中一种常见而又重要的机制, 参与细胞分化与增殖生物体老化肿瘤发生等多种重要生命活动肿瘤生成中的 DNA 甲基化改变模式 ( 取自 Esteller M,Nat Rev Genet 2007, 8(4): ) Page 33

34 DNA 甲基化检测方法根据不同检测方法的原理及其发展先后, 大致可分为三类 : 将 DNA 降解为单核苷酸而后采用化学分析仪器如液相色谱或质谱对甲基化与非甲基化的胞嘧啶进行区分 ; 用序列特异性甲基化内切酶使 DNA 部份降解, 通过 Southern 印迹区分甲基化与非甲基化的相关序列 ; 利用亚硫酸氢钠 (BISULFITE) 预处理 DNA, 直接通过引物延伸反应或耦联其他机制对甲基化与非甲基化的胞嘧啶进行区分 ; 荧光定量 PCR Page 34

35 DNA 甲基化 SYBR Green 使用 MethylScreen 技术, 无需亚硫酸氢盐转化, 适用于信号通路或疾病相关的区域 DNA 甲基化分析可实现单个基因以及疾病和信号通路相关的一组基因中 CpG 岛 DNA 甲基化的快速准确检测, 即甲基化芯片另一种常用方法 HRM, 在后面章节有说明 ; Page 35

36 解密 HRM 研究手段 Page 36

37 HRM 原理和特点原理 HRM( 高分辨率熔解曲线 ) 是一种最新的 SNP 及突变研究工具, 是通过实时监测升温过程中双链 DNA 荧光染料与 PCR 扩增产物的结合情况 HRM 所用仪器 :LightScanner 具体 : 纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线, 得到相似峰形的熔解曲线 ( 包括野生型纯合子或突变纯合子 ); 杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线, 得到不同峰形的熔解曲线 ; Page 37

38 HRM 操作方法 HRM 试验操作流程分 4 个步骤 : 1) 对样本进行 PCR 反应, 需 40 min~2h; 2) 通过溶解设备对 PCR 产物进行热变性并采集数据, 需 5-10min; 3) 通过专业数据分析软件分析, 得出 SNP 的信息 ; 4) 因为热变性不影响遗传信息, 可以继续进行后续试验 ; Page 38

39 HRM 应用基因分型 HRM 技术可以检测 DNA 甲基化 DNA 样品通过亚硫酸氢盐的处理, 将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶这样, 原先未甲基化模板所产生的 PCR 产物比甲基化模板的 Tm 要低 ; HRM 还能确定特定样品中甲基化的比例将不同比例的甲基化和未甲基化 DNA 混合, 制作出标准曲线, 将样品的熔解曲线与之相比较, 从而确定样品中甲基化的比例 ; 甲基化研究 HRM 突变扫描序列匹配 Page 39

40 HRM 应用基因分型甲基化研究 HRM 序列匹配突变扫描 HRM 可以鉴定 SNP 不受碱基突变位点和种类的局限, 不仅能对已知突变进行分析, 而且也能实现对未知突变的筛查扫描和短片段重复序列的分析突变扫描运用饱和染料, 通过对比杂交双链与野生型基因曲线的形状差异来分析检测位点的突变, 这种曲线形状的不同是由极微小的熔解温度变化来实现的, 对比纯合子的标准熔解曲线进行基因突变检测, 就可以比较出突变位点之所在 Page 40

41 总结总之, 荧光定量 PCR 在医学食品环境微生物植物学动物疾病诊断以及分子生物学等都有广泛应用 2.1. 医学领域 RT-PCR 在医学检测中应用主要是对感染性疾病的诊断, 只要有限的核酸序列清楚, 运用此技术可检测任何病原体也可应用于对单基因病和新基因突变病如血友病镰刀状贫血病纤维囊性病以及舞蹈病症等的诊断 2.2. 食品行业可以对食品中致病菌进行检测, 也是检测转基因食品最方便快捷的方法 ; Page 41

42 2.3. 环境微生物采用 RT-PCR 技术检测环境中的微生物病原体, 无需培养可直接取样进行分析, 并且还可用于环境微生物群落结构与群落动态的研究, 可定量检测目标菌类的含量与分布 2.4. 植物学方面转基因植物中基因拷贝数与性状的关系, 监测转基因植物中基因拷贝数的变化, 转基因植株早期的筛选, 监测农作物病虫害抗药性变化, 研究新的药物及方法 Page 42

43 2.5. 动物疾病诊断 RT-PCR 技术可应用在动物营养与繁殖动物遗传育种及动物疾病检测和预防等方面, 还可用于动物疫情监测, 控制疫情的药物及方法的研究, 转基因动物中目的基因拷贝数与品质的关系研究及早期筛选 ; 2.6. 分子生物学在基因表达研究中, 常用的方法有 Northern 印迹 RT-PCR 定量法等, 而 RT- PCR 对 mrna 的检测比 Northern 印迹 RT-PCR 定量法要方便快速准确得多 RT-PCR 方法能检测各种组织细胞中基因的表达丰度, 从而分析基因的表达调控监控 mrna 表达模式检测组织中少量存在的基因跟踪细胞群体中克隆型定量分析基因在不同组织中的转录水平等基因突变及多态性研究 Page 43

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124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na 河南农业科学,2013,42(2):123-127 JournalofHenanAgriculturalSciences PCR PRRSV CSFV PCV2,, (, 450011) : 根据 TaqMan 复合荧光探针设计原则, 应用 Primer5.0 和 Oligo6.0 软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 的特异性引物和探针,