鉴定抗体流程.doc

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募郜
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1 Western blot 标准操作流程试剂的配制 ( 一 ) 母液 1.0mol/L Tris HCl 1000 ml 体积 Tris (MW121.14) 121.1g 蒸馏水 800ml 溶解后, 用浓盐酸调 ph 至所需点 ( 见下所示 ), 最后用蒸馏水定容至 1000ml, 高温灭菌后室温下保存 PH HCl 7.4 约 70ml 7.6 约 60ml 8.0 约 42ml 250ml 体积 Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后, 用浓盐酸调 ph 至所需点 ( 见下所示 ), 最后用蒸馏水定容至 250ml, 高温灭菌后室温下保存 PH HCl 7.4 约 17ml 7.5 约 16m 7.6 约 15ml 9.0 约 10ml 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g 异丙醇溶解后, 分装于 1.5ml 离心管中,-20 保存 0.2mol/L NaH 2 PO 4 NaH 2 PO 4 (MW119.98) 溶解后, 高压灭菌, 室温保存 12g 500ml 0.2mol/LNa 2 HPO 4 Na 2 HPO 4 12H 2 O(MW ) 71.6g 溶解后, 高压灭菌, 室温保存 10%SDS SDS 10g 1000ml 50 水浴下溶解, 室温保存如在长期保存中出现沉淀, 水浴溶化后, 仍可使用 10% 过硫酸铵 (AP) 过硫酸铵 0.1g 1

2 超纯水溶解后,4 保存, 保存时间为 1 周 1.5mol/L Tris HCl(pH8.8) 1.0ml Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200ml 溶解后, 用浓盐酸调 ph 至 8.8, 最后用超纯水定容至 250ml, 高温灭菌后室温下保存 0.5mol/L Tris HCl(pH6.8) Tris (MW121.14) 15.14g 超纯水 200ml 溶解后, 用浓盐酸调 ph 至 6.8, 最后用超纯水定容至 250ml, 高温灭菌后室温下保存 10 PBS(137mM NaCl,2.7 mm KCl,10 mm Na 2 HPO 4,2 mm KH 2 PO 4 ) NaCl 8g 10 KCl 0.2g 10 Na 2 HPO g 10 KH 2 PO g 10 溶于 800 ml ddh 2 O 中, 用浓盐酸调整 ph 至 7.4, 用超纯水定容至 1L, 高温灭菌后室温下保存 20%Tween20 混匀后 4 保存 ( 二 ) 使用液蛋白提取试剂 Tween20 RIPA buffer 蛋白裂解液 50mM Tris-base 1.0 mm EDTA 150 mm NaCl 0.1% SDS 1% TritonX-100 配方一 1% Sodium deoxycholate( 去氧胆酸钠 ) 1 mm PMSF( 现加 ) 蛋白定量试剂 : 20ml Coomassie Brilliant Blue G-250 ( 考马斯亮蓝 G250 溶液 )( 测蛋白含量专用 ): 考马斯亮蓝 G250: 100mg 95% 乙醇 : 50ml 磷酸 : 1000ml 配制时, 先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料, 再加入磷酸和水, 混匀后, 用滤纸过滤,4 保存 0.15 mol/l NaCl NaCl(MW58.44) 0.877g 2

3 100 ml 高温灭菌后, 室温保存 100mg/ml 牛血清白蛋白 (BSA) BSA 0.1g 0.15 mol/l NaCl 1ml 溶解后,-20 保存制作蛋白标准曲线时, 用 0.15 mol/l NaCl 进行 100 倍稀释成 1mg/ml, -20 保存标准蛋白 100μg/ml,200μg/ml,300μg/ml,400μg/ml,500μg/ml,600μg/ml,700μg/ml SDS-PAGE 凝胶电泳 30%(w/v) 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 29g 甲叉双丙烯酰胺 1g 加去离子水, 定容至调整溶液 ph 值不超过 7.0, 置棕色瓶中贮存于室温 10% 过硫酸铵 (-20 保存 ) 过硫酸铵 1g 加去离子水, 定容至 10ml 分装, 每管 1ml, 共 10 管 1.5M Tris-HCl (ph 8.8) Tris 18.2g 滴加 HCl 调 ph 至 8.8 加去离子水, 定容至再次调 ph 至 8.8 1M Tris-HCl (ph 6.8) Tris 12.12g 滴加 HCl 调 ph 至 6.8 加去离子水, 定容至再次调 ph 至蛋白电泳缓冲液 Tris 30g Glycine ( 电泳级 ) 144g ph8.3 SDS 10g 去离子水定容至 1000ml 6 2 SDS loading buffer 成分 0.5M Tris,PH6.8 5ml 20%SDS 4ml β- 巯基乙醇 (2-mercaptoethanol) 1ml 50% 甘油 4ml 溴酚蓝 (bromophenol blue) 4mg ddh 2 O 6ml 考马斯亮蓝染色 - 脱色 0.1% 考马斯亮蓝 R250 染色液 CBB-R g 甲醇 125ml 3

4 乙酸 35ml 去离子水定容至 500ml 过滤, 滤去不溶沉淀, 棕色瓶室温保存蛋白电泳脱色液甲醇 250ml 乙酸 70ml 去离子水定容至 1000ml, 室温保存 Western Blot 蛋白电泳转移液半干浸渍 ( 湿转 ) 24mmol/L Tris(MW:121.14) g 48mmol/L Tris 2.375g 192mmol/L 甘氨酸 (MW:75.07) g 39mmol/L 甘氨酸 11.25g 20% 甲醇 100 ml 20% 甲醇 200ml 去离子水定容至 500ml % SDS 加至 1000 ml 封闭液 ( 含 5% 脱脂奶粉的 TBST 缓冲液 ) 脱脂奶粉 5g TBST (3% 封闭剂 ) 1.5g 脱脂奶粉 +TBS 至 50ml 溶解后 4 保存使用时, 恢复室温, 用量以盖过膜面即可, 一次性使用 TBS 分子克隆 p1571 用 800ml 蒸馏水溶解 8g NaCl,0.2g KCL 和 3g Tris 碱, 调 ph 值至 7.4, 用蒸馏水定容至 1L, 高压灭菌,RT 保存 10 TBS:NaCl 80g,KCl 2g 和 Tris 碱 30g, 调 ph 值至 7.4, 用蒸馏水定容至 1L TBST 缓冲液 ( 含 0.05%Tween20 的 TBS 缓冲液 ) 20%Tween ml TBS 700ml 混匀后即可使用, 最好现用现配 DAB 显色 DAB: 在 45ml 的 0.01mol/L Tris-HCl(pH 7.6) 溶液中溶解 30mg 的二氨基联苯胺, 分装为 900ul/ 支 0.3%(W/V) 的 NiCl 2 :300mg NiCl 2 溶于去离子水定容至, 分装为 1ml/ 支二氨基联苯胺溶液须在临用前配制 900ul DAB+100ul NiCl 2 溶液 +1ul 30%H 2 O 2 操作步骤 : ( 一 ) 蛋白样品制备单层贴壁细胞总蛋白的提取 : 1 倒掉培养液, 并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液 ( 或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走 ) 4

5 2 每瓶细胞加 3ml 4 预冷的 PBS(0.01M ph7.2~7.3) 平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞, 然后弃去洗液重复以上操作两次, 共洗细胞三次以洗去培养液将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上 3 按 1ml 裂解液加 10 µl PMSF(100mM), 摇匀置于冰上 ( PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合 ) 4 每瓶细胞加 400 µl 含 PMSF 的裂解液, 于冰上裂解 30min, 为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动 5 裂解完后, 用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧 ( 动作要快 ), 然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中 ( 整个操作尽量在冰上进行 ) 6 于 4 下 12000rpm 离心 5min ( 提前开离心机预冷 ) 7 将离心后的上清分装转移倒 0.5min 的离心管中放于 -20 保存组织中总蛋白的提取 : 1 将少量组织块置于 1~2ml 匀浆器中球状部位, 用干净的剪刀将组织块尽量剪碎 2 加 400 µl 单去污剂裂解液裂 ( 含 PMSF) 于匀浆器中, 进行匀浆然后置于冰上 3 几分钟后再碾一会儿再置于冰上, 要重复碾几次使组织尽量碾碎 4 裂解 30 min 后, 即可用移液器将裂解液移至 1.5ml 离心管中, 然后在 4 下 1 ( 二 ) 蛋白含量的测定 12000rpm 离心 5min, 取上清分装于 0.5ml 离心管中并置于 -20 保存测定蛋白含量的方法 (Bradford assay,bca 等 ) ( 三 ) 实验流程 1. 制胶 : 夹紧电泳玻板, 按次序灌胶, 分离胶在下层, 浓缩胶在上层 ; 分离胶灌完后, 用水封, 使其表层平整 ; 浓缩胶灌完后, 立即插入上样梳子不同浓度的胶配方一览表分离胶 6%Gel 各种组份名称各种凝胶体积所对应的各种组份的取样量 5ml 10ml 15ml 20ml H 2 O %Acrylamide TEMED %Gel H 2 O %Acrylamide TEMED

6 10%Gel H 2 O %Acrylamide TEMED %Gel H 2 O %Acrylamide TEMED %Gel H 2 O %Acrylamide TEMED % 浓缩胶各种组份名称各种凝胶体积所对应的各种组份的取样量 1ml 2ml 3ml 4ml 5ml 6ml 8ml 10ml H 2 O %Acrylamide M Tris-Hcl(pH 8.8) %SDS %AP TEMED 样品处理 : 样品中加入 1 倍体积的 2 SDS 上样缓冲液, 沸水浴 5min 3. 待胶凝固以后, 放入电泳槽中固定, 加入电泳缓冲液, 将已处理好的样品上样, 接通电源, 电泳时电压为 180V 4. 电泳转移步骤 : (1) 取一块 PAGE 胶, 浸泡于电转缓冲液中, 同时把两张同样大小的 Whatman 滤纸, 两张海绵也浸泡在缓冲液中 (2) 剪一块同样大小的 PVDF 膜, 做如下处理 : 1) 浸于 100% 甲醇溶液中 10 秒 2) 浸于去离子水中 3 分钟 3) 浸于转移缓冲液中 3 分钟 (3) 电转三明治顺序如下 : + 极 ( 白色 ) 海绵 6

7 滤纸 PVDF 膜 PAGE 胶滤纸海绵 - 极 ( 黑色 ) 5. 三明治夹子放入预装有电转缓冲液的电泳槽中, 加盖, 接通电源, 恒压 100V,30min. 6. 完成后的 PVDF 膜用去离子水冲洗一下, 放入 3% 的脱脂奶粉中, 室温 30 min 用洗涤液洗膜 3 次, 每次 5 分钟 7. 加入一抗, 室温 1 小时或 4 过夜用洗涤液洗膜 3 次, 每次 5 分钟 8. 加入酶标二抗, 室温 1 小时用洗涤液洗膜 3 次, 每次 5 分钟 9.ECL 显色 :A 液和 B 液按 1:1 混合, 加到膜上暗室压片 1~10min, 显影液 1min, 定影液 1 min DAB 显色 : 加入配制好的 DAB 显色液, 室温平缓摇动显色, 观察颜色反应, 一旦特异性蛋白带颜色深度达到要求, 即用去离子水漂洗终止颜色反应, 密度扫描并进行拍照凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照, 用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值和光纯药 (WAKO) 官方授权代理机构西宝生物更多 wako 产品推荐, 请访问西宝生物网 : 新品推荐 WAKO 电子版产品英文目录及 SeeBio 最新目录, 请访问网站 : 此外, 我们诚邀代理商加盟 WAKO 产品合作, 互惠互利, 共图发展! 若您有任何其他问题, 请勿吝垂询! 谢谢! 祝 : 好! 张广华上海西宝生物科技有限公司地址 : 上海浦东华夏东路 1866 号 607# 邮编 : 电话 : , , 传真 : sales@cxbio.com http: // http: // 西宝生物网西宝生物作为一家面向生命科学领域, 一直致力于为广大科研和工业用户提供高品质实验室试剂和生产原料的专业进出口公司目前主要从事以下产品的进出口和销售 : 分子生物学试剂生化试剂免疫试剂诊断试剂医药原料及中间体食品添加剂精细化学品实验室耗材仪器设备等产品. 7

实验室常用培养基的配制方法

实验室常用培养基的配制方法 Ampicillin( 氨卡青霉素 )(100 mg/ml) 100 mg/ml Ampicillin 50 ml 配制方法 1. 称量 Ampicillin 置于 50 ml 离心管中 ; 2. 加入 40 ml 灭菌水, 充分混合溶解后, 定容至 50 ml; 3. 用 0.22 µm 过滤膜过滤除菌 ; 4. 小份分装 (1 ml/ 份 ) 后,-20 保存 IPTG(