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醇郝
7 years ago
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1 综合性设计性实验指导手册 ( 安徽医科大学卫生毒理学系编写 ) 引言毒理学是一门研究外源因素 ( 包括物理因素化学因素和生物因素等 ) 对机体的损害作用及其机制, 并进行安全性评价和危险度管理的科学毒理学既是一门基础学科, 也是一门应用学科随着社会生产的发展, 人类使用和接触到的环境有害因素种类繁多, 总数可能接近 1000 万种为了保护环境促进健康和防治疾病, 目前急需大量的毒理学实验来研究环境有害因素对机体的损害作用及其生物学机制毒理学也是一门以动物实验为中心的实验科学, 其中动物实验仍是当前研究环境有害因素对机体损害作用及其机制的重要方法, 即通过环境有害因素对实验动物的毒性效应, 然后逐步向人外推, 以期评估环境有害因素对人体的安全性和危险性所以, 毒理学动物实验的设计实施结果观察和评价是毒理学研究的基本功传统毒理学实验主要由一次次单项实验组成, 大多数实验之间无相互关联, 且这些实验均是在教师精心设计下, 实验员老师在每次试验前充分准备受试动物试剂和实验器材, 甚至部分实验的动物染毒也是由老师负责完成在这些独立实验中, 学生每次在授课教师示教后负责完成每次试验的中间操作过程, 而对每次试验的现实意义和实验的技术要点很难在短时间内领会, 原因是实验前后思考不足, 更有可能是长期的思维定势仅仅要求学生模仿示教动动手即可, 学生整体动脑内容太少, 学生的学习积极性未能调动起来, 直接后果是不能把枯燥的毒理学基础理论知识和实践内容联系起来, 使学生对毒理学基础理论的掌握和理解就很匮乏, 更不要说对毒理学产生兴趣, 这也导致学生在近年来考研志愿填写中不能把毒理学放在优先选择的位置的可能原因综上, 传统毒理学实验远远不能满足当前的社会需求为了培养学生发现问题分析问题和解决问题的能力, 熟悉毒理学全套毒理学动物实验流程, 本学科系决定在预防医学专业优先开设综合性设计性实验教学课程改革 1

制毒理学也是一门以动物实验为中心的实验科学, 其中动物实验仍是当前研究环境有害因素对机体损害作用及其机制的重要方法, 即通过环境有害因素对实验动物的毒性效应, 然后逐步向人外推, 以期评估环境有害因素对人体的安全

2 综合性实验是指在学生具有一定基础知识和基本操作技能的基础上, 运用某课程的综合知识对学生实验技能和实验方法进行综合训练的一种复合性实验, 其主要目的是对学生的实验技能进行综合训练, 培养学生的实验动手能力数据处理查阅资料以及综合分析问题的能力而设计性实验是指给定实验目的实验要求和实验条件, 由学生自行设计实验方案准备实验仪器和试剂并加以实现的实验, 其主要目的在于激发学生学习的主动性和创新意识, 培养学生独立思考综合运用知识提出问题和解决复杂问题的能力本次综合性设计性实验的基本方案如下 : 1 实验准备阶段 : 帮助学生学会毒理学实验的设计方法和掌握毒理学实验的基本技术, 详见实验一 ; 2 实验实施阶段 : 学生自主完成对乙酰氨基酚的 LD 50 测定对乙酰氨基酚诱导小鼠急性肝损伤模型的建立小鼠血清丙氨酸氨基转移酶活力检测小鼠肝脏组织切片 HE 染色及其评价小鼠肝脏组织还原型谷胱甘肽含量测定和小鼠肝脏组织丙二醛含量测定等试验, 详见实验二至实验七 ; 3 实验总结报告 : 学生及时对以上七项系列试验结果进行整理和统计分析, 评价对乙酰氨基酚致小鼠急性肝损伤的剂量 - 效应关系以及可能的作用机理, 并撰写一篇学术论文, 详见实验八通过本次综合性设计性实验的开展, 可以让学生全面了解对乙酰氨基酚致小鼠急性肝脏损伤及其作用机制探讨的全过程, 熟悉研究设计流程和各种实验的技术要点, 激发学生的学习的主观能动性, 培养学生分析问题和解决问题的能力, 提高学生的实验操作技能, 增强学生的团队协作意识和创新意识, 从而达到综合性和设计性实验开展的多重目的实验一毒理学实验相关理论知识介绍和实践指导一毒理学实验相关理论知识介绍 ( 一 ) 实验设计原则 1. 随机化 : 动物实验中通过对实验动物随机化分组, 达到各组动物在处理前各方面均衡, 以排除处理外因素对实验结果的干扰一般根据体重蛇形分组, 2

综合运用知识提出问题和解决复杂问题的能力本次综合性设计性实验的基本方案如下 : 1 实验准备阶段 : 帮助学生学会毒理学实验的设计方法和掌握毒理学实验的基本技术, 详见实验一 ; 2 实验实施阶段 : 学生自主完成对乙酰氨

3 也可严格按照随机数字表掷硬币等方法随机化分组 2. 对照 : 在动物实验中, 要求相互比较的各组间动物的种类性别年龄和体重等尽可能一致对照组在毒理学实验中与实验组同等重要, 两组的动物数应相等一般分阴性对照组和阳性对照组, 前者包括空白对照溶剂对照或自身对照等, 作用是作为实验组结果的参照和对比 ; 后者也称为标准对照, 作用是判断整个实验系统有无问题和动物的敏感性等 3. 重复 : 要使实验结果正确可靠, 建议执行重复原则重复的含义包括两个方面 : 足够大的样本数得出的实验结果 ; 不同次实验结果的可重复性 4. 盲法 : 在毒理学实验中, 有时也要贯彻盲法原则, 避免实验者主观因素引起实验结果的偏倚包括单盲双盲和三盲, 前两者在毒理学实验中较常用 ( 二 ) 实验设计内容 1. 明确实验目的 : 按照任务要求, 必须明确要解决的关键问题, 涉及问题不能太多 2. 查阅文献 : 查阅国内外与本实验内容有关的文献专著, 了解有关理论和实验操作方法, 借鉴前人经验 3. 具体实验设计内容, 包括确定动物品系和数量, 选择实验观察指标, 实验动物如何分组, 选择染毒方式设计染毒剂量, 根据实验设计选择相应的统计学处理方法制定实验计划等 4. 进行预实验 : 通过小样本预实验, 评价观察指标的可行性, 熟练实验操作技术, 改进实验方法, 初步探索染毒剂量大小和反应 ( 效应 ) 的关系, 以便确定正式实验中可行的剂量和分组 5. 编制实验记录表, 便于后续实验结果的整理和统计分析 6. 统计分析和撰写报告 : 及时整理实验结果, 进行统计处理, 撰写论文报告 ( 三 ) 动物实验的职业道德动物实验管理条例规定对待实验动物必须爱护, 不得戏弄或虐待进行动物实验须遵循 4R 原则, 即 Replacement 替代 Reduction 减少 Refinement 优化和 Responsibility 责任心 ( 四 ) 动物实验基本操作技术 3

是作为实验组结果的参照和对比 ; 后者也称为标准对照, 作用是判断整个实验系统有无问题和动物的敏感性等 3.

4 1. 动物管理 : 每天写试验记录, 包括动物的饲养健康状况气候条件 ( 气温气湿光照通风 ) 及突发事件的管理等 2. 受试物和样品的准备 : 应了解受试物的纯度及杂质成分, 了解受试物的化学结构和理化性质, 特别是其挥发性 ( 熔点 / 沸点 ) 溶解性 ph 稳定性 ( 包括受试物在赋形剂中的稳定性 ) 受试物在贮存期内稳定性和在饲料中的稳定性必须进行研究并报告受试物应一次备齐全部实验的用量所需受试物总量 = (A B C D) 1.2 式中 :A 为每组动物数 ;B 为各处理组的剂量和 ( 如 mg/kg= 1.4mg/kg);C 为染毒次数 ( 通常为天 );D 为动物的平均体重 ; 1.2 为安全因子, 包含损耗量对水溶性受试物, 体内试验首选的溶剂为水 ( 经口染毒 ) 和等渗盐水 ( 胃肠道外染毒 ); 水不溶性受试物应溶于或悬浮于适当的有机溶剂中, 天然植物油 ( 如玉米油, 橄榄油 ) 混悬液最常用的赋形剂为 0.5% 羧甲基纤维素钠或 10% 阿拉伯树胶受试物溶液应新鲜配制, 除非已证明贮存稳定 3. 动物性别区分 :(1) 大小鼠 : 最常用方法是根据生殖器与肛门的距离大小, 也可由生殖器大小有无肛毛成年雌鼠的乳房发育情况及成年雄鼠的睾丸下降情况 ;(2) 家兔 : 把生殖器附近的皮肤扒开, 即可见一圆孔中露出圆锥形向下弯曲的阴茎 ( 幼兔为凸起物 ), 可见一朝向尾部的长缝, 呈椭圆形间隙, 此为阴道开口处 4. 编号称重及分组 :(1) 编号 : 按顺时针方向由右到左依次是头顶右前肢右腰右后肢尾根左后肢左腰左前肢背部, 其中咖啡色表示百位红色表示十位黄色表示个位 (2) 称重 : 以 g 为单位 (3) 分组 : 按照体重大小随机分组 5. 动物抓取及固定 :(1) 小鼠 : 把小鼠尾中部或基部抓住提取, 也可用带橡皮的镊子夹住小鼠的尾部 ; 在粗糙平面或笼子上用右手提尾稍向后轻拉, 用左手大拇指食指中指抓住耳后颈部皮肤, 用左手无名指小指及大鱼际肌夹住背部皮肤和尾根, 然后调整姿势使小鼠腹部朝向操作者, 即可固定操作 (2) 大鼠 : 张开左手虎口, 把拇食指插入大鼠的腋下, 虎口向前, 余三指及掌心握住大鼠身体中段, 使其保持仰卧位, 再用左拇指紧抵在下颌骨上 ; 用拇指食指捏住大鼠耳朵头颈部皮肤, 另外三指紧捏住背部皮肤, 置于掌心, 调整姿势即可 4

进行研究并报告受试物应一次备齐全部实验的用量所需受试物总量 = (A B C D) 1.2 式中 :A 为每组动物数 ;B 为各处理组的剂量和 ( 如 0.1+0.3+1.0mg/kg= 1.4mg/kg);C 为染毒次数 ( 通常为天 );D 为动物的平均体重 ; 1.

5 操作 (3) 家兔 : 轻轻打开笼门, 右手从兔头前部把两耳轻压于手掌内, 使其卧伏不动, 抓住颈背部皮肤提起, 并用左手托住兔腹部 ; 由助手用一只手抓住颈背部皮肤, 另一只手抓住两后肢, 固定在试验台上, 即可进行操作 6. 灌胃操作 : 小鼠抓取固定后, 开始进针, 一般深度为从口角至剑突下 ( 大小鼠进针深度分别为 4~6 cm 2.5~4 cm; 给药容积分别为 1~4 ml 0.2~1 ml), 灌胃针头由小鼠口角侧插入, 沿上腭壁缓慢滑入食管, 一旦感觉阻力消失, 可深至胃部, 给药后缓慢拔出针头若遇挣扎抵抗, 则停止进针或拔出针头关键 : 固定动物上消化道拉 / 压直沿口角进针 7. 静脉注射 : 小鼠采用尾静脉注射, 具体方法为先固定好小鼠尾部, 再通过酒精擦浴或 50 温水热敷以充分暴露静脉, 然后以 20 度的角度进针, 进针后回抽见血即可注射 ; 兔采用外侧耳缘静脉注射关键是热敷使血管扩张固定小鼠 8. 小鼠眼眶静脉丛取血 : 固定小鼠使眼球外露后即可用毛细吸管从眼眶内眦处以 45 度角刺入, 捻转前进, 右手持容器收集血液, 毛细管拔出后, 用干棉球压迫止血 ; 小鼠摘眼球取血 : 抓取小鼠双耳颈部皮肤, 致眼球突出, 然后摘取眼球, 放血至预先准备的 1.5 ml 离心管中 9. 动物的处死方法 : 颈椎脱臼法空气栓塞法放血法药物法断头法等目的是处理患病动物, 保护健康动物 ; 中断试验而淘汰动物 ; 试验结束后作进一步检查需要原则是减少痛苦缩短致死时间注意试验人员安全方法易操作不能影响动物试验结果 10. 解剖小鼠取脏器并求其脏器系数 : 先给小鼠称重, 然后用颈椎脱臼法处死小鼠, 再开胸开腹取脏器 ( 心肺胸腺肝肾脾肾上腺睾丸 / 子宫 ) 并称重 ( 五 ) 优良实验室规范 (GLP) GLP, 广义上是指严格实验室管理 ( 包括实验室建设设备和人员条件各种管理制度和操作规程, 以及实验室及其出证资格的认可等 ) 的一整套规章制度 GLP 是针对药品食品添加剂农药化妆品及其他医用物品的毒性评价制订的管理法规根据国际惯例,GLP 专指毒理学安全性评价实验室的管理 GLP 的各个环节又可分别称为硬件 ( 建筑设施仪器等 ) 和软件 ( 人员素质 5

2~1 ml), 灌胃针头由小鼠口角侧插入, 沿上腭壁缓慢滑入食管, 一旦感觉阻力消失, 可深至胃部, 给药后缓慢拔出针头若遇挣扎抵抗, 则停止进针或拔出针头关键 : 固定动物上消化道拉 / 压直沿口角进针 7.

6 标准操作规程质量保证 ) GLP 的要点是 : 对组织机构和人员的要求 ; 对实验设施仪器设备和实验材料的要求 ; 标准操作规程 (SOP); 对研究工作实施过程的要求 ; 对档案及其管理工作的要求 ; 实验室资格认证及监督检查 ( 六 ) 标准操作规程 (SOP) SOP 是为了有效地实施和完成非临床研究而针对每一工作环节或操作制定的标准和详细的书面规程 SOP 种类 : 受试物及对照物质管理 ; 设施内的仪器或设备的检修维修 ; 动物饲养设施的完善 ; 试验动物的饲养及管理 ; 试验动物一般体征等的观察 ; 试验动物操作检查测试及分析 ; 濒死及死亡动物的处理 ; 动物的解剖及尸体的解剖检查 ; 标本的采集及识别 ; 组织病理学检查 ; 原始数据的管理 ; 质量保证部门的任务 ; 试验就业人员的健康检查 ; 其它必要的事项 ( 七 ) 如何获得客观可靠的真实结果? 1. 实验人员态度端正, 要对实验结果负责任 ; 2. 实验过程中贯彻随机化对照重复和盲法原则 ; 3. 要熟悉和掌握各种实验操作技能, 避免技术问题影响实验结果 ; 4. 排除环境因素化学物因素和机体因素对实验结果的影响 ; 5. 不断总结实验细节 ; 6. 与重要文献资料或其它实验室结果相比对, 若不一致, 一定要追究其原因 ; 7. 下结论要谨慎, 毕竟动物实验结果外推到人尚存在一些不确定因素二观摩教学录像让全体学生观摩毒理学试验基本技术和方法教学录像三教师全程辅助指导和培训本次综合性设计性实验中, 贯彻学生为主体, 教师全程仅辅助指导学生, 让学生从多项系统的设计实验准备实验实施实验和总结实验等过程中真正发现问题分析问题和最后的解决问题, 而问题解决的方法可以是请教指导教师预实验验证查阅文献资料和网络论坛求助等四学生亲身实践训练 6

管理 ; 试验动物一般体征等的观察 ; 试验动物操作检查测试及分析 ; 濒死及死亡动物的处理 ; 动物的解剖及尸体的解剖检查 ; 标本的采集及识别 ; 组织病理学检查 ; 原始数据的管理 ; 质量保证部门的任务 ; 试验就业人员的健康检

7 通过教学录像和教师示教, 学生仅仅有感性认识, 但要真正掌握多项动物实验的基本技能, 尚需要学生积极亲身实践这些实验技术, 如灌胃采血静脉注射取肝脏组织等操作只有掌握这些毒理学基本实验操作技术, 才有可能使后续的综合性设计性实验得以顺利有效开展实验二对乙酰氨基酚的急性经口 LD 50 测定一实验目的学习急性经口 LD 50 的测定方法以及掌握受试物的急性毒性分级标准二实验材料 1. 动物 : 成年小鼠 50 只, 雌雄各半 ; 2. 试剂 : 对乙酰氨基酚苦味酸饱和液和 0.5% 品红溶液 3. 器材 : 灌胃针注射器吸管滴管移液器电子秤剪刀镊子量筒容量瓶等三实验步骤 ( 一 ) 动物选择 : 物种品系 : 昆明种小鼠 ; 体重 / 年龄 :18~25 g, 体重要求分组前个体与总均重差异不超过 20%, 组内个体间体重差异小于 10%, 组间体重差异小于 5%; 性别 : 雄雌各半 ; 健康未孕的成年小鼠 ( 二 ) 性别辨认 : 最常用方法是根据生殖器与肛门的距离大小 ; 亦可根据生殖器大小有无肛毛成年雌鼠的乳房发育情况及成年雄鼠的睾丸下降情况等辅助判断 ( 三 ) 动物编号称重分组 : 1. 编号 : 按顺时针方向由右到左由小到大依次是头顶右前肢右腰右后肢尾根左后肢左腰左前肢背部 (1 9),10 即在头顶上用红色编, 其中咖啡色表示百位红色表示十位黄色表示个位 2. 称重 : 以 g 为单位 7

8 3. 分组 : 小鼠按体重大小随机分 5 组,10 只 / 组, 雌雄各半 ( 四 ) 受试物及其不同浓度配置 : 按等容积稀释法, 具体配法为 : 取原液 X=(7.5*50)/(1*1000)ml, 且定容至 50 ml 即为该剂量组溶液, 依此类推可配出各组不同浓度的溶液, 也可按浓度 1* 容积 1= 浓度 2* 容积 2 计算 ( 五 ) 剂量设计 : 一般设置 5 个剂量组, 组间剂量在毒理学实验中一般呈等比数列, 最低剂量可至 LD 0, 而最高剂量可至 LD 100, 然后根据组距 i 可以求出其它组别剂量 ( 六 ) 进行灌胃 : 小鼠进针深度为 2.5~4 cm, 灌胃容积为 0.2~1 ml 本次按 2% 进行灌胃 ( 七 ) 观察动物死亡和中毒体征 : 密切观察各组动物死亡情况中毒体征及其出现时间, 染毒前后体重改变, 必要时对死亡小鼠行常规病理学检查四结果分析 1. 求出 LD 50 及其 95% 的可信区间并讨论其影响因素 : 用改进寇氏法 ( 设 5~8 个剂量组, 各组动物数相等 ; 各组剂量成等比级数 ; 死亡率呈正态分布, 最低剂量组 <20%, 最高剂量组 >80%), 即 logld 50 =logld 100 -i*( p-0.5),s logld50 =i* (p*q/n) 影响因素可能为受试物的性质, 动物的物种和品系年龄性别喂饲环境疾病状态等所致的敏感差异, 操作因素 ( 剂量误差技术因素等 ) 2. 对受试物进行毒性分级 : 经口 LD 50 (mg/kg) <5 5~ 50~500 >500 级别剧毒高毒中等毒低毒 8

可至 LD 0, 而最高剂量可至 LD 100, 然后根据组距 i 可以求出其它组别剂量 ( 六 ) 进行灌胃 : 小鼠进针深度为 2.5~4 cm, 灌胃容积为 0.

9 实验三对乙酰氨基酚诱导小鼠急性肝损伤模型的建立一实验原理选择健康未受孕实验动物, 根据体重按随机化分组方法, 将动物随机分成高中和低 3 个染毒剂量组和 1 个溶剂对照组, 将受试物对乙酰氨基酚单次给予小鼠一定时间后, 了解小鼠所产生的急性肝脏损伤情况及其严重程度, 从而建立急性染毒的小鼠肝损伤模型建立小鼠急性肝损伤模型是进一步研究对乙酰氨基酚引起小鼠急性肝脏损伤作用机制的基础二实验目的了解急性毒性试验中受试物对乙酰氨基酚剂量选择依据和掌握急性动物损伤模型建立中的基本操作技术三实验步骤 1 动物选择 : 购买 48 只昆明种雄性或雌性小鼠, 体重在 18~25 g; 2 动物编号和分组 ; 对每只小鼠编号后, 再按照体重随机分成四组, 即对照组, 对乙酰氨基酚低剂量中剂量和高剂量组 3 受试物对乙酰氨基酚剂量设置和配制 : 根据文献和预实验结果设定对乙酰氨基酚的剂量, 尽可能三组剂量呈等比数列 4 动物染毒 : 用经口灌胃方式给予小鼠受试物或蒸馏水 5 中毒体征观察 : 染毒前后体重改变有无死亡以及中毒体征发生情况 ( 中枢神经系统和神经肌肉系统 : 体位异常叫声异常不安呆滞痉挛抽搐麻痹运动失调对外反应过敏或迟钝 ; 植物神经系统 : 瞳孔扩大或缩小流涎或流泪 ; 呼吸系统 : 鼻孔流液鼻翼煽动呼吸深缓呼吸过速蜂腰 ; 泌尿生殖系统 : 会阴部污秽有分泌物阴道或乳房肿胀 ; 皮肤和毛 : 皮肤充血紫绀被毛蓬松污秽 ; 眼 : 眼球突出结膜充血角膜混浊 ; 消化系统 : 腹泄厌食等 ) 6 生物材料收集处理和保存 : 实验拟在对乙酰氨基酚处理 24 h 后, 采血剖 9

基酚剂量选择依据和掌握急性动物损伤模型建立中的基本操作技术三实验步骤 1 动物选择 : 购买 48 只昆明种雄性或雌性小鼠, 体重在 18~25 g; 2 动物编号和分组 ; 对每只小鼠编号后, 再按照体重随机分成四组, 即对照组, 对乙酰氨

10 杀取肝脏, 全血放于室温 2 h 后,5000 r 离心 10 min, 吸取上清, 然后 -80 度保存待用 ; 肝脏组织一部分立即放入 10% 甲醛固定,24 h 后送安徽医科大学第一附属医院病理科请求石蜡包埋常规切片等 ; 剩余肝脏组织液氮急冻后放 -80 度保存待用四结果分析 1. 收集各组小鼠体重改变中毒体征和死亡情况 2. 本实验拟选择血清 ALT 活力和肝脏组织 HE 染色评价结果来作为急性肝损伤模型是否建立成功的标准, 即用实验四和实验五结果来验证 3. 本次实验中收集的小鼠血清拟在后续实验中测定 ALT 活力 ; 收集的小鼠肝脏一部分病理固定后石蜡包埋和常规切片, 今后行常规 HE 染色, 其余肝脏放于 -80 度保存, 用于今后的肝脏组织 GSH 和 MDA 含量检测五注意事项 1. 不同受试物其染毒剂量不同, 根据文献资料预实验结果受试物的 LD 50 或其它因素综合考虑或通过预实验确定染毒剂量 ; 2. 尽可能多采集血样, 避免溶血, 否则会影响血清酶活性测定结果 ; 3. 组织样品最后液氮急冻后, 放于 -80 度保存待用 ; 4. 学生务必掌握小鼠灌胃采血和取脏器等基本技术, 尤其留取病理的肝脏组织不能用镊子损伤组织 ; 5. 实验中各种小鼠染毒时间处死取材时间要相互协调和统一实验四小鼠血清丙氨酸氨基转移酶活力检测一实验原理丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 在 37 及 ph7.4 条件下, 作用于丙氨酸及 α- 酮戊二酸组成的底物, 生成丙酮酸及谷氨酸反应 30 min 后 ( 固定时间 ) 加入 2,4- 二硝基苯肼 (DNPH) 盐酸溶液, 即中止反应, 同时 DNPH 与酮酸中羰基加成, 生成丙酮酸苯腙苯腙在碱性条件下呈红棕色, 于 505 nm 测定吸光值并计 10

本次实验中收集的小鼠血清拟在后续实验中测定 ALT 活力 ; 收集的小鼠肝脏一部分病理固定后石蜡包埋和常规切片, 今后行常规 HE 染色, 其余肝脏放于 -80 度保存, 用于今后的肝脏组织 GSH 和 MDA 含量检测五注意事项 1.

11 算酶活力, 根据 ALT 活力的高低来反映肝脏细胞损伤的程度反应式如下 : COOH COOH CH 3 HC NH2 + CO CH 2 ALT CH 3 C O + CHNH 2 CH 2 COOH CH 2 COOH COOH CH 2 COOH 丙氨酸 α- 酮戊二酸丙酮酸谷氨酸 NO 2 NO 2 CH 3 C O COOH + H 2 N NH NO 2 NaOH -H 2 O CH 3 C N NH NO 2 COOH 丙酮酸 2,4- 二硝基苯肼丙酮酸 -2,4- 二硝基苯腙 ( 红棕色 ) 二实验目的掌握血清 ALT 活性测定的临床意义, 且了解血清 ALT 活性测定的原理及测定方法三实验材料 1. 小鼠血清 : 来源于实验三中收集的各组小鼠血清 ; 2. 试剂 ( 由南京建成生物工程研究所 ALT 试剂盒提供 ): (1) ALT 基质液 :4 冰箱保存 (2) 2,4- 二硝基苯肼 (DNPH) 液 : 室温避光保存 (3) 4 mol/l NaOH: 用时加蒸馏水稀释至 0.4 mol/l, 室温保存 (4) 2 μmol/ml 丙酮酸钠标准液, 室温保存 (5) 0.1 mol/l 磷酸盐缓冲液,4 冰箱保存 3. 器材 : 离心机 7 ml 离心管理想国架移液器分光光度计玻璃比色杯水浴锅玻璃棒冰箱烧杯量筒等四实验步骤先对测定管盒对照管分别编号, 然后按照表 1 加样 11

小鼠血清 : 来源于实验三中收集的各组小鼠血清 ; 2. 试剂 ( 由南京建成生物工程研究所 ALT 试剂盒提供 ): (1) ALT 基质液 :4 冰箱保存 (2) 2,4- 二硝基苯肼 (DNPH) 液 : 室温避光保存 (3) 4 mol/l NaOH: 用时加蒸馏水稀释至 0.

12 表 1 血清 ALT 的测定加样顺序测定管对照管血清 (ml) 0.1 基质液 (ml,37 已预热 5 min) 混匀后,37 水浴 30 min 2,4- 二硝基苯肼液 (ml) 血清 (ml) 0.1 混匀后,37 水浴 20 min 0.4 mol/l NaOH(ml) 5 5 混匀, 室温放置 5 min,505 nm 波长, 蒸馏水调零, 测各管吸光度, 测定管吸光度减去对照管吸光度的差值, 查标准曲线, 求得相应 ALT 活力单位五结果分析制作标准曲线 : 按照表 2 加样表 2 标准曲线加样顺序 mol/L 磷酸盐缓冲液 (ml) µmol/ml 丙酮酸钠标准液 (ml) 谷丙转氨酶基质液 (ml) ,4- 二硝基苯肼液 (ml) 混匀后,37 水浴 20 min 0.4 mol/l NaOH(ml) 5 5 混匀, 室温放置 10 min,505 nm 波长, 蒸馏水调零, 测各管吸光度, 结果见表 3, 各管吸光度减去零管吸光度的差值为纵坐标, 相应的卡门氏单位为横坐标, 作坐标图, 如图 1 所示 12

0 1 2 3 4 5 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 (ml) 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 2µmol/ml 丙酮酸钠标准液 (ml) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 谷丙转氨酶基质液 (ml) 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 2,4- 二硝基苯肼液 (ml) 0.

13 表 3 标准曲线制作吸光度值绝对吸光度值相当于酶活力卡门氏单位吸光度植 y=0.0028x ALT 活力单位 KU 图 1 ALT 标准曲线及换算公式六注意事项 1. 酶活力超过 150 单位时, 用盐水稀释血清后重测 2. 血清 ALT 在室温可保存 2 天, 在 0~4 可保存 1 周, 在 -25 可保存 1 个月 3. 制备血清时离心速度不可过高, 一般 3000~4000 r (10~15)min 为宜吸上清时不要吸到沉淀实验五小鼠肝脏组织切片 HE 染色及其评价一实验原理苏木素染液中带正电荷的蓝色色精与细胞核中带负电荷的脱氧核糖核苷通过正负电荷的极性吸附而守成染色 ; 伊红是带负电荷的酸性染料, 通过渗透或弥散作用而使组织着色 13

血清 ALT 在室温可保存 2 天, 在 0~4 可保存 1 周, 在 -25 可保存 1 个月 3.

14 二实验目的了解组织常规 HE 染色方法和掌握肝脏细胞坏死评价标准三实验材料 1. 肝脏组织石蜡切片 : 实验三中收集的小鼠部分肝脏置于 10% 中性甲醛中固定 24 h, 由安徽医科大学第一附属医院病理科技术员负责脱水石蜡包埋和切片 (5 μm); 2. 试剂 (1) Harris 苏木素液 : 苏木素 1 g, 无水乙醇 10 ml, 钾明矾 20 g, 蒸馏水 200 ml, 氧化汞 0.5 g, 乙酸 8 ml 将苏木素溶于乙醇 ( 加热 ) 后加入预先已加热溶解明矾的蒸馏水中, 煮沸 1~2 min, 改用小火加热, 慢慢加入氧化汞 ( 注意防止产生大量气泡和溶液溅出 ) 再煮沸 2 min 后立即浸于冷水中, 冷却后加入乙酸, 过滤后使用 (2) 0.1% 曙红 Y 水溶液 : 曙红 Y 0.1 g 蒸馏水 100 ml 和冰醋酸 1 滴 (3) 分化液 : 盐酸 1 ml,70% 乙醇 100 ml (4) 返蓝液 : 氨水 1 ml, 蒸馏水 99 ml (5) 梯度乙醇和二甲苯 3. 器材 : 染缸 Marker 笔标签中性树胶盖玻片镊子滴管数支四实验步骤 1. 脱蜡和水化 : 染色前, 用二甲苯脱去切片中的石蜡, 再经由高浓度到低浓度酒精水化, 最后入蒸馏水具体操作如下 : (1) 二甲苯 Ⅰ10 min; (2) 二甲苯 Ⅱ10 min; (3)100% 乙醇 Ⅰ5 min; (4)100% 乙醇 Ⅱ5 min; (5)95% 乙醇 2 min; (6)70% 乙醇 2 min; (7) 蒸馏水水洗 14

试剂 (1) Harris 苏木素液 : 苏木素 1 g, 无水乙醇 10 ml, 钾明矾 20 g, 蒸馏水 200 ml, 氧化汞 0.

15 2. 常规 HE 染色步骤 : (1) 苏木精液染色 8 min; (2) 流水稍洗去苏木精液 5 min; (3) 1% 盐酸乙醇 30 s; (4) 稍水洗 1 min; (5) 促蓝液返蓝 s; (6) 流水冲洗 5 min; (7) 95% 乙醇浸洗 ; (8) 0.1% 曙红液染色 s; (9) 95% 乙醇 5 min; (10) 无水乙醇 Ⅰ5 min; (11) 无水乙醇 Ⅱ5 min; (12) 二甲苯 Ⅰ5 min; (13) 二甲苯 Ⅱ5 min; (14) 中性树胶封片五结果分析肝脏组织细胞坏死评价标准 : 每组至少选择 5 张不同小鼠来源的切片, 在光镜 400 下, 每张切片随机选择 12 个视野, 按照 0 正常 1 轻度坏死 2 中度坏死和 3 重度坏死分别评分, 然后计算出每张切片的平均评分, 再用统计方法分析组间评分有无差异六注意事项 1. 脱蜡和水化要彻底, 应定期更换二甲苯和梯度乙醇 2. 分化时间要恰当掌握, 可镜下观察着色情况 3. 封片前, 脱水和透明要充分 15

1% 曙红液染色 30-60 s; (9) 95% 乙醇 5 min; (10) 无水乙醇 Ⅰ5 min; (11) 无水乙醇 Ⅱ5 min; (12) 二甲苯 Ⅰ5 min; (13) 二甲苯 Ⅱ5 min; (14) 中性树胶封片五结果分析肝脏组织细胞坏死

16 实验六小鼠肝脏组织还原型谷胱甘肽含量测定一实验原理二硫双基苯甲酸 (dithio-bis-nitrobenzoicacid, DTNB) 能被 -SH 基团还原, 产生等克分子的 2- 硝基 -5- 巯基苯甲酸, 而此苯甲酸阴离子呈黄色, 可在 412 nm 波长下检测还原型谷胱甘肽 (glutathione, GSH) 是一种低分子自由基清除剂, 它可清除 O 2 H 2 O 2 LOOH GSH 是蛋氨酸甘氨酸和半胱氨酸组成的一种小分子肽, 是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物, 并且是谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX) 和谷胱甘肽硫转移酶 (GST) 两种酶类的底物, 为这二种酶分解氢过氧化物所必需, 能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧化损伤最近还证明,GSH 也参与使 Vit E 恢复到还原态的作用 GSH 测定值的高低可间接反映机体发生氧化损伤的程度二实验目的了解组织还原型 GSH 的测定方法和掌握组织 GSH 含量高低的实际意义三实验材料 1. 肝脏组织 : 来源于实验三中收集的肝脏组织 ; 2. 试剂 : (1) 1 mmol/l 的 GSH; (2) DTNB: 浓度为 0.04%(w/v), 用 1% 柠檬酸钠配 ; (3) 1% 柠檬酸钠 ; (4) 20% 三氯醋酸 ; (5) 0.3 mol/l 磷酸氢二钠 (Na 2 HPO 4 ) 缓冲液 3. 器材 : 分光光度计匀浆器离心机制冰机漩涡混匀器枪头 1.5 ml 离心管滤纸 7 ml 离心管和移液器等四实验步骤 16

甘肽硫转移酶 (GST) 两种酶类的底物, 为这二种酶分解氢过氧化物所必需, 能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧化损伤最近还证明,GSH 也参与使 Vit E 恢复到还原态的作用 GSH 测定值的高低可间接反映机体发生氧化

17 1 样品处理及操作步骤 (1) 称取适量肝脏组织于冰冷生理盐水中漂洗, 滤纸吸干水分, 烧杯内剪碎 ; (2) 制备 20% 的组织匀浆液 ( 用生理盐水 4000 g 离心 10 min 后取上清液 ; (3) 按上清液 :20% 三氯醋酸 ( 体积比 ) 为 2:1 混合 ( 留 10 μl 上清液测蛋白 ); (4) 混匀,4000 g 离心 10 min( 此步离心要充分, 可适当提高离心力 ); (5) 收集上清液按表 2 测定 2 按表 1 绘制标准曲线 ( 单位 :ml) 表 1 GSH 标准曲线测定 GSH(μmol/L) mmol/l 的 GSH 三蒸水磷酸盐缓冲液 DTNB 试剂混匀,5 min 内于 412 nm 比色, 以三蒸水调零, 以标准 GSH 浓度为 X 轴, 相应吸光值为 Y 轴, 绘制标准曲线, 并求回归方程 3 按表 2 操作测定样品 GSH( 单位 :ml) 表 2 Beutler 改良法样品测定操作试剂测定管空白管待测样品液磷酸盐缓冲液 DTNB 试剂三蒸水五结果分析测得吸光值代入标准曲线方程, 可计算出样品中 GSH 浓度表 3 标准曲线测定结果 GSH 浓度 (μmol) A 值根据上数据和图 1, 可得出标准曲线方程为 :X(μmol)= Y

18 ( 其中 Y 为吸光值 ) 吸光度 (A) y = x R 2 = GSH 量 (μmol) 图 1 GSH 标准曲线六注意事项 1. 样品应冰上匀浆, 所有步骤尽量保证低温下操作, 否则结果偏低 ; 2. 所有用水均需三蒸水, 否则结果偏低 ; 3. 未经蛋白变性处理的样品在 -20 不宜存放 ; 4. 反应管内最终 PH 值必须保证在 8.0~9.0 间, 否则结果不稳定 ; 5. 配好的 DTNB 应在有限期内使用 (4 下可存 1 个月 ); 6. GSH 浓度低时显色快, 消退也快 ; 浓度高时显色慢, 消退也慢, 一般反应 1~5 min 后测定 ( 最好不要超过 5 min); 7. 反应总体积可调为 2.5 ml 实验七小鼠肝脏组织丙二醛含量测定一实验原理过氧化脂质降解产物中的丙二醛 (MDA), 可与硫代巴比妥酸 (TBA) 缩合, 形成红色产物, 此红色物质在 535 nm 波长处有极大吸收峰, 可用分光光度法进行定量测定 18

反应管内最终 PH 值必须保证在 8.0~9.0 间, 否则结果不稳定 ; 5. 配好的 DTNB 应在有限期内使用 (4 下可存 1 个月 ); 6.

19 二实验目的了解组织 MDA 含量测定方法和掌握 MDA 含量高低的实际意义三实验材料 1. 肝脏组织 : 来源于实验三中收集的肝脏组织 ; 2. 试剂 : (1) TBA 试剂 :0.67%TBA 水溶液, 称取 0.67 g TBA, 用双蒸水配成 100 ml (50 水浴或室温下融解, 静置, 用上清液 ) (2) 标准贮备液 :10 μmol/ml 四乙氧基丙烷的甲醇溶液准确称取 1,1,3,3- 四乙氧基丙烷 110 mg, 以甲醇定容至 50 ml (3) 标准应用液 :10 nmol/ml 四乙氧基丙烷移取贮备液 0.1 ml, 以甲醇稀释成 100 ml (4) 甲醇正丁醇混合液 : 按体积比 15:85 将甲醇与正丁醇混合 (5) 0.05 mol/l 盐酸 3. 器材 : 离心机匀浆器制冰机水浴锅离心管移液器枪头等四实验步骤 1. 标准液或血清或生理盐水 0.15 ml, 加入 20% 的三氯醋酸 (TCA)1.25 ml, 边加边摇, 混匀 ; 2. 加入 0.67%TBA 0.5 ml, 再次混匀, 加盖 ; 3. 沸水浴 30 min; 4. 流水冷却至室温 ; 5. 加入正丁醇 2 ml, 振荡或颠倒于数次 ; rpm 离心 10 min, 吸取上清液于 535 nm 比色 19

四乙氧基丙烷移取贮备液 0.1 ml, 以甲醇稀释成 100 ml (4) 甲醇正丁醇混合液 : 按体积比 15:85 将甲醇与正丁醇混合 (5) 0.05 mol/l 盐酸 3. 器材 : 离心机匀浆器制冰机水浴锅离心管移液器枪头等四实验步骤 1.

20 表 1 加样表标准管标准空白管样品管空白对照管 10 nmol/l 四乙基丙烷 0.15 甲醇 0.15 样品 0.15 NS % 三氯醋酸 ( 边加边摇匀 ) 0.67%TBA ( 混匀加盖 ) 正丁醇 ( 振荡 ) 五结果分析样品中丙二醛的浓度 =(f/f) 10 nmol/ml, 其中 F: 由标准应用液测得的光密度,f: 由样品溶液测得的光密度六注意事项 TBA 与丙二醛生成的有色物质在 2 h 内稳定, 因其在水中融解的较低, 故用有机溶剂抽提但含量较低时, 也可直接对水溶液进行测定日光照射可使显色物质变为黄色, 故应注意避免日光直接照射, 并尽快测定实验八实验结果总结报告一数据收集和整理本次综合实验可以收集 LD 50 数据 4 组小鼠血清 ALT 活力肝脏组织 HE 染色的代表性图片及其细胞坏死评分肝脏组织还原型谷胱甘肽和丙二醛含量等试验数据一般定量数据在 Excel 文档中整理, 并计算每组均数标准差或标准误组织病理学检查可以在光镜下拍成 *.jpg 或 *.tiff 格式的图片 ( 建议 100 和 400 ) 二数据统计分析 20

水中融解的较低, 故用有机溶剂抽提但含量较低时, 也可直接对水溶液进行测定日光照射可使显色物质变为黄色, 故应注意避免日光直接照射, 并尽快测定实验八实验结果总结报告一数据收集和整理本次综合实验可以收集 LD 50 数据

21 计数资料用卡方检验统计分析, 计量资料用方差分析和 t 检验统计处理三图表制作一部分直方图可以在 Excel 文档中直接制作, 然后拷贝到 PPT 中编辑标识和组合, 而肝脏组织 HE 染色代表性图片直接拷贝到 PPT 中编辑标识和组合, 最终另存为 *.jpg 或 *.tiff 格式的图片即可表格一般在 word 文档中绘制即可, 其中三线表要求上下粗线而中间细线四论文撰写一旦所有实验图表制作完毕, 就可以按照我校本科生毕业论文格式要求撰写本次实习论文, 即标题作者中文摘要英文摘要关键词引言材料与方法结果讨论参考文献最后要特别提示的是, 因为本科生实验课学时数有限, 本次综合实验仅仅初步探讨急性暴露对乙酰氨基酚对小鼠肝脏的损害作用及其可能作用机制, 在论文中下结论时, 尚不能完全肯定氧化应激在对乙酰氨基酚致小鼠急性肝脏损伤中的作用, 需要进一步用直接的抗氧化剂预处理来看是否对对乙酰氨基酚致小鼠急性肝脏损伤有保护作用, 然后下肯定结论 21

饮食的基本原则

饮食的基本原则 1 饮食治疗的重要性是什么? 民以食为天, 吃是生命最基本的需求, 健康的四大基石 : 合理膳食适量运动戒烟限酒心理平衡也把合理膳食放在了第一位传统的观念是能吃能喝就是健康, 现在这个观念应该改一改了, 应该是会吃会喝才能