高瞻生物教材手冊

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1 高 瞻 生 物 教 材 手 冊 第 一 單 元 : 蛋 白 質 電 泳 一 電 泳 原 理 帶 電 分 子 在 電 場 中 會 隨 電 流 而 移 動, 此 現 象 稱 之 為 泳 動, 泳 動 的 大 小 程 度 稱 之 為 泳 動 率 (mobility) 泳 動 率 與 分 子 的 電 荷 密 度 成 正 比, 而 與 分 子 受 到 的 摩 擦 力 成 反 比, 摩 擦 力 與 分 子 的 大 小 和 形 狀 有 密 切 相 關, 分 子 量 大 的 分 子, 摩 擦 力 大 泳 動 率 小, 分 子 量 小 的 分 子, 摩 擦 力 小 泳 動 率 大 ; 至 於 分 子 形 狀 的 部 份, 通 常 球 形 分 子 摩 擦 力 較 小, 泳 動 率 大 蛋 白 質 分 子 上 的 淨 電 荷, 取 決 於 環 境 的 ph 値, 若 環 境 ph 高 於 此 蛋 白 質 分 子 的 pi 値, 此 蛋 白 質 帶 淨 負 電, 反 之 帶 淨 正 電 ; 若 剛 好 等 於 其 pi 値, 淨 電 荷 則 為 零, 因 此 同 一 分 子 在 不 同 酸 鹼 環 境 下, 可 能 帶 不 同 的 淨 電 荷 在 電 泳 系 統 中, 帶 負 電 的 蛋 白 質 分 子 會 往 正 極 泳 動, 帶 正 電 的 蛋 白 質 分 子 則 往 負 極 泳 動, 不 帶 電 者 則 不 易 泳 動 由 於 大 部 分 電 泳 系 統 的 ph 値 定 在 8.3 左 右, 在 此 ph 値 下, 凡 是 pi 値 小 於 8.3 的 蛋 白 質 分 子 均 帶 負 電 荷, 可 以 往 正 極 跑 二 聚 丙 烯 醯 胺 膠 體 電 泳 (Polyacrylamide Gel Electrophoresis, 簡 稱 PAGE) 聚 丙 烯 醯 胺 膠 體 電 泳 是 最 普 遍 的 蛋 白 質 電 泳, 其 種 類 分 為 以 下 三 項, 分 述 如 下 : 1. 原 態 膠 体 電 泳 (Disc-PAGE): PAGE 系 列 的 最 基 本 型 式, 蛋 白 質 以 原 態 進 行 電 泳, 因 此 酵 素 活 性 在 電 泳 後 得 以 保 持, 可 在 膠 片 上 直 接 做 活 性 測 定 或 染 色 ; 若 能 收 集 到 膠 体 上 的 蛋 白 質, 則 亦 可 用 來 製 備 酵 素 因 為 樣 本 蛋 白 質 保 持 在 原 態 下, 所 帶 的 電 荷 分 子 大 小 分 子 形 狀 等, 對 其 泳 動 率 均 有 影 響 2. SDS 膠 体 電 泳 (SDS-PAGE): SDS 是 界 面 活 性 劑, 可 使 蛋 白 質 變 性, 並 在 分 子 表 面 均 勻 佈 上 一 層 負 電 荷, 因 此 在 SDS-PAGE 系 統 中, 樣 本 分 子 的 泳 動 率 僅 取 決 於 其 分 子 量, 而 與 原 來 分 子 所 帶 的 電 荷 無 關, 故 SDS-PAGE 可 用 來 測 定 變 性 狀 態 (denatured) 蛋 白 質 之 分 子 量

2 3. 梯 度 電 泳 : 梯 度 電 泳 使 用 由 稀 到 濃 的 梯 度 膠 体, 膠 体 中 的 孔 徑 由 上 到 下 逐 漸 變 小, 樣 本 中 分 子 量 越 小 的 分 子, 就 可 跑 得 越 下 面, 因 此 它 可 說 是 依 分 子 量 大 小 來 分 離 的 但 需 注 意 許 多 pi 大 於 8.3 的 蛋 白 質, 在 電 泳 ph 條 件 下 所 帶 的 淨 電 荷 為 正 電, 在 膠 体 中 根 本 不 會 往 下 跑 梯 度 電 泳 也 可 加 入 SDS, 成 為 梯 度 -SDS-PAGE, 其 解 析 度 將 會 大 大 的 增 強, 是 最 理 想 的 電 泳 型 式 三 SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) SDS(Sodium dodecyl sulfate, 十 二 烷 基 硫 酸 鈉,NaC 12 H 25 SO 4 ) 是 洗 碗 精 的 主 要 成 分, 在 SDS-PAGE 電 泳 系 統 中, 利 用 界 面 活 性 劑 SDS 附 在 蛋 白 質 疏 水 區 表 面, 由 SDS 本 身 所 帶 之 負 電 荷 引 導 泳 動 由 於 蛋 白 本 身 所 帶 電 荷 遠 小 於 附 著 之 SDS 分 子, 因 此 蛋 白 質 本 身 的 電 荷 對 泳 動 率 沒 有 影 響, 泳 動 率 只 決 定 於 蛋 白 質 分 子 量, 故 SDS 電 泳 適 合 測 定 蛋 白 質 的 分 子 量 在 樣 本 處 理 過 程 中, 利 用 加 熱 破 壞 蛋 白 質 的 三 級 及 四 級 結 構, 使 其 分 子 內 部 的 疏 水 區 暴 露 而 與 SDS 結 合, 因 此 SDS-PAGE 廣 泛 地 應 用 於 蛋 白 質 次 單 元 體 分 子 量 的 決 定

3 四 SDS-PAGE 膠 體 構 造 1. 單 體 分 子 (monomer): 丙 烯 醯 胺 (acrylamide),h 2 C=CH-CO-NH 2 2. 架 橋 分 子 (bridge): Bis N,N'-methylene-bis(acrylamide), 可 看 作 兩 個 丙 烯 醯 胺 單 体 分 子 連 結 在 一 起, 可 形 成 分 叉 點, 以 構 成 立 体 結 構 Acrylamide 及 Bis 都 有 神 經 毒 性, 要 帶 手 套, 並 避 免 吸 入 塵 埃 3. 游 基 (free radical) 產 生 者 : 通 常 使 用 過 硫 酸 銨 (ammonium persulfate, APS) 或 者 riboflavin ( 即 維 生 素 B 2 ) 4. 催 化 劑 :TEMED (tetramethylethylenediamine) 幫 助 游 基 電 子 的 傳 遞 五 SDS-PAGE 鑄 膠 反 應 1. 游 基 形 成 : 靠 上 述 游 基 產 生 者 生 成 游 基, 使 單 体 分 子 成 為 游 基 型 式 2. 聚 合 反 應 : 游 基 單 体 可 首 尾 相 接, 以 連 鎖 反 應 形 成 大 分 子 的 長 鏈 3. 交 錯 連 結 : 若 架 橋 分 子 加 入 聚 合 反 應, 則 形 成 網 狀 三 次 元 結 構

4 細 菌 與 人 類 高 瞻 生 物 教 材 手 冊 -1- 課 程 架 構 說 明 : 節 數 性 質 課 程 內 容 第 一 節 理 論 課 程 簡 介 : 一 緒 論 二 細 菌 的 營 養 方 式 三 細 菌 的 繁 殖 四 細 菌 的 人 工 培 養 五 無 菌 操 作 技 術 第 二 節 理 論 六 菌 數 的 測 定 七 結 語 附 錄 : 微 生 物 學 實 驗 技 術 說 明 : (1) 油 鏡 鏡 頭 顯 微 鏡 的 使 用 法 (2) 無 菌 操 作 技 術 實 作 實 作 一 : 環 境 菌 落 培 養 第 三 節 實 作 實 作 二 : 細 菌 染 色 觀 察 ( 菌 種 來 源 : 牙 垢 細 菌 純 種 培 養 菌 落 環 境 培 養 菌 落 ) (1) 簡 單 染 色 法 第 四 節 實 作 (2) 革 蘭 氏 染 色 法 實 作 實 作 三 : 系 列 稀 釋 練 習 一 緒 論 自 然 界 中 無 論 空 氣 水 土 壤 中, 甚 至 生 物 體 內 及 體 表 都 有 大 量 微 生 物 存 在, 不 同 的 微 生 物 對 環 境 的 需 求 都 不 同, 因 此 在 特 定 的 環 境 中 可 能 有 會 有 特 定 的 細 菌 存 活 我 們 生 活 的 週 遭 舉 凡 空 氣 中 書 本 上 講 桌 麥 克 風 電 話 聽 筒 電 腦 鍵 盤, 甚 至 自 己 的 髮 稍 耳 際 鼻 孔 口 腔 內 都 有 一 堆 與 我 們 長 相 廝 守 的 微 生 物 這 些 與 我 們 和 帄 共 存 的 微 生 物 群 落 總 稱 為 正 常 微 生 物 相 (normal flora, 或 稱 為 正 常 菌 叢 ), 在 正 常 情 形 下 這 些 微 生 物 是 非 致 病 性 的, 當 然, 有 些 微 生 物 會 在 人 體 免 疫 力 下 降 時 伺 機 進 攻 人 體, 而 變 成 致 病 性 甚 至 致 命 性, 此 時 的 感 染 則 稱 為 伺 機 性 感 染 當 然, 會 造 成 人 類 死 傷 的 細 菌, 使 人 類 長 久 活 在 恐 懼 之 中, 歷 史 上 不 乏 這 些 傷 亡 史 的 記 載, 對 於 細 菌 這 個 敵 人 ( 或 朋 友 ), 想 要 百 戰 百 勝, 必 先 知 己 知 彼, 科 學 家 們 面 臨 的 第 一 步 挑 戰 便 是 如 何 將 細 菌 帶 入 實 驗 室 中 培 養 觀 察 試 驗, 才 有 機 會 了 解 它 控 制 它 利 用 它 最 終 目 的 應 是 與 之 和 帄 共 存 於 地 球 上 二 細 菌 的 營 養 方 式 細 菌 屬 於 原 核 生 物 界, 學 者 依 照 其 營 養 方 式 的 不 同 將 之 分 成 兩 大 類 : 1. 自 營 性 細 菌 : 能 夠 以 無 機 物 為 原 料 合 成 有 機 物 的 細 菌, 依 照 其 能 量 來 源 又 可 分 成 光 合 自 營 菌 ( 例 如 紫 硫 菌 ) 與 化 學 自 營 菌 ( 例 如 硝 化 細 菌 )

5 高 瞻 生 物 教 材 手 冊 異 營 性 細 菌 : 這 些 細 菌 會 分 泌 酵 素 至 細 胞 外, 將 環 境 中 的 大 分 子 分 解 成 小 分 子 ( 例 如 胺 基 酸 葡 萄 糖 等 ) 加 以 吸 收, 再 藉 由 本 身 的 酵 素 轉 化 為 細 胞 內 的 大 分 子 有 機 物 例 如 扮 演 生 態 系 中 分 解 者 的 諸 多 腐 生 菌 不 同 的 細 菌 會 有 不 同 的 營 養 需 求, 調 整 培 養 基 ( 見 後 述 ) 的 成 分 便 可 以 培 養 出 不 同 種 類 的 細 菌 細 菌 除 營 養 的 需 求 不 同 之 外, 對 氧 氣 溫 度 溼 度 的 需 求 也 都 不 同, 大 體 而 言, 我 們 較 容 易 利 用 簡 單 的 裝 置 從 環 境 中 培 養 嗜 中 溫 好 氧 性 的 細 菌 來 觀 察 三 細 菌 的 繁 殖 在 環 境 適 合 的 理 想 情 況 下, 細 菌 會 利 用 無 絲 分 裂 的 二 分 法 來 快 速 繁 殖, 例 如 大 腸 桿 菌 每 隔 分 鐘 分 裂 一 次, 在 這 麼 短 暫 的 時 間 裡, 細 菌 完 成 了 菌 體 的 成 長 DNA 的 複 製 細 胞 質 的 分 裂 等 生 理 現 象, 因 此 可 以 在 很 短 的 時 間 內 以 指 數 成 長 的 方 式 增 加 族 群 數 量, 但 一 旦 細 菌 密 度 大 增, 在 有 限 的 空 間 中 有 機 營 養 物 將 愈 來 愈 少, 代 謝 廢 物 卻 愈 來 愈 多, 細 菌 族 群 的 命 運 又 會 如 何 呢? 一 般 而 言, 在 開 放 環 境 中, 當 食 物 與 空 間 都 不 虞 匱 乏 時, 生 物 的 生 長 曲 線 呈 現 J 型 模 式, 但 隨 著 生 物 個 體 數 的 快 速 增 加, 環 境 阻 力 勢 必 跟 著 增 加, 而 達 到 環 境 負 荷 量 時, 生 長 曲 線 便 呈 現 S 型 的 帄 衡 狀 態, 從 遲 緩 期 (lag phase, 又 稱 適 應 期 ) 對 數 期 (exponential phase or log phase) 減 速 期 進 入 到 帄 衡 期 (stationary phase) 所 需 的 時 間 會 因 生 物 種 類 而 有 所 差 異, 如 圖 一 但 當 細 菌 被 培 養 在 試 管 或 錐 形 瓶 等 容 器 中, 無 法 主 動 遷 移 時, 此 時 細 菌 將 因 食 物 空 間 的 不 足, 或 代 謝 廢 物 累 積 的 結 果 造 成 菌 體 陸 續 死 亡, 而 進 入 閉 鎖 環 境 下 所 謂 的 衰 退 期 (declining phase or dead phase) < 圖 一 : 典 型 的 族 群 S 型 成 長 曲 線 模 式 圖 > 四 細 菌 的 人 工 培 養 學 者 發 展 了 許 多 方 法 能 將 細 菌 從 自 然 界 中 帶 入 實 驗 室 中 培 養, 如 此 一 來 可 令 其 環 境 單 純 化, 甚 至 菌 種 也 單 純 化 不 會 與 其 他 微 生 物 混 雜 生 長 ( 即 純 種 培 養 ) 將 細 菌 純 種 培 養 之 後, 便 可 以 大 量 繁 殖 單 一 種 細 菌, 再 鑑 定 其 生 化 特 徵, 甚 至 抽

6 高 瞻 生 物 教 材 手 冊 -3- 取 其 遺 傳 物 質 做 更 進 一 步 的 鑑 定 與 應 用 實 驗 室 中 常 用 來 培 養 細 菌 的 培 養 基, 乃 是 依 據 細 菌 生 長 所 需 之 營 養 成 分 配 置 而 成 的 生 長 基 質, 依 使 用 目 的 不 同, 而 有 固 態 半 固 態 和 液 態 之 分 若 依 成 分 不 同, 則 可 再 分 成 基 礎 滋 養 選 擇 性 鑑 別 性 增 數 分 析 及 特 別 培 養 基 等 只 要 在 液 態 培 養 基 中 加 入 適 量 的 洋 菜 粉 ( 一 種 紅 藻 的 提 煉 物, 又 稱 瓊 脂 ), 就 可 使 培 養 基 在 冷 卻 後 凝 結 成 固 態 培 養 基 早 期 細 菌 培 養 基 的 製 作 過 程 相 當 繁 複, 現 則 可 利 用 市 售 之 乾 燥 培 養 基 粉 末 (dehydrated media) 依 據 實 驗 需 求 與 處 方 說 明 配 置 即 可, 十 分 方 便, 此 處 省 略 其 一 般 流 程 如 果 我 們 將 細 菌 培 養 在 液 體 的 培 養 基 中, 給 予 其 必 要 的 養 分 與 環 境 溫 度, 細 菌 便 會 快 速 地 從 適 應 期 進 入 對 數 成 長 期, 到 達 環 境 所 能 負 荷 的 帄 衡 期, 此 時 澄 清 的 液 體 培 養 基 就 會 因 為 菌 數 的 增 加 而 愈 來 愈 混 濁, 有 經 驗 的 學 者 甚 至 從 液 體 的 混 濁 度 就 可 以 推 估 培 養 基 中 細 菌 的 密 度 ( 見 後 述 ), 如 果 不 干 預 不 處 理 這 瓶 液 體 培 養 基, 再 過 一 段 時 間 液 體 培 養 基 就 會 因 為 細 菌 死 亡 而 在 瓶 底 出 現 沉 澱 物, 使 得 液 體 混 濁 度 再 度 下 降 但 若 將 細 菌 培 養 在 固 體 培 養 基 情 況 又 將 如 何 呢? 許 多 細 菌 根 本 不 具 有 運 動 能 力, 即 使 具 有 運 動 能 力, 加 了 洋 菜 的 固 體 培 養 基 又 會 限 制 住 細 菌 的 活 動 因 此, 倘 若 一 個 細 菌 落 在 培 養 基 表 面 上, 因 為 不 愁 吃 住, 這 隻 細 菌 便 會 在 降 落 點 附 近 快 速 繁 衍 出 一 大 堆 細 菌 子 代, 範 圍 大 到 肉 眼 可 見, 於 是 我 們 會 在 固 體 培 養 基 上 看 到 一 個 個 由 一 個 細 菌 繁 衍 而 成 的 細 菌 群 落, 學 者 稱 之 為 菌 落 如 圖 二 < 圖 二 : 細 菌 的 菌 落 > 五 無 菌 操 作 技 術 要 在 實 驗 室 中 從 各 種 樣 本 分 離 出 細 菌, 甚 至 培 養 鑑 定 出 細 菌 種 類, 首 要 條 件 是 在 操 作 過 程 中 不 能 受 到 其 他 微 生 物 的 污 染, 確 實 控 制 不 受 外 來 因 素 之 影 響 因 此, 進 行 微 生 物 學 的 實 驗 過 程, 諸 如 抹 片 染 色 菌 種 的 保 存 接 種 移 種 培 養 基 之 製 備 等, 皆 須 符 合 無 菌 操 作 技 術 的 處 理 原 則 所 謂 滅 菌 (sterilization) 是 指 殺 死 所 有 微 生 物 形 態, 包 括 細 菌 黴 菌 病 毒 寄 生 蟲 及 這 些 微 生 物 種 類 之 芽 孢 ( 或 細 菌 之 內 孢 子 ) 形 態 ; 而 消 毒

7 高 瞻 生 物 教 材 手 冊 -4- (disinfection) 乃 指 殺 死 微 生 物 之 繁 殖 體, 但 不 包 含 殺 死 其 芽 孢 之 作 用 我 們 可 以 使 用 物 理 或 化 學 的 方 法 達 到 滅 菌 或 消 毒 之 目 的 例 如 : 加 熱 紫 外 線 照 射 過 濾 化 學 消 毒 劑 ( 例 如 氧 化 乙 烯 ) 處 理 等 等, 以 下 分 別 簡 述 其 處 理 原 則 : 1. 加 熱 法 : 加 熱 方 法 快 速 方 便, 幾 乎 對 所 有 微 生 物 都 有 效, 只 是 不 適 用 於 會 受 熱 破 壞 之 物 品 加 熱 法 可 分 為 乾 熱 滅 菌 法 與 溼 熱 滅 菌 法 (1) 乾 熱 滅 菌 法 的 條 件 是 將 待 處 理 物 放 在 160 的 烘 箱 中, 加 熱 2 小 時 (2) 溼 熱 滅 菌 法 則 是 以 水 蒸 氣 為 帶 熱 媒 體 來 進 行, 其 中 以 煮 沸 法 與 高 壓 蒸 氣 滅 菌 法 最 常 用 : A. 煮 沸 法 : 是 將 待 處 理 物 放 在 100 熱 水 中 加 熱 分 鐘, 一 般 細 菌 與 黴 菌 等 之 繁 殖 體 即 可 被 殺 死, 但 殺 不 死 其 芽 孢 形 態, 故 達 不 到 滅 菌 之 目 的 B. 高 壓 蒸 氣 滅 菌 法 : 是 將 待 處 理 物 放 置 於 高 壓 蒸 氣 滅 菌 鍋 內, 將 壓 力 增 加 至 15 磅 / 帄 方 英 吋, 此 時 水 溫 可 升 至 121, 保 持 此 溫 度 壓 力 狀 態 持 續 分 鐘, 可 殺 滅 所 有 微 生 物 及 其 芽 孢 形 態, 此 為 現 今 最 可 靠 也 最 方 便 之 滅 菌 法 2. 紫 外 線 照 射 法 : 紫 外 線 是 指 波 長 在 4nm-400nm 間 之 輻 射 線, 能 量 介 於 可 見 光 與 X 射 線 之 間, 在 nm 之 波 長 對 細 胞 有 致 死 作 用, 而 最 具 傷 害 性 之 波 長 約 在 265nm 照 射 紫 外 線 可 改 變 細 胞 內 的 DNA 結 構, 影 響 其 複 製, 故 可 達 到 殺 菌 之 目 的, 波 長 nm 之 紫 外 線 殺 菌 效 果 最 好 有 一 種 低 壓 的 水 銀 蒸 氣 燈 可 發 射 254nm 左 右 之 波 長, 是 一 種 很 有 效 之 殺 菌 燈 通 常 在 使 用 無 菌 操 作 檯 (laminar flow) 後, 先 以 75% 酒 精 噴 灑 工 作 檯 面, 蓋 上 防 護 罩 後 打 開 紫 外 線 照 射 燈, 對 無 菌 操 作 檯 進 行 長 時 間 的 滅 菌, 以 確 保 下 一 次 實 驗 的 無 菌 狀 態 3. 過 濾 法 : 易 被 熱 破 壞 之 液 體 ( 如 血 清 抗 生 素 溶 液 等 ) 可 以 用 過 濾 法 除 去 微 生 物, 過 濾 器 的 濾 孔 依 照 使 用 目 的 分 成 許 多 種, 以 milipore 過 濾 膜 為 例, 濾 孔 孔 徑 由 0.025um-14um 不 等, 一 般 用 來 過 濾 細 菌 的 濾 膜 孔 徑 約 為 0.45um 過 濾 法 亦 可 應 用 於 無 菌 操 作 檯 設 備 中, 此 設 備 內 裝 特 殊 濾 網, 在 操 作 時 啟 動 裝 置, 吹 出 來 的 空 氣 經 過 濾 網 過 濾, 幾 乎 可 達 無 菌 狀 態, 讓 操 作 檯 在 工 作 時 減 少 污 染 六 菌 數 的 測 定 估 算 環 境 中 或 生 物 檢 體 中 的 細 菌 數, 常 是 進 行 生 化 檢 驗 的 第 一 步, 也 是 醫 學 檢 定 上 很 重 要 的 一 個 步 驟, 能 夠 提 供 許 多 細 菌 生 長 狀 態 的 訊 息 除 了 直 接 顯 微 計 數 法 之 外, 學 者 們 發 展 出 了 以 下 幾 種 間 接 的 菌 數 測 定 法, 茲 分 述 如 下 : 1. 直 接 顯 微 計 數 法 : 利 用 特 殊 載 玻 片 (Petroff-Hauser cell counter) 測 得 死 菌 與 活 菌 的 總 數, 適 用 於 樣 本 細 菌 分 布 極 為 帄 均 的 狀 況 2. 濾 膜 計 數 法 : 若 菌 數 相 當 少 時 ( 例 如 水 檢 體 ) 可 用 此 法 將 100ml 樣 本 通 過 孔 徑 0.45um 的 濾 膜 收 集 後, 再 將 濾 膜 放 置 於 營 養 帄 板 培 養 基 上, 經 37 培 養 小 時, 計 算 出 現 的 總 菌 落 數, 即 可 得 到 100ml 水 檢 體 中 所 含 的 生 菌 數

8 高 瞻 生 物 教 材 手 冊 濁 度 測 定 法 : 利 用 光 電 比 色 計 以 nm 波 長, 通 過 含 有 細 菌 之 懸 浮 液, 測 其 吸 收 率 或 折 射 率, 再 與 已 知 之 標 準 濃 度 比 較 其 基 本 原 理 為 細 菌 體 可 視 為 一 懸 浮 膠 體 (colloid), 當 光 線 通 過 此 液 體 後, 膠 體 粒 子 可 將 光 線 折 射, 而 在 某 一 範 圍 內, 光 被 吸 收 或 折 射 的 量 與 膠 體 濃 度 呈 線 性 關 係 唯 此 方 法 估 算 的 是 死 菌 與 活 菌 加 起 來 的 總 數 4. 標 準 帄 板 測 定 法 (standard plate count 簡 稱 為 SPC) : 此 法 一 般 是 用 來 估 計 水 中 牛 乳 尿 液 或 其 他 培 養 物 等 液 體 中 的 生 菌 數 含 量 因 為 在 帄 板 培 養 基 上 的 一 個 菌 落 是 由 一 個 細 菌 繁 殖 而 來, 因 而 檢 體 之 菌 數 可 用 菌 落 之 數 目 來 表 示, 然 而 此 法 所 求 之 菌 數 並 非 真 正 之 細 菌 數, 因 為 檢 體 中 有 許 多 死 細 菌 並 不 能 形 成 菌 落, 且 不 見 得 檢 體 上 所 有 的 細 菌 都 能 在 所 給 予 的 培 養 基 上 生 長, 話 雖 如 此, 這 種 方 法 仍 能 在 某 些 情 況 下 達 到 快 速 測 定 菌 數 的 目 的 唯 需 注 意 的 是, 如 果 一 開 始 落 在 培 養 基 上 的 細 菌 太 少, 所 產 生 的 菌 落 數 便 無 法 準 確 反 應 原 來 的 菌 數 而 若 一 開 始 落 在 培 養 基 上 的 細 菌 太 多, 則 所 產 生 的 菌 落 便 可 能 會 互 相 混 雜, 造 成 觀 察 辨 識 與 分 離 上 的 困 難, 甚 至 有 些 菌 種 還 會 分 泌 抑 制 其 他 菌 種 生 長 的 物 質, 造 成 菌 數 測 定 上 極 大 的 誤 差, 因 此 學 者 們 公 認 每 個 培 養 皿 上 長 出 個 菌 落 是 最 為 可 靠 也 最 為 賞 心 悅 目 的 為 了 得 到 單 一 培 養 基 上 長 出 個 菌 落 的 理 想 狀 況, 我 們 有 必 要 對 未 知 濃 度 的 菌 液 作 所 謂 的 系 列 稀 釋 (serial dilution) 動 作, 如 圖 三,( 但 若 是 菌 液 濃 度 太 低, 則 需 用 前 述 濾 膜 計 數 法 ), 然 後 取 1.0ml 或 0.1ml 的 菌 液 進 行 帄 板 培 養 基 隔 夜 培 養, 待 菌 落 長 出 後 選 取 長 出 約 個 菌 落 的 培 養 基, 依 其 稀 釋 倍 率 計 算 其 菌 數, 即 可 推 回 原 樣 本 的 生 菌 數 濃 度 < 圖 三 : 系 列 稀 釋 >

9 高 瞻 生 物 教 材 手 冊 -6- 七 結 語 細 菌 與 人 類 的 關 係 真 的 不 是 只 有 罄 竹 難 書 的 那 一 面! 大 部 分 細 菌 對 人 體 是 無 害 的, 只 因 若 干 致 病 性 的 細 菌 使 得 細 菌 群 落 背 負 了 莫 大 的 罪 名, 尤 其 細 菌 與 真 菌 等 微 生 物 在 自 然 界 中 扮 演 著 相 當 重 要 的 分 解 者 角 色, 對 生 態 系 的 物 質 循 環 貢 獻 良 多 在 早 先 分 子 生 物 學 研 究 的 啟 蒙 階 段, 細 菌 與 病 毒 就 扮 演 著 實 驗 室 中 的 開 路 先 鋒, 科 學 家 們 從 這 些 微 生 物 的 遺 傳 研 究 中, 發 現 所 有 生 物 的 遺 傳 語 言 竟 然 都 源 自 於 同 一 套 編 碼 系 統! 這 個 論 點 成 為 演 化 論 支 持 者 口 中 最 好 的 分 子 生 物 學 證 據 時 至 今 日 進 入 所 謂 基 因 工 程 的 時 代, 姑 不 論 基 因 療 法 的 前 景 如 何 生 殖 科 技 的 道 德 議 題 如 何 解 套 複 製 動 物 的 難 題 如 何 解 決 群 眾 對 基 因 食 品 能 否 接 受, 我 們 的 生 活 中 其 實 早 已 充 斥 著 數 不 盡 的 細 菌 功 勞, 細 菌 儼 然 已 經 成 為 科 學 家 們 駕 馭 DNA 片 段 的 重 要 利 器 另 外, 在 尋 找 地 球 外 生 命 的 議 題 上, 細 菌 也 可 以 提 供 科 學 家 們 許 多 生 命 起 源 研 究 方 向 的 靈 感 雖 然 人 類 對 細 菌 的 了 解 從 形 態 進 而 生 理, 從 觀 察 鑑 定 到 掌 控 利 用, 漸 漸 的 得 心 應 手, 但 是 這 個 地 球 上 最 古 老 而 強 悍 的 生 命 體 正 以 其 多 變 的 樣 貌 一 再 現 形, 挑 戰 著 科 學 的 極 限 也 許, 人 類 的 思 維 應 該 轉 個 彎, 不 要 一 味 地 只 想 殲 滅 它, 而 要 思 考 該 如 何 與 這 個 地 球 上 最 古 老 的 生 物 和 帄 共 存! 面 對 這 樣 的 世 界, 有 遠 見 的 你, 準 備 好 了 嗎? 機 會, 永 遠 只 給 準 備 得 最 好 的 人! 巴 斯 德 :Chance prefers prepared mind!

10 高 瞻 生 物 教 材 手 冊 -7- 附 錄 : 微 生 物 學 實 驗 技 術 說 明 說 明 : 進 入 第 三 四 節 實 驗 之 前, 同 學 須 先 預 習 油 鏡 鏡 頭 顯 微 鏡 的 使 用 法 無 菌 操 作 技 術 兩 大 項 目, 茲 將 注 意 事 項 說 明 如 後 : 一 顯 微 鏡 ( 油 鏡 鏡 頭 ) 使 用 法 1. 熟 悉 顯 微 鏡 構 造 與 一 般 操 作 原 則 ( 請 自 行 複 習 基 礎 生 物 實 驗 講 義 ) 2. 油 鏡 之 操 作 : (1) 操 作 方 法 如 同 使 用 高 倍 鏡, 唯 標 本 必 須 先 滴 加 一 滴 油 鏡 油, 且 不 需 覆 蓋 蓋 玻 片 (2) 旋 轉 油 鏡 (100 ) 於 視 物 位 置, 再 將 油 鏡 鏡 頭 緩 緩 降 低 直 到 浸 入 標 本 處 之 油 滴 中, 調 整 細 調 節 輪 至 影 像 出 現, 並 且 調 整 光 圈 或 獲 光 源 至 合 適 亮 度 (3) 注 意 事 項 A. 操 作 油 鏡 時, 鏡 台 應 保 持 水 帄 以 免 油 滴 外 溢 B. 油 鏡 放 大 原 理 : 油 鏡 油 成 分 多 為 松 柏 油 (Cedar wood oil), 其 折 射 率 與 載 玻 片 相 同, 避 免 光 線 經 太 多 介 質 折 射 而 散 失, 進 不 到 口 徑 狹 窄 的 油 鏡 鏡 頭 中, 如 圖 四 C. 使 用 油 鏡 後, 應 以 拭 鏡 紙 沾 取 少 量 有 機 溶 劑 ( 如 二 甲 苯 xylene 等 ) 輕 輕 拭 去 油 漬, 但 應 特 別 小 心, 以 防 鏡 片 脫 落 ( 實 驗 後 統 一 由 專 人 擦 拭 ) 3. 若 需 使 用 顯 微 測 量 技 術, 則 請 參 照 高 中 教 材 < 圖 四 : 油 鏡 放 大 原 理 ( 左 半 部 光 線 直 線 通 過 松 柏 油, 右 半 部 無 松 柏 油, 光 線 反 射 偏 離 接 物 鏡 )> 二 無 菌 操 作 技 術 ( 部 分 ) 無 菌 操 作 技 術, 依 使 用 之 器 材 與 目 的 不 同 而 異, 通 常 在 無 菌 操 作 檯 內 進 行, 茲 以 接 種 環 移 種 至 斜 面 培 養 基 為 例 說 明 之, 如 圖 五 : 1. 將 試 管 與 接 種 環 分 別 置 於 試 管 架 左 右 兩 端, 接 種 環 握 柄 朝 下 放 置, 物 始 接 種 環 前 端 碰 觸 桌 面, 以 免 汙 染, 試 管 編 號 妥 當, 如 圖 a

11 高 瞻 生 物 教 材 手 冊 右 手 持 接 種 環, 將 電 爐 絲 部 份 於 火 燄 上 加 熱, 使 全 部 燒 紅 後, 再 將 金 屬 部 分 橫 過 火 焰 三 次 滅 菌 待 用, 如 圖 b 3. 左 手 持 菌 種 管, 以 右 手 食 指 及 手 掌 夾 住 試 管 蓋 ( 或 棉 塞 ), 旋 轉 打 開 蓋 子 ( 或 拔 出 棉 塞 ), 如 圖 c 4. 以 火 焰 燒 灼 管 口, 然 後 以 步 驟 2 已 滅 菌 之 接 種 環 深 入 管 內 挑 取 適 量 菌 種, 如 接 種 環 過 燙, 可 先 使 之 輕 觸 培 養 基 無 菌 處, 待 冷 卻 後 再 取 菌 種, 如 圖 c f 5. 再 次 燒 灼 試 管 管 口 後, 蓋 回 蓋 子 或 棉 塞, 放 回 試 管 架 上, 如 圖 g h 6. 左 手 另 取 欲 接 種 之 斜 面 培 養 基 試 管, 按 步 驟 3 4 操 作, 將 接 種 環 之 菌 種 輕 輕 劃 線 接 種 於 斜 面 上, 再 燒 灼 試 管 口, 蓋 上 蓋 子 置 回 架 上, 如 圖 i 7. 將 用 過 之 接 種 環 依 步 驟 2 滅 菌 完 全, 放 回 試 管 架 上 註 : 以 下 圖 片 以 單 手 握 住 接 種 前 後 之 兩 試 管, 但 初 學 者 可 以 每 次 手 持 一 試 管 操 作 即 可 < 圖 五 : 無 菌 操 作 技 術 >

12 壹 教 材 內 容 綱 要 前 言 植 物 組 織 培 養 一 植 物 組 織 培 養 之 發 展 歷 史 二 植 物 組 織 培 養 之 基 本 原 理 三 植 物 組 織 培 養 的 部 位 與 目 的 四 培 養 基 的 組 成 五 滅 菌 的 方 法 六 微 體 繁 殖 進 行 步 驟 七 植 物 組 織 培 養 技 術 的 應 用 八 台 灣 的 蘭 花 產 業 貳 探 討 活 動 : 大 豆 豌 豆 之 無 菌 播 種 實 驗 - 1 -

13 想 一 想 台 灣 近 年 來, 蝴 蝶 蘭 年 外 銷 量 突 破 八 百 萬 株, 而 有 蝴 蝶 蘭 王 國 的 美 稱, 你 知 道 這 些 數 量 龐 大 的 蝴 蝶 蘭 是 怎 麼 來 的 呢? 植 物 組 織 培 養 為 一 種 基 本 的 生 物 技 術 指 將 植 物 體 的 細 胞 組 織 器 官 或 個 體 經 過 消 毒 滅 菌, 於 無 菌 環 境 下, 人 為 提 供 植 物 所 需 的 無 機 養 分 醣 類 及 生 長 調 節 劑 等 物 質, 在 控 制 光 線 溫 度 等 因 子 之 環 境 促 使 植 物 生 長 發 育 以 完 成 其 生 長 繁 殖 或 保 存 的 目 的 無 論 植 物 之 大 量 繁 殖 無 病 毒 植 株 的 生 產 植 物 育 種 二 次 代 謝 物 的 大 量 生 產 植 物 生 長 形 態 生 理 遺 傳 病 理 學 等 研 究, 均 可 利 用 比 技 術 為 工 具 而 且 具 有 不 受 限 於 氣 候 影 響 在 較 小 的 空 間 中 即 可 進 行 的 優 點 一 植 物 組 織 培 養 之 發 展 歷 史 最 早 在 1902 年 德 國 植 物 生 理 學 家 Haberlandt 嘗 試 將 高 等 植 物 的 組 織 培 養 於 人 工 培 養 基 上, 雖 並 未 獲 得 成 功, 但 卻 開 啟 了 組 織 培 養 的 扉 頁 直 到 1934 年 才 由 P. R. White 利 用 酵 母 菌 的 抽 出 物 成 功 進 行 蕃 茄 根 尖 的 繼 代 培 養 至 此, 可 讓 植 物 在 人 工 培 養 基 中 順 利 生 長 1948 年 Skoog 和 Tsui 利 用 煙 草 為 研 究 材 料 提 出 要 培 養 產 生 不 定 根 不 定 芽 或 癒 傷 組 織, 其 關 鍵 取 決 於 生 長 素 auxin 與 細 胞 分 裂 素 cytokinin 的 比 例 ( 圖 一 ) 1954 年 W.H. Muir 成 功 的 進 行 單 細 胞 培 養 1962 年 Murashige 與 Skoog 提 出 之 MS 培 養 基 配 方 成 為 現 今 植 物 組 織 培 養 中 廣 泛 使 用 之 培 養 基 圖 一 : 植 物 生 長 素 和 細 胞 分 裂 素 的 比 例 對 器 官 分 化 的 影 響 二 植 物 組 織 培 養 之 基 本 原 理 植 物 組 織 培 養 之 所 以 可 順 利 進 行 的 基 本 原 理 為 植 物 細 胞 具 有 分 化 的 全 能 性 (totipotency), 全 能 性 totipotency 一 詞 最 早 在 二 十 世 紀 初 由 德 國 植 物 生 理 - 2 -

14 學 家 Haberlandt 提 出, 指 任 何 單 細 胞 擁 有 與 母 本 相 同 的 遺 傳 組 成, 可 形 成 完 整 植 物 體 之 遺 傳 訊 息, 具 有 發 育 成 與 母 本 相 同 性 狀 的 潛 能 他 也 將 割 傷 後 的 馬 鈴 薯 傷 口 長 出 來 的 組 織 定 名 為 Callus, 中 文 稱 為 癒 傷 組 織, 用 以 指 一 群 未 分 化 的 細 胞 群, 沒 有 一 定 的 生 長 方 向, 宛 如 動 物 癌 細 胞 一 般, 具 有 極 強 的 增 殖 力 但 是, 一 直 到 1958 年 才 由 Steward 以 胡 蘿 蔔 韌 皮 部 組 織 誘 導 出 癒 傷 組 織, 再 由 此 癒 傷 組 織 分 化 成 小 苗, 證 明 了 高 等 植 物 活 細 胞 具 有 分 化 全 能 性 三 植 物 組 織 培 養 的 部 位 與 目 的 植 物 體 的 各 部 位 皆 可 作 為 組 織 培 養 的 材 料, 而 培 養 的 部 位 與 培 養 的 目 的 有 密 切 的 關 係, 其 關 係 如 下 表 一 表 一 : 植 物 組 織 培 養 之 培 養 部 位 與 培 養 目 的 之 關 係 表 培 養 部 位 培 養 目 的 完 整 植 物 體 增 加 存 活 率 胚 保 留 優 良 性 狀 之 無 病 毒 植 株 育 種 : 使 雜 種 胚 可 存 活 器 葉 片 表 皮 薄 層 嫩 無 性 繁 殖 官 或 片 段 莖 片 段 子 葉 和 胚 軸 Young needle fascicles 花 莖 上 未 成 熟 的 花 儲 存 構 造 子 房 胚 珠 花 藥 育 種 花 粉 組 織 : 癒 傷 組 織 分 生 組 織 誘 發 變 異 無 菌 化 細 胞 ( 液 體 懸 浮 培 養 ) 誘 變 育 種 體 胚 發 生 提 供 原 生 質 體 培 養 生 產 二 次 代 謝 產 物 原 生 質 體 品 種 改 良 基 礎 細 胞 學 研 究 四 培 養 基 的 組 成 培 養 基 的 內 容 常 隨 植 物 種 類 及 部 位 而 有 所 不 同, 基 本 成 分 為 水 有 機 物 醣 類 無 機 鹽 類 維 生 素 及 激 素 1. 水 - 3 -

15 水 是 生 命 所 必 不 可 缺 少 的, 是 細 胞 的 組 成 成 分 之 一 也 是 細 胞 中 各 種 生 理 生 化 反 應 的 介 質, 可 維 持 細 胞 一 定 滲 透 壓 與 膨 壓 並 為 植 物 體 提 供 氫 氧 元 素 2. 大 量 元 素 主 要 為 碳 氫 氧 氮 磷 鉀 硫 鈣 鎂 植 物 體 所 需 之 碳 氫 氧 元 素 主 要 來 自 空 氣 中 之 二 氧 化 碳 與 水 氮 元 素 可 提 供 植 物 體 作 為 合 成 胺 基 酸 的 原 料, 在 培 養 基 中 常 以 KNO3, 或 Ca(NO3)2 等 硝 態 氮 或 補 加 (NH4)2SO4( 氨 態 氮 ), 以 提 供 氮 源 而 組 織 培 養 研 究 中 常 用 之 MS 培 養 基 主 要 以 NH4NO3 的 形 式, 在 培 養 基 中 既 引 入 硝 態 氮, 又 引 入 氨 態 氮 磷 是 植 物 必 需 元 素 之 一, 參 與 植 物 生 命 過 程 中 的 核 酸 合 成 蛋 白 質 合 成 光 合 作 用 呼 吸 作 用 以 及 能 量 的 儲 存 轉 化 與 釋 放 等 重 要 生 理 生 化 過 程 因 此, 在 組 織 培 養 中, 培 養 物 需 要 大 量 的 磷 而 鉀 鈣 硫 鎂 等 因 會 影 響 培 養 物 的 酵 素 活 性 故 進 而 影 響 新 陳 代 謝 過 程 3. 微 量 元 素 係 指 植 物 對 這 些 元 素 需 量 極 微, 而 且 多 了 有 毒, 但 缺 乏 了 又 會 產 生 代 謝 障 礙 培 養 基 中 僅 需 添 加 低 於 10-5 ~10-7 M ( 克 分 子 濃 度 ) 即 能 滿 足 需 要, 稍 多 即 發 生 毒 害 ( 植 物 細 胞 酵 素 失 活 代 謝 障 礙 蛋 白 質 變 性 導 致 組 織 死 亡 ) 包 含 鐵 銅 硼 鋁 鋅 錳 鈷 鉬 等 對 植 物 生 命 活 動 都 有 重 要 作 用 4. 蔗 糖 糖 類 是 植 物 培 養 物 不 可 缺 少 的 碳 源 和 能 源 其 中 蔗 糖 是 最 好 的 碳 源 和 能 源, 其 次 是 葡 萄 糖 和 果 糖, 蔗 糖 又 可 維 持 一 定 的 滲 透 壓 因 植 物 種 類, 培 養 目 的 的 不 同, 最 適 蔗 糖 濃 為 % 不 等 5. 維 生 素 植 物 自 身 具 有 合 成 維 生 素 的 能 力, 但 無 法 滿 足 快 速 生 長 的 需 要 培 養 基 中 添 加 之 維 生 素 以 維 生 素 B 群 為 主, 如 維 生 素 B1(thiamine, 硫 胺 素 ) 維 生 素 B6 (pyridoxine, 吡 哆 醇 ) 菸 鹼 酸 ( nicotinic acid) 生 物 素 (biotin) 葉 酸 (folic acid) 泛 酸 (pantothenic acid) 等, 主 要 功 能 為 扮 演 輔 酶 與 酵 素 共 同 催 化 化 學 反 應 添 加 到 培 養 基 中 的 維 生 素 濃 度 約 在 0.1 一 1.0mg 之 間 7. 有 機 物 天 然 生 長 促 進 物 質 最 常 用 的 是 椰 子 汁 (CW), 其 他 如 酵 母 (YE) 牛 肉 分 解 物 麥 芽 胚 乳 大 豆 子 葉 蘋 果 香 蕉 等 萃 取 液 或 柑 桔 汁 番 茄 汁 黃 瓜 汁 等 8. 植 物 激 素 植 物 激 素 對 於 培 植 體 的 分 化 ( 如 不 定 芽 不 定 胚 不 定 根 花 芽 等 的 分 化 ), 有 重 要 而 明 顯 的 作 用 其 中 影 響 最 顯 著 的 是 生 長 素 ( 包 括 二 氯 苯 氧 基 乙 酸 2,4-D 萘 乙 酸 NAA 吲 哚 乙 酸 IAA 吲 哚 丁 酸 IBA) 和 細 胞 分 裂 素 ( 包 括 激 動 素 kinetinkt 玉 米 素 zeatin 等 ), 通 常 認 為 生 長 素 細 細 胞 激 動 素 出 值 大 時, 有 利 於 跟 的 形 成 ; 比 值 小 時, 則 促 進 芽 的 形 成 故 應 根 據 不 同 植 物 的 種 品 種, 不 同 的 培 植 體, 以 及 不 同 的 培 養 目 標, 採 用 不 同 種 類 的 植 物 激 素 和 比 率, 以 便 達 到 預 期 的 目 的 吉 貝 素 (GA) 通 常 不 利 於 芽 的 分 化, 但 能 促 進 已 分 化 的 芽 的 伸 長 生 長 - 4 -

16 9. 瓊 脂 海 藻 中 提 取 出 來 的 一 種 物 質, 植 物 細 胞 不 能 利 用 它, 並 由 於 它 具 有 無 毒 害, 可 塑 性, 遇 熱 液 化, 冷 卻 後 固 化, 可 使 各 種 可 溶 性 物 質 均 勻 地 擴 散 分 布 等 的 特 性 至 今 仍 是 一 較 理 想 的 固 體 支 撐 物 想 一 想 在 自 然 環 境 中, 一 般 植 物 生 長 需 要 哪 些 物 質? 請 思 考 培 養 基 成 分 與 上 述 物 質 有 何 異 同? 五 滅 菌 的 方 法 在 試 管 繁 殖 過 程 中, 為 了 防 止 霉 菌 細 菌 等 污 染, 使 試 管 苗 健 康 地 生 長, 必 須 採 用 有 效 的 方 法, 將 所 用 培 養 器 皿 培 養 基 操 作 工 具 培 養 材 料 接 種 間 進 行 滅 菌 滅 菌 可 分 物 理 方 法 和 化 學 方 法 兩 類 需 視 滅 菌 物 品 的 特 性 採 用 適 當 的 滅 菌 方 式 1. 培 養 基 及 培 養 器 皿 的 滅 菌 通 常 採 用 高 壓 蒸 汽 滅 菌 法 滅 菌, 對 於 遇 熱 易 分 解 的 物 質, 可 用 細 菌 漏 斗 過 濾 法 去 除 細 菌 也 可 採 用 乙 醚 處 理 乾 燥 的 熱 不 穩 定 物 質 半 小 時 玻 璃 器 皿 可 採 用 烘 箱 乾 熱 滅 菌 法 滅 菌 2. 金 屬 用 具 接 種 用 的 刀 鑷 子 剪 刀 等, 使 用 前 需 用 酒 精 棉 花 擦 拭 乾 淨, 然 後 在 火 焰 上 灼 燒 冷 卻 後, 在 無 菌 條 件 下, 將 器 具 在 95% 酒 精 中 浸 一 下, 取 出 後 放 在 酒 精 燈 上 燒 一 下, 安 放 在 玻 璃 架 上, 待 冷 卻 後 使 用 六 微 體 繁 殖 進 行 步 驟 1. Estalishment 建 立 : 即 建 立 無 菌 培 養 的 系 統, 是 植 物 培 養 的 基 本 操 作 一 般 在 自 然 環 境 生 長 的 植 物 常 受 到 病 毒 與 細 菌 的 感 染, 而 無 病 毒 化 的 植 物 能 生 長 的 較 好, 作 為 農 作 物 產 量 較 高, 整 體 經 濟 價 值 高 目 前 常 用 讓 植 物 無 菌 化 的 方 法 為 莖 頂 培 養 法 或 稱 為 生 長 點 培 養 法, 因 感 染 病 毒 的 植 株 在 生 長 點 會 保 持 無 病 毒 的 狀 態 ( 圖 二 ), 其 原 因 可 能 為 生 長 點 分 裂 增 殖 旺 盛 導 致 細 胞 密 度 較 高, 使 得 病 毒 不 易 入 侵 且 實 驗 材 料 常 用 莖 頂 的 生 長 點, 故 稱 為 莖 頂 培 養 法 植 物 組 織 培 養 最 初 的 培 養 材 料 稱 為 培 植 體 (explant), 選 擇 適 當 的 培 植 體 後 頇 進 行 培 植 體 消 毒, 消 毒 的 方 式 為 利 用 漂 白 水 以 進 行 培 植 體 表 面 的 滅 菌, 並 在 無 菌 環 境 中, 將 培 植 體 接 種 在 適 當 的 培 養 基 上, 使 其 能 正 常 生 長 - 5 -

17 圖 二 : 植 物 生 長 點 ( 莖 頂 ) 病 毒 分 布 示 意 圖 2. Multiplication 增 生 : 在 此 階 段 誘 發 已 建 立 培 養 系 統 之 培 植 體 分 化, 促 進 芽 的 大 量 繁 殖, 可 分 為 旁 芽 形 成 與 不 定 芽 形 成 利 用 適 當 激 素 比 率 的 培 養 基 促 進 旁 芽 與 不 定 芽 的 形 成 並 將 這 些 快 速 生 長 的 培 植 體 移 至 新 的 培 養 基 中 培 養 若 此 不 定 芽 是 由 癒 傷 組 織 誘 發 產 生, 與 其 他 方 式 形 成 的 新 芽 所 培 育 出 的 植 物 體 相 較 較 容 易 發 生 變 異 3. Root Formation 發 根 : 促 進 植 物 體 根 部 的 生 長, 以 便 將 上 一 步 驟 增 殖 的 植 物 芽 體 能 順 利 成 長 為 完 整 的 植 物 體, 此 一 步 驟 可 在 試 管 內 或 試 管 外 進 行 Fig? 4. Acclimatization 馴 化 : 為 將 植 物 體 轉 移 至 環 境 變 化 明 顯 的 自 然 環 境 中, 逐 漸 使 植 物 體 適 應 乾 燥 或 強 光 等 環 境 條 件 並 同 時 由 提 供 糖 分 的 營 養 環 境 轉 換 為 自 營 生 活 的 操 作 七 植 物 組 織 培 養 技 術 的 應 用 1. 大 量 繁 殖 (1) 有 性 繁 殖 : 如 無 菌 播 種 技 術 因 蘭 花 種 子 的 構 造 較 原 始, 故 在 自 然 界 中 的 萌 發 率 很 低, 可 利 用 無 菌 播 種 的 技 術 大 大 提 高 其 萌 發 率 (2) 無 性 繁 殖 : 利 用 生 長 點 花 梗 節 腋 芽 培 養 或 誘 導 產 生 癒 傷 組 織 或 擬 原 球 體 (Protocorm Like Body,PLB) 增 殖 圖 三 : 蝴 蝶 蘭 之 擬 原 球 體 - 6 -

18 註 : 擬 原 球 體 (Protocorm Like Body,PLB) 為 在 蝴 蝶 蘭 營 養 器 官 誘 導 或 無 菌 播 種 時 會 經 過 的 階 段, 此 時 增 生 能 力 強, 增 殖 速 率 快, 其 型 態 與 種 子 發 芽 時 所 形 成 之 球 狀 細 胞 團 (Protocorm) 類 似, 故 稱 之 2. 無 病 毒 種 原 建 立 : 在 自 然 界 生 長 的 植 物 常 易 受 到 病 毒 的 感 染, 利 用 生 長 點 培 養 出 無 病 毒 的 種 苗, 因 其 品 質 與 產 量 均 較 高, 具 有 較 高 的 經 濟 價 值 3. 育 種 (1) 胚 培 養 : 克 服 雜 交 不 親 合 的 現 象, 提 高 雜 交 種 子 發 芽 的 機 會 或 縮 短 林 木 種 子 育 種 的 時 間 (2) 誘 變 育 種 : 在 培 養 細 胞 原 生 質 或 癒 傷 組 織 時, 添 加 特 定 物 質 或 提 供 逆 境 以 引 導 變 異 的 產 生 (3) 花 藥 培 養 : 用 以 產 生 單 倍 體 的 植 株, 再 經 染 色 體 加 倍 處 理 即 可 得 到 純 化 的 品 系, 可 縮 短 育 種 年 限 (4) 原 生 質 融 合 : 可 用 以 產 生 親 源 關 係 較 遠 的 雜 交 種, 甚 至 利 用 基 因 體 的 導 入 創 造 全 新 的 品 種 4. 二 次 代 謝 物 的 生 產 : 可 在 人 工 控 制 的 環 境 下 大 量 生 產, 而 不 必 砍 伐 植 物 體, 且 不 受 氣 候 季 節 的 限 制 想 一 想 認 識 了 植 物 組 織 培 養 這 項 技 術 之 後, 你 想 用 此 技 術 生 產 何 種 產 品 或 從 事 何 種 研 究? 八 台 灣 的 蘭 花 產 業 台 灣 因 地 理 位 置 與 氣 候 條 件 適 合 許 多 生 物 生 存, 故 具 有 豐 富 的 生 物 資 源, 原 生 種 蘭 花 種 類 繁 多, 再 加 上 台 灣 種 植 蘭 花 已 有 一 百 年 歷 史, 近 二 十 年 來 產 業 發 展 迅 速, 使 得 台 灣 的 蘭 花 品 種 豐 富 且 多 元, 在 國 際 蘭 花 市 場, 台 灣 掌 握 五 成 以 上 的 蝴 蝶 蘭 種 源 四 成 核 心 生 產 技 術, 並 因 此 發 展 出 外 銷 為 導 向 的 蘭 花 產 業, 成 為 供 應 全 世 界 蘭 花 市 場 的 重 要 產 地 台 灣 為 全 球 最 大 的 蘭 花 輸 出 國 近 兩 年 來, 蝴 蝶 蘭 年 外 銷 量 突 破 八 百 萬 株, 位 居 台 灣 花 卉 及 種 苗 出 口 之 首, 更 高 居 世 界 第 一 位 蘭 花 雖 只 占 台 灣 花 卉 栽 種 面 積 的 四 %, 所 創 造 的 產 值 卻 占 了 二 三 %, 因 此 被 視 為 花 卉 黃 金 產 業 - 7 -

19 高 瞻 生 物 教 材 手 冊 第 四 單 元 : 新 興 科 技 於 人 體 最 大 器 官 --- 皮 膚 的 應 用 4-1 皮 膚 的 基 本 構 造 p2 4-2 黑 色 素 的 形 成 機 制 p4 4-3 雷 射 光 的 形 成 原 理 p 雷 射 光 淡 化 黑 斑 的 原 理 p 皮 膚 組 織 工 程 p11 1

20 4-1 皮 膚 的 基 本 構 造 皮 膚 是 全 身 最 大 的 器 官, 面 積 以 成 年 人 而 言 約 為 1.6 平 方 公 尺, 並 佔 全 身 體 重 的 16%, 可 分 為 表 皮 真 皮 和 皮 下 組 織 三 大 部 分, 其 中 膠 原 蛋 白 佔 有 皮 膚 的 總 重 量 的 75% 另 外, 在 皮 膚 上 也 存 在 有 毛 囊 豎 毛 肌 指 甲 皮 脂 腺 汗 腺 等 附 屬 器 官 皮 膚 的 厚 度 因 年 齡 性 別 部 位 等 因 素 而 異, 通 常 眼 瞼 部 位 的 皮 膚 最 薄, 而 手 腳 掌 的 皮 膚 最 厚 圖 4-1 皮 膚 的 構 造 圖 一 表 皮 : 位 於 皮 膚 的 最 外 側, 主 司 保 護 功 能, 具 有 保 護 皮 膚 不 受 有 害 物 質 及 微 生 物 的 侵 害, 以 及 保 護 人 體 水 分 及 體 液 不 被 蒸 發 及 散 失 的 功 能 表 皮 可 以 分 為 五 層, 由 外 而 內 分 別 是 基 底 層 (stratum basale) 有 棘 層 (stratum spinosum) 顆 粒 層 (stratum granulosum) 透 明 層 (stratum lucidum) 和 角 質 層 (stratum corneum) 除 了 角 質 層 的 細 胞 是 無 細 胞 核 的 死 細 胞 外, 其 他 四 層 的 細 胞 都 是 活 的 細 胞 2

21 角 質 層 的 死 細 胞 與 附 著 於 皮 膚 上 之 灰 塵, 即 是 我 們 沐 浴 時, 由 皮 膚 上 洗 掉 的 污 垢 角 質 層 也 具 有 些 微 的 防 曬 功 能, 因 為 一 些 皮 膚 手 術 或 處 理 方 式 均 會 破 壞 角 質 層, 這 也 是 經 磨 皮 手 術 塗 去 斑 藥 膏 或 經 雷 射 治 療 後, 要 儘 可 能 避 免 陽 光 照 射, 必 須 加 強 防 曬 的 原 因 角 質 層 是 直 接 接 觸 所 有 美 容 與 保 養 用 品 的 部 位, 對 產 品 的 使 用 效 果 與 皮 膚 狀 態 影 響 最 深 表 皮 的 五 層 細 胞 中, 以 基 底 層 最 為 重 要, 又 稱 為 發 生 層, 是 表 皮 的 母 細 胞 其 中 的 細 胞 不 斷 分 裂, 逐 漸 向 外 移 行 並 產 生 變 化, 最 後 形 成 角 質 層 每 隔 10 到 13 個 基 底 細 胞 間 穿 插 一 個 黑 色 素 細 胞, 其 功 能 為 分 泌 黑 色 素 當 皮 膚 受 陽 光 照 射, 黑 色 素 細 胞 就 分 泌 更 多 的 黑 色 素, 以 保 護 皮 內 組 織 避 免 受 到 陽 光 中 的 紫 外 線 傷 害, 臨 床 上 即 呈 現 黑 斑 或 肝 斑 等 症 狀 自 基 底 細 胞 層 到 角 質 層 的 經 常 性 變 化, 我 們 稱 之 為 皮 膚 的 更 新 更 新 的 速 度 因 個 人 體 質 部 位 和 年 齡 而 有 所 不 同 當 角 質 層 受 到 外 界 異 物 或 環 境 因 素 破 壞 時, 更 新 的 速 度 會 加 快 以 排 除 異 物 和 修 復 皮 膚 另 一 方 面, 反 復 性 的 化 學 或 物 理 性 刺 激 也 會 導 致 角 質 層 變 厚, 形 成 一 般 人 俗 稱 的 皮 繭 這 些 反 應 都 是 皮 膚 對 外 界 刺 激 所 產 生 的 防 禦 性 反 應, 亦 即 皮 膜 屏 障 圖 4-2 黑 色 素 細 胞 位 置 圖 3

22 二 真 皮 : 真 皮 層 在 皮 膚 的 第 二 層, 為 皮 膚 的 主 要 部 份, 可 分 為 2 層, 由 上 至 下 為 乳 突 層 與 網 狀 層 主 要 為 結 締 組 織, 內 含 膠 原 纖 維 彈 性 纖 維 等, 與 大 量 含 黏 多 醣 蛋 白 的 基 質, 具 有 保 存 水 份, 維 持 皮 膚 的 彈 性, 並 提 供 真 皮 中 附 屬 器 官 之 附 著 位 置, 以 維 持 皮 膚 的 組 織 形 態 的 功 能 真 皮 中 血 管 可 供 應 皮 膚 營 養, 神 經 末 稍 則 是 皮 膚 感 覺 的 受 器, 而 皮 脂 腺 與 汗 腺 則 是 表 皮 及 毛 髮 的 保 溼 潤 滑 之 重 要 來 源 真 皮 層 的 重 要 組 成 成 份 都 是 由 真 皮 裡 的 纖 維 母 細 胞 (fibroblasts) 所 合 成, 因 此, 纖 維 母 細 胞 若 是 因 老 化 而 失 去 合 成 膠 原 纖 維 的 功 能 時, 則 皮 膚 將 萎 縮 而 產 生 皺 紋, 並 失 去 其 柔 軟 與 彈 性 三 皮 下 組 織 : 位 在 真 皮 層 之 下 為 皮 下 脂 肪 層, 主 要 由 脂 肪 細 胞 所 形 成, 主 司 熱 阻 隔, 吸 收 震 動 以 及 提 供 能 量 之 來 源, 可 接 受 脂 肪 的 形 成 及 脂 肪 儲 存 的 功 能 具 有 保 存 體 溫, 提 供 機 械 性 撞 擊 之 緩 衝 功 能, 一 般 女 性 較 男 性 為 厚 4-2 黑 色 素 的 形 成 機 制 一 黑 色 素 的 形 成 : 表 皮 基 底 層 的 黑 色 素 細 胞 中 酪 胺 酸 經 由 酪 胺 酸 酶 一 連 串 的 生 化 代 謝 作 用, 經 多 巴 多 巴 錕 等 中 間 產 物 的 製 造 後, 最 後 形 成 麥 拉 寧 ( 即 黑 色 素 ) 黑 色 素 細 胞 的 樹 枝 狀 突 起 伸 入 表 皮 其 他 細 胞, 傳 遞 成 熟 的 黑 色 素 顆 粒, 而 使 皮 膚 呈 色 圖 4-3 黑 色 素 形 成 之 生 化 機 制 : 苯 丙 胺 酸 (Phenylalanine) 氫 氧 化 後, 可 形 成 酪 胺 酸 (Tyrosine), 再 經 酪 胺 酸 酶 (Tyrosinase) 催 化 形 成 麥 拉 寧 ( 黑 色 素 ) 二 皮 膚 色 斑 形 成 的 原 因 : 若 有 外 來 刺 激 或 內 在 因 素 活 化 黑 色 素 細 胞, 會 增 加 黑 色 素 的 數 目, 引 起 較 多 黑 色 素 移 動 到 表 皮 細 胞 及 角 質 細 胞, 而 引 起 皮 膚 呈 現 不 同 程 度 的 黑 斑, 如 雀 斑 曬 斑 老 人 斑 顴 骨 母 斑 肝 斑 痘 疤 及 發 炎 後 色 素 沈 澱 等 常 見 的 原 因 有 : 4

23 1 紫 外 線 : 皮 膚 照 射 紫 外 線 後, 會 使 得 黑 色 素 細 胞 製 造 先 軀 物 質, 啟 動 酪 胺 酸 酶 的 製 造, 增 加 黑 色 素 的 製 造, 是 皮 膚 色 斑 形 成 的 主 要 原 因 2 壓 力 : 長 期 處 於 負 面 不 良 的 情 緒, 或 面 臨 突 如 其 來 的 打 擊, 會 使 腦 部 分 泌 的 相 關 激 素 增 加, 其 結 果 就 是 過 多 的 黑 色 素 沈 澱 在 皮 膚 中 來 不 及 排 除, 而 造 成 膚 色 黯 沈 或 區 塊 性 的 黑 斑 3 年 齡 : 皮 膚 隨 著 年 齡 的 老 化, 會 引 發 黑 色 素 的 色 素 活 化 因 子 (MGF) 更 快 速 生 成, 造 成 更 多 的 斑 點 在 臉 上, 這 也 是 為 何 年 齡 愈 高 者 皮 膚 容 易 出 現 暗 沉 及 黑 斑 的 原 因 故 紫 外 線 睡 眠 不 足 疲 勞 負 面 情 緒 與 壓 力 型 荷 爾 蒙 增 加 均 會 導 致 黑 色 素 異 常 增 加 聚 集 眾 多 原 因 中, 以 皮 膚 光 傷 害 較 為 一 般 人 所 熟 知, 易 造 成 皮 膚 較 敏 感 泛 紅 曬 傷 粗 糙 黑 斑 細 紋 深 紋 角 質 化 及 癌 病 變 等 故 良 好 規 律 的 生 活 作 息 及 適 當 的 防 曬 措 施 都 可 以 有 效 地 減 少 黑 斑 的 形 成 及 惡 化 三 皮 膚 紫 外 線 反 應 當 受 到 紫 外 線 的 照 射, 黑 色 素 細 胞 就 會 加 速 製 造 黑 色 素, 或 者 新 陳 代 謝 不 佳 時, 過 量 的 黑 色 素 會 堆 積 在 表 皮 和 真 皮 層 中, 使 得 皮 膚 變 黑 而 造 成 色 素 斑 其 可 能 的 原 因 如 下 : 圖 4-4 紫 外 線 光 譜 5

24 陽 光 中 的 紫 外 線 在 照 射 皮 膚 的 時 候 會 在 皮 膚 表 皮 細 胞 形 成 許 多 的 自 由 基 (Radicals), 這 些 自 由 基 會 經 由 兩 條 生 化 代 謝 途 徑 來 刺 激 黑 色 素 細 胞 生 成 黑 色 素 : 第 一 條 路 徑 是 經 由 黑 色 素 細 胞 刺 激 素 作 用 的 方 式, 這 是 傳 統 上 黑 色 素 生 成 的 理 論 機 制, 另 外 一 條 比 較 新 發 現 的 途 徑 是 目 前 許 多 科 學 家 都 努 力 在 研 究 的, 有 關 內 皮 素 (ET-1,Endothelin-1) 生 成 理 論 根 據 研 究 指 出, 在 紫 外 線 照 射 皮 膚 後, 產 生 的 自 由 基 會 刺 激 表 皮 細 胞 生 成 許 多 的 內 皮 素, 內 皮 素 會 促 進 黑 色 素 細 胞 的 增 生 及 分 化 並 且 對 黑 色 素 細 胞 中 酪 胺 酸 酶 的 活 性 具 有 促 進 作 用, 因 此 內 皮 素 具 有 使 皮 膚 黑 色 素 大 量 增 生 的 效 果 四 抑 制 黑 色 素 增 生 的 方 法 由 黑 色 素 形 成 的 原 因 得 知, 要 真 正 淡 斑, 可 不 是 只 有 防 禦 紫 外 線 就 好, 最 重 要 的 是 要 重 視 三 個 阻 斷 步 驟, 才 能 有 效 預 防 黑 色 素 的 形 成 其 三 階 段 的 阻 斷 系 統 分 別 是 : 1 抑 制 黑 色 素 的 形 成 : 當 皮 膚 受 到 外 在 刺 激 之 後, 我 們 皮 膚 底 層 的 黑 色 素 會 開 始 製 造, 所 以 我 們 抑 制 黑 色 素 不 要 過 量, 就 不 易 形 成 暗 沉 膚 色 與 產 生 新 的 斑 點 如 熊 果 素 麴 酸 等 的 應 用 2 淡 化 已 形 成 的 黑 色 素 : 淡 化 已 經 出 現 於 皮 膚 上 的 色 素 與 斑 點, 讓 斑 點 由 片 狀 縮 小 成 點 狀, 如 維 生 素 C 及 其 衍 生 物 等 的 應 用 3 完 全 代 謝 已 形 成 黑 色 素 : 就 是 將 已 經 淺 化 弱 化 的 黑 色 素 進 而 完 全 的 代 謝, 如 果 酸 等 的 應 用 過 去 對 於 皮 膚 色 斑 治 療 的 方 式 多 半 是 以 化 學 方 式 來 阻 斷 酪 胺 酸 酶 的 作 用, 這 樣 的 處 理 方 法 延 續 了 數 十 年 之 後, 發 現 效 果 是 有 限 的 而 且 過 度 的 使 用 果 酸, 會 使 角 質 層 越 來 越 薄, 失 去 保 護 皮 膚 的 能 力, 使 皮 膚 受 到 外 來 刺 激 時, 黑 色 素 細 胞 做 出 過 度 反 應, 反 而 產 生 預 期 之 外 的 嚴 重 黑 色 素 沈 澱 現 象, 而 且 長 期 使 用 皮 膚 會 變 脆 弱, 而 出 現 皮 膚 敏 感 的 問 題 4-3 雷 射 光 的 形 成 原 理 大 家 常 以 為 光 電 與 生 物 醫 學 是 兩 個 極 為 不 同 的 領 域, 其 實 在 1960 年 雷 射 發 明 後, 光 電 卻 能 溶 入 醫 學 領 域, 成 為 一 種 新 的 醫 療 工 具, 創 造 新 的 醫 療 紀 元 1958 年, 美 國 科 學 家 肖 洛 和 湯 斯 發 現 了 一 種 神 奇 的 現 象 : 當 他 們 將 內 光 燈 泡 所 發 射 的 光 照 在 一 種 稀 土 晶 體 上 時, 晶 體 的 分 子 會 發 出 鮮 艷 的 始 終 會 聚 在 一 起 的 強 光 6

25 根 據 這 一 現 象, 他 們 提 出 了 雷 射 原 理, 即 物 質 在 受 到 與 其 分 子 固 有 振 蕩 頻 率 相 同 的 能 量 激 勵 時, 都 會 產 生 這 種 不 發 散 的 強 光 - 雷 射, 他 們 為 此 發 表 了 重 要 論 文 雷 射 (Laser, 全 稱 Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation,) 指 通 過 受 激 輻 射 放 大 和 必 要 的 反 饋, 產 生 具 有 單 色 性 (monochromaticity) 同 調 性 (coherence) 定 向 性 (directionality) 或 準 直 性 (collimation) 以 及 高 強 度 (high intensity) 光 束 的 過 程 及 儀 器 圖 4-5 雷 射 光 束 一 光 的 性 質 人 眼 看 得 見 的 電 磁 波 稱 為 可 見 光 今 天 提 到 的 光, 大 多 是 指 可 見 光 ; 有 時 也 泛 指 一 般 的 電 磁 波, 亦 即 包 括 無 線 電 波 微 波 紅 外 光 紫 外 光 X 光 等 不 同 類 的 電 磁 波 之 基 本 差 別 在 於 其 波 長 不 一 樣, 因 而 遇 到 各 種 物 質 的 時 候, 產 生 的 現 象 及 效 果 就 不 相 同 圖 4-6 電 磁 波 光 譜 7

26 使 電 磁 波 產 生 各 種 現 象 的 主 要 原 因 是 : 它 攜 帶 著 能 量 電 磁 波 攜 帶 能 量 的 方 式, 是 把 能 量 包 裹 成 一 粒 一 粒 的, 每 一 粒 稱 為 一 顆 光 子 至 於 光 的 強 度, 則 是 每 秒 內 垂 直 通 過 一 平 方 公 尺 面 積 的 光 能, 其 單 位 為 : 焦 耳 / 平 方 公 尺 / 秒, 所 以 光 的 強 度 愈 高, 就 表 示 每 秒 內 通 過 一 定 面 積 的 能 量 愈 多, 若 是 可 見 光, 就 是 愈 亮 的 二 雷 射 光 形 成 的 原 理 與 特 性 要 瞭 解 雷 射 的 基 本 原 理 必 須 先 回 想 原 子 的 構 造 原 子 由 原 子 核 與 在 週 圍 繞 轉 的 電 子 構 成, 電 子 在 一 定 的 軌 道 繞 轉, 各 軌 道 各 有 一 定 的 能 量, 離 原 子 愈 遠 的 軌 道 能 階 愈 高 能 量 最 低 的 能 階, 稱 為 基 態, 而 能 量 較 高 的 能 階, 稱 為 受 激 態 當 電 子 受 到 外 來 能 量 的 激 發 時, 從 基 態 跳 躍 至 受 激 態, 但 電 子 通 常 並 不 能 長 久 處 於 受 激 態, 約 僅 10-8 秒 即 回 復 基 態 並 釋 出 能 量, 這 種 現 象 稱 為 自 發 放 射 但 某 些 物 質 的 原 子, 則 會 存 在 於 停 留 時 間 較 長 的 受 激 態 (10-3 秒 ), 此 特 別 的 受 激 態 稱 為 準 穩 態, 當 電 子 正 處 於 準 穩 態 時, 入 射 的 光 子 不 會 被 吸 收, 而 會 誘 導 受 激 態 的 電 子 落 至 原 先 的 軌 道, 放 出 與 這 個 光 子 一 模 一 樣 的 光 子, 這 就 是 激 發 放 射 這 兩 個 一 模 一 樣 的 光 子 又 可 以 分 別 激 發 其 他 的 受 激 態 電 子 放 出 一 模 一 樣 的 光 子, 所 以 共 會 產 生 四 個 一 模 一 樣 的 光 子, 於 是 可 藉 著 共 振 腔 使 光 強 度 的 放 大 反 覆 進 行 連 鎖 反 應, 大 幅 增 加 放 大 效 果 而 雷 射 器 中, 共 振 腔 反 射 鏡 只 對 極 少 數 波 長 具 有 高 反 射 率 ; 甚 至 還 常 用 稜 鏡 或 光 柵 對 波 長 作 進 一 步 篩 選 圖 4-7 雷 射 的 原 理 8

27 綜 合 以 上 的 原 因, 雷 射 光 就 只 能 具 有 很 窄 的 波 長 範 圍, 亦 即 具 有 單 色 性 雷 射 光 之 所 以 特 殊, 在 於 它 的 強 度 是 經 過 放 大 的, 而 且 雷 射 裝 置 使 得 它 的 光 束 又 細 又 直, 光 束 截 面 上 一 秒 鐘 內 通 過 的 能 量 就 很 高 另 一 方 面, 激 發 輻 射 使 光 子 之 步 伐 整 齊 ( 相 位 一 致 ), 所 以 雷 射 光 束 的 相 干 性 很 高 三 雷 射 器 的 基 本 構 造 雷 射 器 大 多 由 激 勵 系 統 雷 射 物 質 和 光 學 諧 振 腔 三 部 分 組 成 激 勵 系 統 就 是 產 生 外 來 能 量 的 裝 置, 目 前 使 用 的 激 勵 手 段, 主 要 有 光 照 通 電 或 化 學 反 應 等 雷 射 物 質 是 能 夠 產 生 雷 射 的 物 質, 如 紅 寶 石 鈹 玻 璃 氖 氣 半 導 體 有 機 染 料 等 光 學 諧 振 腔 是 用 來 加 強 輸 出 雷 射 的 亮 度, 調 節 和 選 定 雷 射 的 波 長 和 方 向 等 1. 活 躍 雷 射 介 質 2. 光 泵 浦 能 量 3. 高 反 射 率 反 射 鏡 4. 輸 出 功 率 耦 合 器 5. 雷 射 光 束 圖 4-8 雷 射 器 構 造 簡 圖 四 雷 射 的 種 類 根 據 產 生 雷 射 的 介 質, 可 以 把 雷 射 器 分 為 液 體 雷 射 器 氣 體 雷 射 器 和 固 體 雷 射 器 等 不 同 的 雷 射 介 質 就 會 產 生 不 同 波 長 的 雷 射 光, 故 雷 射 常 以 活 性 介 質 來 命 名 常 見 的 雷 射 與 應 用 有 下 列 幾 種 : 9

28 4-4. 雷 射 光 淡 化 黑 斑 的 原 理 雷 射 是 一 種 經 由 輻 射 激 發 而 加 強 擴 大 的 光 線, 具 有 高 能 量, 單 一 波 長, 單 一 相 位, 低 散 射 角 度 等 特 色 雷 射 可 以 高 度 選 擇 性 的 破 壞 特 定 的 物 質, 而 不 傷 及 其 他 物 質, 對 皮 膚 這 種 複 雜 的 器 官 而 言, 雷 射 正 是 治 療 的 利 器, 它 可 以 去 除 異 常 的 組 織 或 病 變, 而 保 存 正 常 的 組 織 其 中 以 紅 寶 石 雷 射 具 有 最 強 的 除 黑 色 素 以 及 最 不 傷 害 血 管 組 織 的 效 果 一 雷 射 淡 斑 的 機 制 1 雷 射 光 震 碎 黑 色 素 顆 粒, 雷 射 光 所 以 能 去 斑, 主 要 是 黑 色 素 會 吸 收 雷 射 光, 並 將 光 能 轉 化 為 熱 能, 造 成 組 織 的 熱 破 壞, 並 產 生 震 波 把 黑 色 素 顆 粒 震 碎 成 小 顆 粒, 此 時 因 折 光 度 改 變, 病 患 會 有 色 斑 變 深 的 現 象 隨 後 淺 層 的 黑 色 素 小 顆 粒 會 隨 表 皮 結 痂 而 剝 落, 較 深 層 的 小 顆 粒 則 被 吞 噬 細 胞 進 行 吞 噬 作 用, 再 運 送 離 開 2 波 長 愈 長 愈 深 入 皮 膚 雷 射 光 波 長 愈 長 愈 能 深 入 皮 膚, 但 黑 色 素 吸 收 雷 射 光 的 強 弱, 恰 與 波 長 成 反 比, 波 長 愈 長 的 雷 射 黑 色 素 的 吸 收 也 愈 差, 因 此, 雷 射 去 斑 必 須 計 算 出 能 達 到 色 素 所 在 位 置 的 最 短 波 長 決 定 了 波 長 後, 還 得 決 定 使 用 雷 射 的 能 量 因 功 率 乘 以 時 間 等 於 能 量 ( 焦 耳 ), 此 時 就 要 考 慮 目 標 組 織 暴 露 於 雷 射 光 照 射 的 時 間 因 黑 色 素 顆 粒 相 當 小, 因 此 必 須 在 瞬 間 發 出 高 能 量, 即 比 黑 色 素 的 熱 緩 解 時 間 短, 才 能 達 到 破 壞 黑 色 素 顆 粒 的 效 用 但 是, 如 果 能 量 過 高, 破 壞 得 太 嚴 重, 也 會 產 生 焦 土 作 用, 波 及 旁 邊 正 常 的 皮 膚, 反 而 會 造 成 色 素 沉 澱, 或 是 留 下 疤 痕 臨 床 上 使 用 的 脈 衝 光 並 不 是 雷 射, 它 是 一 個 波 段 的 光, 涵 蓋 550nm 到 1200nm 的 光 只 要 選 取 不 同 波 段 的 光, 設 定 能 量 及 脈 衝 數, 便 可 以 打 不 同 的 病 灶, 包 括 血 管, 黑 色 素, 甚 至 可 以 除 毛 故 可 以 說, 色 素 斑 雷 射 是 比 較 激 烈 但 有 效 的 方 法, 而 脈 衝 光 是 比 較 溫 和 但 可 能 需 多 次 療 程 的 方 法 10

29 圖 4-9 雷 射 除 斑 作 用 示 意 圖 4-5 皮 膚 組 織 工 程 您 看 過 背 上 長 人 類 耳 朵 的 老 鼠 嗎? 可 別 被 牠 的 模 樣 給 嚇 著 了, 牠 可 是 組 織 工 程 技 術 的 傑 作! 科 學 家 已 經 發 展 出 此 種 方 式, 讓 人 體 的 器 官 在 實 驗 室 中 製 造 出 來 所 謂 組 織 工 程 是 關 於 有 關 於 組 織 修 復 及 再 生 的 醫 療 用 途 材 料, 如 人 工 皮 膚 人 工 軟 骨 幹 細 胞 等 培 養, 所 研 發 的 新 興 生 物 科 技 圖 4-10 組 織 工 程 的 案 例 11

30 一 組 織 工 程 的 基 本 要 件 組 織 工 程 的 進 行, 需 要 三 個 要 素, 包 括 : 1 細 胞 : 培 養 的 細 胞 是 受 精 卵 經 一 再 分 裂, 並 且 又 一 面 分 化 具 有 特 殊 功 能 的 成 熟 的 細 胞, 如 皮 膚 細 胞 肝 臟 細 胞 軟 骨 細 胞 等, 2 生 物 支 架 : 常 用 來 做 支 架 的 材 料 為 膠 原 蛋 白, 因 其 為 高 分 子 化 合 物, 常 被 塑 造 成 多 孔 性 結 構, 以 便 讓 細 胞 進 入 黏 附, 並 在 這 種 特 殊 的 人 工 支 架 上 生 長, 與 原 本 組 織 密 切 且 正 常 的 接 合 組 織 慢 慢 形 成 後, 支 架 可 自 然 代 謝 分 解 3 生 長 因 子 : 生 長 因 子 與 細 胞 的 受 體 結 合 後, 會 在 細 胞 內 引 發 一 系 列 的 化 學 反 應, 而 啟 動 某 些 基 因 的 表 現, 影 響 細 胞 多 種 行 為, 如 生 長 趨 向 與 分 化, 組 織 才 得 以 成 型 二 人 工 皮 膚 發 展 與 應 用 人 工 皮 膚 的 歷 史, 最 早 必 須 溯 及 1980 年 由 哈 佛 大 學 二 位 教 授 Yannas 及 Burke 發 展 出 二 層 結 構 的 皮 膚 結 構 其 上 層 是 由 矽 膠 層 所 組 成, 類 似 人 體 的 表 皮 ; 而 下 層 則 是 由 多 孔 狀 的 類 真 皮 結 構, 其 主 要 成 分 為 小 牛 的 膠 原 蛋 白 及 鯊 魚 的 軟 骨 素 二 者 交 聯 形 成 面 對 急 性 燒 傷 的 病 患, 最 主 要 的 兩 大 問 題 : 一 是 水 分 的 流 失, 與 體 內 的 電 解 質 及 蛋 白 質 的 減 少 ; 二 是 因 缺 乏 了 皮 膚 的 屏 障, 傷 口 容 易 招 致 外 來 的 細 菌 侵 入, 因 而 造 成 敗 血 症 而 這 兩 大 迫 在 眉 睫 的 問 題, 可 以 藉 由 與 生 理 性 相 容 且 可 永 久 覆 蓋 的 人 工 皮 膚 解 決 圖 4-11 人 工 皮 膚 植 入 示 意 圖 12

31 其 重 要 的 設 計 在 於 下 層 的 類 真 皮 部 分, 有 小 洞 形 成, 可 使 患 者 本 身 的 血 管 內 皮 細 胞 及 纖 維 母 細 胞 進 入, 進 而 提 供 良 好 的 血 管 供 應 及 最 後 形 成 患 者 本 身 的 新 真 皮, 取 代 了 原 有 的 人 工 真 皮 而 其 上 皮, 就 是 矽 膠 層, 可 以 很 輕 易 的 撕 去, 再 取 病 患 身 上 取 下 相 當 薄 的 皮 膚 來 作 為 新 上 皮 的 覆 蓋, 可 儘 量 避 免 排 斥 的 問 題! 這 項 組 織 工 程 技 術 已 經 成 為 生 物 科 技 中 的 新 寵 兒, 因 為 製 造 出 的 器 官 較 無 免 疫 排 斥 反 應, 所 以 移 植 的 成 功 效 率 很 高 一 些 組 織 器 官 受 損 的 病 患, 以 後 或 許 不 須 再 為 一 個 合 適 的 移 植 器 官 苦 苦 等 候 了! 如 美 發 明 人 造 視 網 膜, 換 眼 角 膜 免 等 待, 而 完 全 人 工 心 臟 能 獨 立 運 作, 在 美 已 完 成 移 植 首 例 失 明 病 患 福 音, 電 子 眼 最 快 5 年 問 世, 軟 骨 組 織 工 程 再 生 術, 兩 年 內 可 造 福 20 萬 病 患 而 其 中 人 工 皮 膚 可 能 為 糖 尿 病 患 者 帶 來 新 希 望! 組 織 工 程 技 術 就 像 一 個 人 體 魔 術 師, 為 生 物 科 技 帶 來 新 的 契 機! 13

32 高 瞻 生 物 教 材 手 冊 第 一 單 元 : 細 菌 的 質 體 1-1 細 菌 質 體 的 特 性 1-2 細 菌 質 體 與 生 物 技 術 1-3 細 菌 質 體 的 分 離 第 二 單 元 :DNA 電 泳 2-1 DNA 電 泳 的 原 理

33 第 一 單 元 : 細 菌 的 質 體 1-1 細 菌 質 體 的 特 性 細 菌 質 體 是 細 菌 染 色 體 外 的 小 型 環 狀 DNA 分 子 ( 通 常 只 有 數 千 個 鹼 基 對 (kb)), 具 有 自 己 的 基 因 表 現 及 複 製 原 (origin)( 圖 一 ), 它 們 能 在 宿 主 細 胞 裏 自 主 複 製, 而 由 子 細 胞 繼 承 質 體 通 常 帶 有 賦 予 細 菌 專 門 特 性 的 基 因, 例 如 可 以 水 解 抗 生 素 的 酵 素 基 因 一 般 所 帶 有 的 基 因 功 能 可 以 與 染 色 體 互 補, 也 就 是 會 有 一 些 染 色 體 所 沒 有 的 基 因, 所 以 通 常 會 與 染 色 體 DNA 產 生 基 因 互 換 或 是 插 入 染 色 體 DNA 中, 使 染 色 體 DNA 獲 得 原 本 不 具 有 的 基 因 質 體 的 遺 傳 方 式 為 非 染 色 體 遺 傳 的 方 式 傳 遞 給 下 一 代, 而 為 直 接 分 給 下 一 代 此 外 質 體 可 以 跑 出 細 菌 外 面, 並 且 到 另 外 一 種 細 菌 內 複 製 繁 衍, 使 得 後 者 也 產 生 抗 藥 性 ( 圖 二 ) 有 些 質 體 使 宿 主 細 菌 具 備 接 合 生 殖 的 能 力, 因 而 能 促 進 細 菌 間 基 因 的 轉 移 質 體 也 可 以 由 噬 菌 體 ( 即 細 菌 病 毒 ) 從 一 個 細 菌 帶 到 另 一 個 細 菌 中 另 外, 由 於 寄 主 細 胞 ( 自 發 的 或 誘 導 的 ) 裂 解 而 游 離 出 來 的 裸 露 質 體 DNA, 也 能 夠 以 所 謂 轉 化 (transformation) 的 過 程 進 入 新 的 細 胞, 這 種 轉 化 可 以 用 很 多 實 驗 室 技 術 加 強 染 色 體 與 質 體 的 ㄧ 些 比 較 如 下 : 1. 大 小 : 染 色 體 大, 質 體 小 2. 基 因 : 染 色 體 多, 質 體 少 3. 複 製 : 染 色 體 隨 細 菌 複 製, 質 體 自 行 複 製

34 1-2 細 菌 質 體 與 生 物 技 術 在 生 物 技 術 的 應 用 上, 質 體 DNA 常 被 用 以 選 殖 特 定 的 DNA, 以 及 表 現 特 定 的 蛋 白 質 之 用 所 以 質 體 具 選 殖 位 置 (mutiple cloning sites): 供 選 殖 基 因 接 入 的 位 置 ( 圖 三 ) 此 外, 質 體 DNA 上 亦 具 有 耐 抗 生 素 基 因 以 利 選 殖 出 帶 有 此 質 體 的 細 菌 株 ( 圖 四 )

35 1-3 細 菌 質 體 的 分 離 目 前 應 用 於 質 體 DNA 的 純 化 或 抽 取 的 方 法 眾 多, 例 如 鹼 溶 裂 法 (alkaline lysis) 沸 騰 法 (boiling method) 氯 化 銫 (CsCl) 純 化 法, 及 市 售 之 管 柱 層 析 套 組 等 最 常 用 的 鹼 溶 裂 法 效 率 高 價 廉 簡 單 易 學 為 其 優 點, 對 分 子 生 物 初 學 者 而 言, 此 法 為 必 學 的 基 礎 技 術 其 原 理 乃 利 用 鹼 性 處 理 質 體 DNA 及 染 色 體 DNA, 使 兩 者 雙 股 打 開 呈 單 股 狀 態, 再 加 入 酸 中 和, 使 單 股 回 復 為 雙 股 DNA, 同 時 在 急 速 中 和 反 應 中, 染 色 體 DNA 因 分 子 過 於 龐 大 以 致 於 鹼 基 匆 忙 配 對, 形 成 一 雜 亂 無 序 的 巨 大 分 子, 對 水 的 相 對 溶 解 度 低 而 易 被 沈 澱 下 來 相 反 的, 質 體 DNA 因 分 子 小, 兩 單 股 DNA 恢 復 原 鹼 基 配 對 快 而 易 溶 於 水 中, 故 只 要 經 過 離 心, 即 可 將 染 色 體 DNA 與 質 體 DNA 分 離 在 實 驗 步 驟 中, 加 入 溶 液 I 的 目 的 主 要 是 將 細 菌 團 塊 重 新 懸 浮 於 緩 衝 溶 液 中, 溶 液 II 含 有 SDS 及 NaOH, 前 者 可 將 細 菌 溶 解, 後 者 可 將 DNA 變 性, 溶 液 III 是 由 醋 酸 及 鉀 鹽 所 形 成, 前 者 在 於 中 和 鹼 性, 後 者 則 與 DNA 形 成 錯 合 物 而 有 利 於 DNA 的 沈 澱 待 加 入 溶 液 III 後 離 心, 大 部 分 的 蛋 白 質 與 染 色 體 DNA 會 留 在 下 面 的 有 機 層, 而 上 面 的 水 層 所 含 的 質 體 DNA 可 用 酒 精 沈 澱 之,( 亦 有 實 驗 室 用 酚 / 氯 仿 / 異 戊 醇 萃 取 以 去 除 殘 留 的 蛋 白 質 ), 再 以 70% 酒 精 洗 滌 以 去 除 鹽 類 小 量 製 備 (mini-prep) 是 從 轉 形 過 的 大 腸 桿 菌 寄 主 中 分 離 質 體 DNA 之 快 速 方 法, 比 用 CsCl 密 度 梯 度 超 高 速 離 心 的 標 準 大 量 製 備 (large-prep) 簡 單 多 了 小 量 製 備 出 的 DNA 可 應 用 於 分 子 選 殖 (molecular cloning) 實 驗, 例 如 進 行 限 制 酶 切 割 及 電 泳 分 析 等 除 了 鹼 溶 裂 法 及 沸 騰 法, 重 組 DNA 技 術 日 益 進 步, 新 的 方 法 層 出 不 窮, 現 已 有 分 子 生 物 廠 商 發 展 利 用 管 柱 層 析 法 (column chromatography) 進 行 小 量 質 體 DNA 的 製 備, 更 較 傳 統 方 法 省 時, 但 價 格 較 為 昂 貴 ( 圖 )

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37 第 二 單 元 :DNA 電 泳 2-1 DNA 電 泳 的 原 理 DNA 含 有 磷 酸 根, 在 中 性 及 鹼 性 環 境 下 帶 負 電, 通 電 後 會 往 正 極 移 動 洋 菜 膠 體 內 有 許 多 孔 隙, 濃 度 越 高, 孔 隙 越 小 在 電 場 中, 不 同 大 小 的 DNA 片 段, 在 洋 菜 膠 體 的 孔 隙 內 往 正 極 移 動,DNA 體 積 越 大 者, 移 動 時 所 受 的 阻 力 越 大, 使 其 移 動 較 慢 ; 而 體 積 較 小 者, 則 移 動 較 快 因 此 藉 由 洋 菜 膠 體 電 泳 過 程 可 將 不 同 大 小 的 DNA 分 開

38 高 瞻 生 物 學 生 實 驗 手 冊 目 次 實 驗 一 : 細 菌 質 體 的 純 化 實 驗 二 : 洋 菜 膠 電 泳 分 析

39 實 驗 一 : 用 TENS 抽 取 大 腸 桿 菌 質 體 DNA 之 快 速 方 法 一 目 的 : 可 在 短 時 間 內 將 大 腸 桿 菌 質 體 DNA 抽 取 出 來 二 原 理 : 快 速 破 壞 細 胞 壁 和 細 胞 膜 使 DNA 流 出, 然 後 萃 取 DNA 三 材 料 : 含 有 質 體 的 大 腸 桿 菌 E.coli TOP10F' 四 LB 培 養 液 TENS(10mM Tris-HCl ph7.5 1mM EDTA 0.1N NaOH 0.5% SDS) 95% 酒 精 70% 酒 精 五 實 驗 步 驟 : 1. 取 1 ml 的 菌 液 離 心,14000 rpm 2 分 鐘 2. 小 心 倒 掉 上 清 液, 並 預 留 些 微 上 清 液 重 新 懸 浮 菌 液 3. 加 入 300 ml 之 TENS 溶 液, 震 盪 數 秒 4. 加 入 150 ml 之 3 M,NaOAc (ph=5.3) 溶 液, 震 盪 數 秒 5. 離 心 rpm 2 分 鐘, 吸 取 上 清 液 至 乾 淨 的 小 離 心 管 中 6. 加 入 95% 之 酒 精 900 ml, 混 合 均 勻, 離 心 rpm 2 分 鐘 7. 倒 掉 上 清 液, 加 入 1 ml 之 70% 酒 精, 離 心 rpm 2 分 鐘 8. 將 酒 精 倒 掉, 使 DNA 風 乾 9. 以 20 ml 的 無 菌 水 溶 之 實 驗 二 : 洋 菜 膠 電 泳 分 析 一 目 的 : 以 洋 菜 膠 體 電 泳 法 將 DNA 片 段 依 大 小 予 以 分 離 二 原 理 :DNA 含 有 磷 酸 根, 在 中 性 及 鹼 性 環 境 下 帶 負 電, 通 電 後 會 往 正 極 移 動 洋 菜 膠 體 內 有 許 多 孔 隙, 濃 度 越 高, 孔 隙 越 小 在 電 場 中, 不 同 大 小 的 DNA 片 段, 在 洋 菜 膠 體 的 孔 隙 內 往 正 極 移 動,DNA 體 積 越 大 者, 移 動 時 所 受 的 阻 力 越 大, 使 其 移 動 較 慢 ; 而 體 積 較 小 者, 則 移 動 較 快 因 此 藉 由 洋 菜 膠 體 電 泳 的 過 程 可 將 不 同 大 小 的 DNA 分 開 三 材 料 : 質 體 DNA 四 藥 品 : TAE 緩 衝 液 1% 洋 菜 膠 ( 加 入 0.35 公 克 洋 菜 膠 置 盛 有 35 毫 升 的 1x TAE 之 燒 杯 中, 加 熱 煮 沸 使 洋 菜 膠 溶 解 ) 6x Loading Dye [0.25% Bromophenol Blue, 0.25% Xylene Cyanol FF,40% (w/v) 甘 油, 溶 解 於 ddh2o 中 ] Ethidium Bromide 已 定 量 的 DNA marker

40 實 驗 步 驟 : 1. 置 備 35 毫 升 的 1% 洋 菜 膠, 降 溫 後 倒 入 膠 片 盤 中 並 插 入 17 齒 (tooth/well) 的 塑 膠 片 (comb) 於 頂 端, 冷 卻 約 30 分 鐘 凝 固 後 方 可 使 用 2. 加 入 2μl 的 6 Loading Dye 至 樣 品, 混 合 振 盪 後 於 室 溫 6,000 rpm 離 心 10 秒 鐘 3. 將 膠 片 盤 放 入 核 酸 電 泳 槽 中, 倒 入 約 300 毫 升 的 1 TAE 以 蓋 過 膠 片 表 面 4. 用 微 量 吸 管 吸 取 5μl 的 marker 加 入 靠 兩 端 的 孔 中 5. 吸 取 12 μl 的 DNA 樣 品 並 依 序 加 入 膠 片 的 孔 中 6. 蓋 好 電 泳 槽, 通 以 100 伏 特 電 力 約 30 分 鐘, 注 意 藍 色 染 料 自 負 極 向 正 極 移 動 至 離 膠 片 底 部 約 1.5 公 分 處 即 可 停 止 通 電 7. 將 膠 片 於 室 溫 下 以 5ug ml Ethidium Bromide 溶 液 染 色 5 分 鐘 8. 以 紫 外 光 照 射 膠 片 觀 察 紅 色 的 DNA 片 段 分 布 圖, 並 照 相 存 檔