甲醇 ml 0.02 ml 蒸馏水 ml 0.64 ml

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靠菊丙
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1 Phosbind 丙烯酰胺实验步骤第一部分 Mn2+-Phosbind SDS-PAGE 1 Phosbind SDS-PAGE 试剂的准备丙烯酰胺溶液 Sol. A 30 w/v 丙烯酰胺溶液 30 T 3.3 C 丙烯酰胺 g N N'-亚甲基双丙烯酰胺 g 加入蒸馏水定容至 100mL 过滤保存条件 4 避光分离胶 Sol. B 1.5 mol/l Tris/HCl 缓冲溶液 ph 8.8 4x 分离胶缓冲液 Tris-HCl 缓冲液 Tris 碱 MW 121 在 20 下 pka = g ph mol/l HCl 0.19 equivalents of Tris ml 加入蒸馏水定容至 100mL 过滤保存条件 4 避光浓缩胶 Sol. C 0.50 mol/l Tris/HCl 缓冲溶液 ph 6.8 4x 浓缩胶缓冲液 Tris-HCl 缓冲液 Tris 碱 g ph mol/L HCl 0.96 equivalent of Tris 碱 ml 蒸馏水 ml 用 6.0 mol/l HCl (0.1 ml 左右)调节 ph 至 6.8 加蒸馏水至 100 ml 保存条件 4 SDS 溶液 Sol. D 10% w/v SDS 溶液 SDS g 蒸馏水 ml 搅拌加蒸馏水定容至 100 ml 保存条件 4 Phosbind 丙烯酰胺 Sol. E 5.0 mmol/l Phosbind 溶液含 3% v/v 甲醇溶液 Phosbind 丙烯酰胺 (MW 595) mg 2 mg

2 甲醇 ml 0.02 ml 蒸馏水 ml 0.64 ml 油状产品 Phosbind 丙烯酰胺用 0.1 ml 甲醇完全溶解在小塑料管中该溶液需用移液器加入 3.2 ml 蒸馏水稀释注意如果溶液中出现微量白色粉末状杂质不溶物用 2 ml 离心管离心 2000 x g 10 min 分离即可保存条件铝箔纸包裹管子溶液置于 2 ml 离心管中 4 避光保存 MnCl2 溶液 Sol. F 10 mmol/l MnCl2*溶液 MnCl2(H2O)4 MW g 蒸馏水 ml * 小心不要将锰与镁 Mg 混淆注意不要使用其他阴离子盐如 Mn(NO3)2 或 Mn(CH3COO)2 在碱性水溶液中会形成白色沉淀 Mn(OH)2 并逐渐氧化变成棕色 MnO(OH) 将会使凝胶着色此外 Mn2+的作用会退化 APS 溶液 Sol. G 10% w/v 过硫酸铵溶液 (NH4) 2S2O8 MW mg 蒸馏水 ml 配好的 Sol. G 可以以合适的量分装在-20 下长期储存电泳缓冲液 Sol. H 电泳缓冲液 ph x 溶液 Tris 碱 0.25 mol/l g SDS g 甘氨酸 1.92mol/L g 加蒸馏水至 500 ml 不需加酸或加碱调节 ph 只需在使用前将 450 ml 蒸馏水加到 50 ml Sol. H 中混匀即可保存条件 4 上样缓冲液 Sol. I 上样缓冲液 3x 溶液

3 溴酚蓝 BPB mg SDS g 甘油 ml Sol. C 0.50mol/L Tris/HCl ph ml 2-巯基乙醇 ml 加蒸馏水至 10 ml 保存条件 -20 固定液 Sol. J 蛋白质酸性固定液 1 L 乙酸 L 甲醇 L 蒸馏水 L CBB 染色液 Sol. K 考马斯亮蓝染色液 0.5 L 考马斯亮蓝 CBB g 甲醇 L 乙酸 ml 蒸馏水 L 用甲醇溶解 CBB 再加入乙酸和水也可使用 APExBIO 提供的 Simplyblue Coomassie G-250 Staining Solution 货号 B7938 进行快染漂洗脱色液 Sol. L 漂洗脱色液 1 L 甲醇 L 乙酸 L 蒸馏水 L 2 分离胶的制备分离胶溶液 mol/l Tris 0.1 mmol/l MnCl2 0.1 SDS 以制备 10 ml 含有 12 w/v 聚丙烯酰胺凝胶 50 μmol/l Phosbind Acrylamide 的溶液为例 Sol. A 30 w/v 丙烯酰胺溶液 ml

4 Sol. B:1.5 mol/l Tris/HCl 溶液,pH ml Sol. E:5.0 mmol/l Phosbind 溶液 ml Sol. F:10 mmol/l MnCl 2 溶液 ml *1) Sol. D:10%(w/v)SDS 溶液 ml TEMED( 四甲基乙二胺 ) μl *2) 蒸馏水 ml 搅拌 2 分钟, 去除空气 Sol. G:10%(w/v) 过硫酸铵溶液 μl *2) * 1) 加入的 MnCl 2 溶液是 Phosbind 浓度的两倍 ( 摩尔比 ) * 2)TEMED 和 Sol.G 可用通常使用的浓度, 例如以上的添加量注意 : 请优化 Sol. E(Phosbind) 和 Sol. A( 丙烯酰胺 ) 的浓度参考 5. 优化 Phosbind PAGE 条件例 : 制备 10mL 分离胶溶液 Phosbind 20 μm 50 μm 100 μm Acrylamide 浓度丙烯酰胺浓度 12% 10% 8% 6% 12% 10% 8% 6% 12% 10% 8% 6% Sol. A (ml) Sol. B (ml) Sol. E (ml) Sol. F (ml) Sol. D (ml) TEMED (ml) 蒸馏水 (ml) Sol. G 注意 : 请优化丙烯酰胺胶和 Phosbind 的浓度参考 5. 优化 Phosbind PAGE 条件

5 3 浓缩胶的制备浓缩胶溶液 (0.125 mol/l Tris,0.1% SDS) ( 以制备 10 ml(2 ml)4.5% 的聚丙烯酰胺凝胶为例 ) 括号中显示的是制备 2 ml 所需要的量 Sol. A:30%(w/v) 丙烯酰胺溶液 ml (0.30 ml) Sol. C:0.50 mol/l Tris/HCl 溶液,pH ml (0.50 ml) Sol. D:10%(w/v)SDS 溶液 ml (20 μl) TEMED( 四甲基乙二胺 ) μl (2 μl) *2) 蒸馏水 ml (1.17 ml) 搅拌 2 分钟, 去除空气 Sol. G:10%(w/v) 过硫酸铵溶液 μl (10 μl) *2) * 2)TEMED 和 Sol.G 可用通常使用的浓度, 例如以上的添加量 2i 分离胶的制备 ( 含有低浓度琼脂糖 ) < 以 kda 磷酸化蛋白质的分离为例 > 添加 0.5% 的琼脂糖增加凝胶硬度, 可以制备 3 5% 的低浓度聚丙烯酰胺凝胶分离胶溶液 (0.375 mol/l Tris,0.1 mmol/l MnCl 2,0.1% SDS) ( 以制备 10 ml 含有 3.0% 聚丙烯酰胺凝胶 0.5% 琼脂糖及 20 μmol/l Phosbind Acrylamide 的溶液为例 ) Sol. A:30%(w/v) 丙烯酰胺溶液 ml Sol. B:1.5 mol/l Tris/HCl 溶液,pH ml Sol. E:5.0 mmol/l Phosbind 溶液 ml Sol. F:10 mmol/l MnCl 2 溶液 ml *1) Sol. D:10%(w/v)SDS 溶液 ml TEMED( 四甲基乙二胺 ) μl *2) 蒸馏水 ml 1.5%(w/v) 琼脂糖 *3)*4) ml

6 Sol. G:10%(w/v) 过硫酸铵溶液 μl *2) 在琼脂糖硬化之前直接将琼脂糖倒入凝胶制备台上 * 3) 在加入蒸馏水之后加入琼脂糖, 在微波炉中充分溶解, 它依然很热 * 4) 如有必要, 将移液器吸液头和凝胶制备台预热至 i 浓缩胶的制备含有低浓度琼脂糖浓缩胶溶液 (0.125 mol/l Tris,0.1% SDS) ( 以制备 10 ml( 或 2 ml) 含有 3.0%(w/v) 聚丙烯酰胺凝胶 0.5%(w/v) 琼脂糖的溶液为例 ) Sol. A:30%(w/v) 丙烯酰胺溶液 ml (0.20 ml) Sol. C:0.50 mol/l Tris/HCl 溶液,pH ml (0.50 ml) Sol. D:10%(w/v)SDS 溶液 ml (20 μl) TEMED( 四甲基乙二胺 ) μl (2 μl) *2) 蒸馏水 ml (602 μl) *3) *4) 1.5%(w/v) 琼脂糖 ml (666 μl) Sol. G:10%(w/v) 过硫酸铵溶液 μl (10 μl) *2) 在琼脂糖硬化之前直接将琼脂糖倒入凝胶制备台上 4 样品制备 1) 将样品与 3 μl 溶液 I( 上样缓冲液 ) 混合, 并加入适量的蒸馏水, 使微量离心管中的终体积为 9 μl 2)95 加热 5 分钟, 然后将溶液冷却至室温 3) 使用微量移液器上样 ( 如 :1.5 μl/ 孔 ) β-casein 上样 5 10μg/ 孔, 即可获得清晰的条带

5 电泳 1) 安装好电泳装置, 电泳槽中加入溶液 H( 电泳缓冲液 ) 2) 从浓缩胶中轻轻拔出梳子, 使用微量移液器向每个孔中加样 3) 将引线连接到电源在恒流条件 (25 30 ma/ 凝胶 ) 下跑胶, 直到溴酚蓝 (BPB) 到达分离胶的底部 ( 两块胶时, 以 50 60mA 的电流进行电泳 ) 进行蛋白质印迹时, 电泳迁移后的步骤请参阅下面的第 II 部分 6 CBB 染色脱色

7 5 电泳 1) 安装好电泳装置, 电泳槽中加入溶液 H( 电泳缓冲液 ) 2) 从浓缩胶中轻轻拔出梳子, 使用微量移液器向每个孔中加样 3) 将引线连接到电源在恒流条件 (25 30 ma/ 凝胶 ) 下跑胶, 直到溴酚蓝 (BPB) 到达分离胶的底部 ( 两块胶时, 以 50 60mA 的电流进行电泳 ) 进行蛋白质印迹时, 电泳迁移后的步骤请参阅下面的第 II 部分 6 CBB 染色脱色 1) 电泳后, 将凝胶浸泡在 50 ml 的 Sol. J( 用于固定蛋白质的酸性溶液 ) 中轻轻摇动约 10 分钟 2) 将凝胶浸泡在 50mL 的 Sol. K(CBB 染色溶液 ) 中, 轻轻摇动约 2 小时, 染色凝胶 3) 在 50ml 的 Sol. L( 漂洗和脱色溶液 ) 中漂洗凝胶 3 次, 以除去多余的染色, 直到背景足够干净 4) 拍摄凝胶图片第二部分 Phosbind SDS-PAGE 凝胶用于蛋白印迹的注意事项电泳后, 电转之前, 需要使用螯合剂 (EDTA) 从凝胶中除去锰离子 (Mn 2+ ) 此步骤可提高磷酸化和非磷酸化蛋白转移到 PVDF 膜上的转移效率 1) 电泳后, 将凝胶在含有 1 10 mmol/l EDTA 的普通转移缓冲液中浸泡至少 10 分钟, 同时轻轻摇动 (10 分钟 1 3 次 ) 根据凝胶厚度等调整 EDTA 缓冲液的处理时间和温度 ( 例如 :1.5 mm 厚 : 处理 20 分钟两次 ) 除了转移缓冲液外, 还可以使用 1 电泳缓冲液 2) 接下来, 将凝胶在不含 EDTA 的普通转移缓冲液中浸泡 10 分钟, 同时轻轻摇动 (10 分钟 1 次 ) 强烈推荐使用湿法以实现蛋白从 Mn 2+ - Phosbind acrylamide 凝胶到 PVDF 膜的有效转移 ( 也可以使用半干法 ) 对于 Phosbind 凝胶中的磷酸化目的蛋白, 必须对印迹条件 ( 如时间和温度 ) 进行优化

8 第三部分 Phosbind SDS-PAGE 用于质谱的注意事项无需特殊步骤如 EDTA 处理第四部分问题解答 1 条带弯曲 Phosbind SDS-PAGE 的最常见的问题是条带弯曲特别地确保样品中不含有 EDTA 1 预染的 marker 由于泳道之间盐浓度的差异 marker 和样品的条带均会受影响不要使用预染 marker 我们建议使用碱性磷酸酶处理的样品或您的目的重组蛋白作为磷酸化的阴性对照而不是使用预染 marker 2 酸性样品条带可能弯曲如果溶液为黄色至橙色即使在加入上样缓冲液后请加入 Tris 缓冲液直到其为中性紫色 3 EDTA Mn2+被螯合钒酸无机盐表面活性剂等可引起条带弯曲或拖尾通过 TCA 沉淀或透析脱盐 4 空白泳道空白泳道可能会导致条带弯曲在空白泳道中加入等量的 1x 上样缓冲液 5 钒酸竞争结合磷酸可能导致条带弯曲使用不同的磷酸酶抑制剂或通过 TCA 沉淀或透析除去钒酸 6 将 MnCl2 添加到样品中如终浓度 1 mm 可能改善结果如果样品有 EDTA 残留添加的 Mn2+被螯合而不是凝胶中含有的 Mn2+ 2 低分离度 1 提高 MnCl2 与 Phosbind Acrylamide 的摩尔比可提高分离度如采用 Tris-Tricine 缓冲液作为电泳缓冲液可提高分离度 3 蛋白扩散长时间的恒流转移会导致过热引起蛋白分解和扩散 1 如果要使用恒流进行转移请尝试一些方法如使用低温室在使用前彻底冷却转移缓冲液将

9 冷却剂包裹在转移槽周围 ( 不要使用冰, 因为冰可能导致触电 ) 2) 当可以使用恒定电压时, 以恒定电压转移 ( 如 200 V) 转移速度会减慢, 但热量产生也会被抑制 4 凝胶易碎丙烯酰胺的浓度低会导致凝胶柔软 1)5% 或更高 : 提高 N,N'- 亚甲基 - 双丙烯酰胺与丙烯酰胺的比例 ( 例如 :24:1) 可强化凝胶 2) 加入 3 5% 琼脂糖强化凝胶 5 转膜困难 1)EDTA 处理不够充分延长处理时间, 增加含 EDTA 缓冲液的更换频率 ( 如 20 分钟 2 次 ), 或在 EDTA 处理过程中充分摇动 2) 加强电流可能会提高效率 ( 如 200 ma) 3) 除负染以外的染色如 CBB 染色可能会降低转移效率 4) 使用低浓度的凝胶可提高转移效率 5) 采取一些方法, 如使用较厚凝胶增加样品使用量等 6) 含 SDS 的转移缓冲液可提高转移效率当转移到膜上时, 直接将 SDS 溶液加入到转移缓冲液以防止起泡 ( 槽法 ), 或在 EDTA 处理和转移之间, 将凝胶浸入含有 SDS 的转移缓冲液中并缓慢摇动 ( 如 10 分钟 x1 次 ) SDS 的试验浓度为 % 6 染色的背景较高 EDTA 处理消除凝胶中的金属离子后再染色 7 由蛋白质降解引起的条带迁移, 而不是由磷酸化诱导进行常规 SDS-PAGE( 含有 0 μm 的 Phosbind), 验证没有发生条带迁移第五部分 Phosbind PAGE 条件优化为了使用 Phosbind PAGE 获得高质量的结果, 需要优化丙烯酰胺和 Phosbind Acrylamide 的浓度首先优化丙烯酰胺的浓度 (1), 其次是 Phosbind Acrylamide 的浓度 (2)

10 1 优化丙烯酰胺的浓度首先, 确定进行常规 SDS-PAGE 时目的蛋白迁移到凝胶最底部的最佳丙烯酰胺 * 浓度在 Phosbind PAGE 中, 迁移速度比常规 SDS-PAGE( 包括非磷酸化蛋白质 ) 慢, 因此应检测丙烯酰胺的浓度 ( 见下图 ) 随着 Phosbind 浓度的增加, 迁移速度变慢 *: 进行凝胶电泳, 直到上样缓冲液中含有的 BPB 染料到达分离胶的底部 BPB 染料的位置可以定义为 1.0 的 Rf 值在上述运行条件下, 调整丙烯酰胺的最佳浓度当您的目的蛋白在常规 SDS-PAGE 中迁移条带 Rf 值为 0.8 至 0.9 时, 对于 Phosbind SDS-PAGE, 丙烯酰胺的浓度是最佳的指示最佳浓度超过 60 kda:6%; 小于 60kDa:8% < 高分子量蛋白的情况 > 向少于 4% 丙烯酰胺的凝胶中加入琼脂糖, 可以增加凝胶硬度有报道分离 350 kda 的数据 ( 请参阅第六部分常见问题解答中的 Phosbind Acrylamide 的分离 ) 此外, 还可以通过增加 N,N'- 亚甲基双丙烯酰胺的含量 ( 如 5% 丙烯酰胺 [24:1]) 来提高凝胶硬度 2 优化 Phosbind Acrylamide 的浓度其次, 优化 Phosbind Acrylamide 的浓度请依次从最低到最高摸索出最佳浓度如 :20 μm 50 μm 100 μm 细胞裂解液如果您的样品中含有多种蛋白 ( 如细胞裂解液 ),Phosbind 的浓度应在 5 至 25 μm 之间然而, 如果目的蛋白浓度较低 ( 如非过表达体系 ), 则建议使用较高浓度, 如 100 μm 最佳浓度取决于蛋白请根据每个目的蛋白的具体情况摸索合适的条件 Phosbind 浓度越高, 分离能力更好? 通常情况下, 浓度较高时分离能力更好 ( 左图为 50 μm 和 100 μm 的 Mn 2+ -Phosbind 的比较 ) 但是高浓度会降低蛋白电泳速度有时低浓度的 Phosbind 分离能力反而更好 ( 右图为 50 μm 和 150 μm

Mn 2+ -Phosbind 分离卵白蛋白的比较 ) 两条带间的距离 : *:α-casein:50 μm < 100 μm *:ovalbumin: 50 μm > 150 μm 请根据目的蛋白的具体情况调整最佳浓度 -: 磷酸化蛋白 ;+: 非磷酸化蛋白 ( 碱性磷酸酶处理 ) 第六部分常见问题解答 1)Q: 使用此产品可以分离多大 (kda) 的蛋白?

11 Mn 2+ -Phosbind 分离卵白蛋白的比较 ) 两条带间的距离 : *:α-casein:50 μm < 100 μm *:ovalbumin: 50 μm > 150 μm 请根据目的蛋白的具体情况调整最佳浓度 -: 磷酸化蛋白 ;+: 非磷酸化蛋白 ( 碱性磷酸酶处理 ) 第六部分常见问题解答 1)Q: 使用此产品可以分离多大 (kda) 的蛋白? A: 已经有报道使用 20 μm Phosbind 3% 丙烯酰胺和 0.5% 琼脂糖 * 分离了 350 kda 的磷酸化蛋白 * 加入琼脂糖以增加凝胶强度 2)Q: 如何改善分离度? A: 通常情况下,Phosbind 浓度越高, 分离能力越好然而, 增加 Phosbind 的浓度也导致蛋白质整体的迁移速度成比例地下降 3)Q: 是否可以使用 CBB 以外的凝胶染色技术? A: 是的, 凝胶也可以通过负染银染和荧光染色进行染色 4)Q: 凝胶容易破裂, 我该怎么办? A: 丙烯酰胺的浓度低会导致凝胶柔软可以通过提高亚甲基双丙烯酰胺与丙烯酰胺的相对比例 ( 如 24:1) 解决这个问题 5)Q: 配制好的含 Phosbind Acrylamide 的凝胶可以存放多久? A: 凝胶会在几天内变质, 因此建议现用现配 6)Q: 溶于甲醇和水的母液可以保存多久? A: 据报道, 冷藏避光条件下保存 6 个月, 效果无明显下降据使用该产品的博士研究生说, 溶液可

12 以保存 1 年没有任何问题 7 Q 按照实验流程中的方法配制 Phosbind 溶液结果出现混浊这正常吗 A 正常混浊是由甲醇造成的静置一会儿溶液就会变得澄清 8 Q 可否仅用水来溶解 Phosbind A Phosbind 溶于水虽然与溶解在含甲醇的水中相比需要更多的时间如果不能完全溶解离心取上清使用 9 Q 可使用哪种预染 marker A Phosbind 凝胶使用预染 marker 常常导致条带弯曲在含有该 Marker 的溶液和其他溶液之间至少需要留一条空白泳道 10 Q 磷酸化反应液中存在 ATP 是否会对电泳造成影响 A 浓度为 2.0 mm 的 ATP 没有什么特别的影响使用上限还不清楚 11 Q 在 Phosbind SDS-PAGE 中出现条带迁移如何确定这是磷酸化的象征还是蛋白降解造成的 A 请进行常规 SDS-PAGE 不加 Phosbind 验证蛋白完整性 12 Q Phosbind 可用来分离 DNA 吗 A 请参阅以下文章 A SNP genotyping method using phosphate-affinity polyacrylamide gel electrophoresis, Analytical Biochemistry, 361, (2007), E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike (The phosphate group at DNA-terminal is efficiently captured by Zn2+ Phos-tag.) A mobility shift detection method for DNA methylation analysis using phosphate affinity polyacrylamide gel electrophoresis, Analytical Biochemistry, 378, Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita, and T. Koike (2008), E.

目录一原理与应用...3 二 Phos-tag Acrylamide 介绍...4 三实验流程...5 四疑难问题...9 五 Phos-tag PAGE 条件优化...10 六应用与参考文献...11 七 FAQ...14 八 SuperSep Phos-tag...18 九 Phos-tag

目录一原理与应用...3 二 Phos-tag Acrylamide 介绍...4 三实验流程...5 四疑难问题...9 五 Phos-tag PAGE 条件优化...10 六应用与参考文献...11 七 FAQ...14 八 SuperSep Phos-tag...18 九 Phos-tag Phos-tag 实验指导手册第二版目录一原理与应用...3 二 Phos-tag Acrylamide 介绍...4 三实验流程...5 四疑难问题...9 五 Phos-tag PAGE 条件优化...10 六应用与参考文献...11 七 FAQ...14 八 SuperSep Phos-tag...18 九 Phos-tag 系列产品...19 十相关产品...20 Phos-tag SDS-PAGE