9. 条 件 的 摸 索 10. 方 法 的 介 绍 11. 结 果 分 析 一 原 理 1975 年,Southern 建 立 了 将 DNA 转 移 到 硝 酸 纤 维 素 膜 (NC 膜 ) 上, 并 利 用 DNA-RNA 杂 交 检 测 特 定 的 DNA 片 段 的 方 法, 称 为 S

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1 Western Blot 详 解 ( 原 理 分 类 试 剂 步 骤 及 问 题 解 答 ) Western 免 疫 印 迹 (Western Blot) 是 将 蛋 白 质 转 移 到 膜 上, 然 后 利 用 抗 体 进 行 检 测 对 已 知 表 达 蛋 白, 可 用 相 应 抗 体 作 为 一 抗 进 行 检 测, 对 新 基 因 的 表 达 产 物, 可 通 过 融 合 部 分 的 抗 体 检 测 本 文 主 要 通 过 以 下 几 个 方 面 来 详 细 地 介 绍 一 下 Western Blot 技 术 : 一 原 理 二 分 类 i. 放 射 自 显 影 ii. 底 物 化 学 发 光 ECL iii. 底 物 荧 光 ECF iv. 底 物 DAB 呈 色 三 主 要 试 剂 四 主 要 步 骤 五 实 验 常 见 的 问 题 指 南 1. 参 考 书 推 荐 2. 针 对 样 品 的 常 见 问 题 3. 抗 体 4. 滤 纸 胶 和 膜 的 问 题 5.Marker 的 相 关 疑 问 6. 染 色 的 选 择 7. 参 照 的 疑 问 8. 缓 冲 液 配 方 的 常 见 问 题

2 9. 条 件 的 摸 索 10. 方 法 的 介 绍 11. 结 果 分 析 一 原 理 1975 年,Southern 建 立 了 将 DNA 转 移 到 硝 酸 纤 维 素 膜 (NC 膜 ) 上, 并 利 用 DNA-RNA 杂 交 检 测 特 定 的 DNA 片 段 的 方 法, 称 为 Southern 印 迹 法 而 后 人 们 用 类 似 的 方 法, 对 RNA 和 蛋 白 质 进 行 印 迹 分 析, 对 RNA 的 印 迹 分 析 称 为 Northern 印 迹 法, 对 单 向 电 泳 后 的 蛋 白 质 分 子 的 印 迹 分 析 称 为 Western 印 迹 法, 对 双 向 电 泳 后 蛋 白 质 分 子 的 印 迹 分 析 称 为 Eastern 印 迹 法 与 Southern 或 Northern 杂 交 方 法 类 似, 但 Western Blot 采 用 的 是 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳, 被 检 测 物 是 蛋 白 质, 探 针 是 抗 体, 显 色 用 标 记 的 二 抗 经 过 PAGE 分 离 的 蛋 白 质 样 品, 转 移 到 固 相 载 体 ( 例 如 硝 酸 纤 维 素 薄 膜 ) 上, 固 相 载 体 以 非 共 价 键 形 式 吸 附 蛋 白 质, 且 能 保 持 电 泳 分 离 的 多 肽 类 型 及 其 生 物 学 活 性 不 变 以 固 相 载 体 上 的 蛋 白 质 或 多 肽 作 为 抗 原, 与 对 应 的 抗 体 起 免 疫 反 应, 再 与 酶 或 同 位 素 标 记 的 第 二 抗 体 起 反 应, 经 过 底 物 显 色 或 放 射 自 显 影 以 检 测 电 泳 分 离 的 特 异 性 目 的 基 因 表 达 的 蛋 白 成 分 该 技 术 也 广 泛 应 用 于 检 测 蛋 白 水 平 的 表 达

3 二 分 类 现 常 用 的 有 底 物 化 学 发 光 ECL 和 底 物 DAB 呈 色, 体 同 水 平 和 实 验 条 件 的 是 用 第 一 种 方 法, 目 前 发 表 文 章 通 常 是 用 底 物 化 学 发 光 ECL 只 要 买 现 成 的 试 剂 盒 就 行, 操 作 也 比 较 简 单, 原 理 如 下 ( 二 抗 用 HRP 标 记 ): 反 应 底 物 为 过 氧 化 物 + 鲁 米 诺, 如 遇 到 HRP, 即 发 光, 可 使 胶 片 曝 光, 就 可 洗 出 条 带 三 主 要 试 剂 1 丙 烯 酰 胺 和 N,N - 亚 甲 双 丙 烯 酰 胺, 应 以 温 热 ( 以 利 于 溶 解 双 丙 稀 酰 胺 ) 的 去 离 子 水 配 制 含 有 29%(w/v) 丙 稀 酰 胺 和 1%(w/v)N,N - 亚 甲 双 丙 烯 酰 胺 储 存 液 丙 稀 酰 胺 29g,N,N- 亚 甲 叉 双 丙 稀 酰 胺 1g, 加 H2O 至 100ml ) 储 于 棕 色 瓶,4 避 光 保 存 严 格 核 实 PH 不 得 超 过 7.0, 因 可 以 发 生 脱 氨 基 反 应 是 光 催 化 或 碱 催 化 的 使 用 期 不 得 超 过 两 个 月, 隔 几 个 月 须 重 新 配 制 如 有 沉 淀, 可 以 过 滤

4 2 十 二 烷 基 硫 酸 钠 SDS 溶 液 :10%(w/v)0.1gSDS,1mlH2O 去 离 子 水 配 制, 室 温 保 存 3 分 离 胶 缓 冲 液 :1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris 和 48ml1mol/LHCL 混 合, 加 水 稀 释 到 100ml 终 体 积 过 滤 后 40C 保 存 4 浓 缩 胶 缓 冲 液 :0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris 溶 于 40mlH2O 中, 用 约 48ml 1mol/L HCL 调 至 ph6.8 加 水 稀 释 到 100ml 终 体 积 过 滤 后 40C 保 存 这 两 种 缓 冲 液 必 须 使 用 Tris 碱 制 备, 再 用 HCL 调 节 PH 值, 而 不 用 Tris.CL 5 TEMED 原 溶 液 N,N,N N 四 甲 基 乙 二 胺 催 化 过 硫 酸 铵 形 成 自 由 基 而 加 速 两 种 丙 稀 酰 胺 的 聚 合 PH 太 低 时, 聚 合 反 应 受 到 抑 制 10%(w/v) 过 硫 酸 胺 溶 液 提 供 两 种 丙 稀 酰 胺 聚 合 所 必 须 的 自 由 基 去 离 子 水 配 制 数 ml, 临 用 前 配 制. 6 SDS-PAGE 加 样 缓 冲 液 :ph mol/L Tris 缓 冲 液 8ml, 甘 油 6.4ml, 10%SDS 12.8ml, 巯 基 乙 醇 3.2ml,0.05% 溴 酚 蓝 1.6ml,H2O 32ml 混 匀 备 用 按 1:1 或 1:2 比 例 与 蛋 白 质 样 品 混 合, 在 沸 水 终 煮 3min 混 匀 后 再 上 样, 一 般 为 20-25ul, 总 蛋 白 量 100μg 7 Tris- 甘 氨 酸 电 泳 缓 冲 液 :30.3gTris,188g 甘 氨 酸,10gSDS, 用 蒸 馏 水 溶 解 至 1000ml, 得 0.25mol/L Tris-1.92mol/L 甘 氨 酸 电 极 缓 冲 液 临 用 前 稀 释 10 倍 8 转 移 缓 冲 液 : 配 制 1L 转 移 缓 冲 液, 需 称 取 2.9g 甘 氨 酸 5.8gTris 碱 0.37g SDS, 并 加 入 200ml 甲 醇, 加 水 至 总 量 1L 9 丽 春 红 染 液 储 存 液 : 丽 春 红 S 2g 三 氯 乙 酸 30g 磺 基 水 杨 酸 30g 加 水 至 100ml 用 时 上 述 储 存 液 稀 释 10 倍 即 成 丽 春 红 S 使 用 液 使 用 后 应 予 以 废 弃 10 脱 脂 奶 粉 5%(w/v)

5 11 NaN3 0.02% 叠 氮 钠 ( 有 毒, 戴 手 套 操 作 ), 溶 于 磷 酸 缓 冲 盐 溶 液 (PBS) 12 Tris 缓 冲 盐 溶 液 (TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5),500mmol/LnaCl 13 Tween20(15) 鼠 抗 人 -MMP-9(16) 鼠 抗 人 -TIMP-1 14 过 氧 化 物 酶 标 记 的 第 二 抗 体 15 NBT( 溶 于 70% 二 甲 基 甲 酰 胺,75mg/ml) 16 BCIP( 溶 于 100% 二 甲 基 甲 酰 胺,50mg/ml) mmol/LTris-HCL(pH9.5) mmol/L NaCl 19 50mmol/LTris-HCL(pH7.5),5mmol/L EDTA ( 可 以 参 看 分 子 克 隆 ) 四 主 要 步 骤 生 物 秀 为 您 搜 集 了 现 阶 段 几 乎 网 上 所 有 的 Western Blot 的 中 英 文 资 料, 仅 供 实 验 参 考, 可 以 根 据 自 己 实 验 的 实 际 情 况 进 行 调 整 : Western Blot PROTOCOL: 五 实 验 常 见 的 问 题 指 南 根 据 问 题 的 类 型 主 要 分 成 以 下 几 类 ( 以 下 资 料 权 作 参 考, 请 勿 盲 目 模 仿!): 1. 参 考 书 推 荐 A. 对 初 学 者 看 什 么 资 料 比 较 好? 解 答 : 抗 体 技 术 实 验 指 南 和 Antibodies(a laboratory manual, wrote by Ed Harlow,david lane) 两 本 书 不 错

6 2. 针 对 样 品 的 常 见 问 题 B. 做 线 粒 体 膜 UCP2 蛋 白 的 Western Blot ( 以 下 简 写 成 Western Blot), 提 取 线 粒 体 后 冻 存 ( 未 加 蛋 白 酶 抑 制 剂 ), 用 的 博 士 德 的 一 抗, 开 始 还 有 点 痕 迹, 现 在 越 来 越 差, 上 样 量 已 加 到 120μg, 换 了 个 santa cloz 的 一 抗 仍 不 行 是 什 么 原 因? 蛋 白 酶 抑 制 剂 单 加 PMSF 行 吗? 解 答 : 怀 疑 是 样 品 问 题, 可 能 是 :1, 样 品 不 能 反 复 冻 融 ;2, 样 品 未 加 蛋 白 酶 抑 制 剂 同 时, 建 议 检 查 Western Blot 过 程, 提 高 一 抗 浓 度 对 于 加 蛋 白 酶 抑 制 剂 来 说, 一 般 加 PMSF 就 可 以 了, 最 好 能 多 加 几 中 种 蛋 白 酶 抑 制 剂 E. 同 一 蛋 白 样 品 能 同 时 进 行 两 种 因 子 的 Western Blot 检 测 吗? 解 答 : 当 然 可 以, 有 的 甚 至 可 以 同 时 测 几 十 种 样 品 F. 如 果 目 标 蛋 白 是 膜 蛋 白 或 是 胞 浆 蛋 白, 操 作 需 要 注 意 什 么? 解 答 : 如 果 是 膜 蛋 白 和 胞 浆 蛋 白, 所 用 的 去 垢 剂 就 要 温 和 得 多, 这 时 最 好 加 上 NaF 去 抑 制 磷 酸 化 酶 的 活 性 G. 我 的 样 品 的 蛋 白 含 量 很 低, 每 微 升 不 到 1 微 克, 但 是 在 转 膜 时 经 常 会 发 现 只 有 一 部 分 蛋 白 转 到 了 膜 上, 就 是 在 转 膜 后 染 胶 发 现 有 的 孔 所 有 的 蛋 白 条 带 都 在, 只 是 颜 色 变 淡 了, 有 什 么 办 法 可 以 解 决? 解 答 : 你 可 以 加 大 上 样 量, 没 有 问 题, 还 有 转 移 时 你 可 以 用 减 少 电 流 延 长 时 间, 多 加 5-10% 甲 醇 H. 想 分 离 的 蛋 白 是 分 子 量 260kd 的,SDS-PAGE 电 泳 的 分 离 胶 浓 度 多 大 合 适? 积 层 胶 的 浓 度 又 该 用 多 少? 这 么 大 分 子 量 的 蛋 白 容 易 作 Western Blot 吗? 解 答 :260kd 的 蛋 白 不 好 做, 分 离 胶 用 6%, Stacking Gel 3.5%

7 I. 如 果 上 样 量 超 载, 要 用 什 么 方 法 来 增 加 上 样 量? 如 果 需 要 加 大 上 样 量 使 原 来 弱 的 条 带 能 看 清 楚 解 答 : 可 以 浓 缩 样 品, 也 可 以 根 据 你 的 目 标 分 子 量 透 析 掉 一 部 分 小 分 子 蛋 白 一 般 地, 超 载 30% 是 不 会 有 问 题 的 如 果 已 经 超 了 不 少 了, 而 且 小 分 子 量 的 也 要, 可 以 考 虑 加 大 胶 的 厚 度, 可 以 试 试 1.5mm 的 comb J. 蛋 白 变 性 后 可 以 存 放 多 久? 解 答 :-80, 一 两 年 没 有 问 题 最 关 键 两 条 : 不 要 被 蛋 白 酶 水 解 掉 ; 不 要 被 细 菌 消 化 掉 ( 也 是 被 酶 水 解 了 ) K. 我 所 测 定 的 蛋 白 分 子 量 是 105KD, 按 理 说 分 离 胶 应 当 采 用 7.5%, 但 我 所 查 资 料 却 要 求 分 离 胶 和 浓 缩 胶 均 采 用 11% 的 配 方, 不 知 为 何? 解 答 : 上 述 您 提 到 的 两 种 凝 胶 均 可 以 使 用, 因 为 105KD 的 蛋 白 在 上 述 两 种 胶 的 线 性 分 辨 范 围 内, 但 需 注 意 条 带 位 置 L. 接 下 来 我 准 备 采 用 DAB 显 色 技 术, 二 抗 是 生 物 素 化 的 多 克 隆 抗 体, 三 抗 是 亲 和 素 生 物 素 体 系, 不 知 采 用 这 样 的 方 案 后, 封 闭 液 是 否 要 作 调 整, 能 否 再 用 5% 的 脱 脂 奶 粉 呢? 好 像 有 资 料 说 脱 脂 奶 粉 会 影 响 亲 和 素 生 物 素 的 生 成, 是 吗? 解 答 : 不 能 使 用 脱 脂 奶 粉, 因 为 脱 脂 奶 粉 中 含 生 物 素, 用 BSA 代 替 应 该 好 一 点. M. 还 有 一 问 题, 一 般 一 次 上 样 的 蛋 白 总 量 是 多 少, 跟 目 的 蛋 白 的 表 达 量 有 关 系 吗? 解 答 :Western Blot 一 般 上 样 微 克 不 等, 结 果 跟 目 的 蛋 白 的 丰 度 上 样 量 一 二 抗 的 量 和 抚 育 时 间 都 有 关 系, 也 与 显 色 时 间 长 短 有 关 开 始 摸 条 件 时,

8 为 了 拿 到 阳 性 结 果, 各 个 步 骤 都 可 以 量 多 一 点 时 间 长 一 点, 当 然 背 景 也 就 出 来 了 要 拿 到 好 的 结 果, 如 果 抗 体 好 的 话 比 较 容 易, 抗 体 不 好 的 话 就 需 要 反 复 地 试 了, 当 然 有 的 不 适 合 Western Blot 的 怎 样 做 也 不 行 所 以 拿 到 好 的 结 果 不 容 易 N. 做 组 织 样 品 的 western 的 时 候, 处 理 样 品 有 什 么 诀 窍 吗? 还 有, 您 用 过 大 牛 血 清 做 封 闭 剂 吗? 浓 度 如 何? 效 果 是 不 是 比 BSA 好 一 点? 解 答 : 必 须 进 行 研 磨 匀 浆 超 声 处 理, 蛋 白 质 溶 解 度 会 更 好, 离 心 要 充 分, 膜 蛋 白 需 用 更 剧 烈 的 方 法 抽 提, 低 丰 度 膜 蛋 白 可 能 还 要 分 步 抽 提 ( 超 速 离 心 ) 还 有 一 点 就 是 组 织 中 的 蛋 白 酶 活 性 更 强, 需 要 注 意 抑 制 蛋 白 酶 的 活 性 ( 加 入 PMS F 和 蛋 白 酶 抑 制 剂 cocktail), 封 闭 剂 一 般 5% 脱 脂 奶 粉 较 常 用 如 果 一 抗 为 多 克 隆 抗 体, 使 用 BSA 也 是 不 错 的 选 择 O. 您 是 否 可 以 介 绍 一 下 大 分 子 量 蛋 白 200KD, 在 做 western 要 注 意 什 么 呢? 解 答 : 做 200kd 蛋 白 的 Western Blot 时 要 注 意, 分 离 胶 最 好 选 择 >7% 的 ; 剥 胶 时 要 小 心 ; 转 移 时 间 需 要 相 应 延 长 ; 要 做 分 子 量 参 照 ( 否 则 出 现 杂 带 不 知 道 如 何 分 析 ) P. 有 什 么 方 法 可 以 提 高 上 样 量? 解 答 : 可 以 浓 缩 样 品 ; 增 大 上 样 体 积 来 增 大 上 样 量 Q. 我 要 检 测 的 目 的 蛋 白 是 分 子 量 大 概 为 42kd 的 膜 蛋 白, 膜 蛋 白 提 取 可 不 可 以 不 用 到 超 速 离 心 机, 有 没 有 直 接 用 低 温 高 速 离 心 机 就 可 以 的 提 到 膜 蛋 白 的 方 法, 42kd 的 蛋 白 分 子 量 算 不 算 大? 解 答 : 如 是 需 要 提 取 膜 蛋 白,( 而 不 是 只 需 要 提 取 膜 蛋 白 ), 可 以 用 Ripa buffer

9 提 取 膜 蛋 白 和 胞 浆 蛋 白, 用 这 个 做 Western Blot 就 可 以 了 如 果 是 非 要 只 提 取 膜 蛋 白 就 要 用 到 超 速 离 心 机 42kd 不 算 大, 也 不 算 小, 所 以, 可 以 按 照 一 般 的 转 移 方 法 实 施 R. 蛋 白 的 上 样 量 有 没 有 什 么 具 体 的 要 求? 解 答 : 上 样 量 要 根 据 实 验 的 要 求 来 定, 如 果 要 求 是 定 量 和 半 定 量 的 Western Blot 则 上 样 量 要 均 等, 如 果 只 是 要 定 性, 则 没 有 太 大 的 关 系, 尽 量 多 上 就 行 了, 但 是 不 要 超 过 0.3μg/mm2 S. 一 抗, 二 抗 的 比 例 是 否 重 要? 解 答 : 比 较 重 要, 调 整 好 一 抗, 二 抗 的 比 例, 可 以 去 掉 部 分 非 特 异 的 本 底 3. 抗 体 T. 做 细 胞 信 号 传 导, 要 做 磷 酸 化 某 因 子 Western Blot, 其 二 抗 有 何 要 求? 解 答 : 对 二 抗 无 要 求, 要 看 你 实 验 条 件 来 选 择, 一 般 推 荐 用 HRP 标 记 的 二 抗 U. 同 一 公 司 的 另 外 抗 体 用 这 个 稀 释 度 做 出 来 效 果 很 好, 所 以 没 做 预 试, 怕 费 时 间, 用 什 么 样 的 稀 释 度 比 较 好 呢? 我 用 的 ELL+plus 试 剂 盒 显 色 转 膜 过 夜, 一 抗 孵 育 也 是 过 夜 的, 若 封 闭 也 过 夜 的 话 就 要 四 天 才 看 的 到 结 果 了 解 答 : 不 同 抗 体, 即 使 是 同 一 公 司 的 抗 体, 其 最 佳 的 抗 体 稀 释 度 也 是 不 一 样 的, 需 要 你 实 验 摸 索 我 觉 得 转 膜 过 夜 好 像 没 有 必 要 吧, 转 膜 的 目 的 也 就 是 将 蛋 白 转 到 膜 上 就 行 啦, 何 必 浪 费 时 间 呢 至 于 具 体 的 转 膜 时 间, 还 要 看 你 的 目 的 蛋 白 分 子 量 的 大 小 ; 转 膜 的 设 备, 是 半 干 式, 还 是 湿 式 一 抗 当 然 可 以 过 夜, 如 果 你 想 所 短 Western Blot 时 间 的 话, 可 以 增 高 一 抗 的 孵 育 温 度, 我 们 实 验 室 一 般 37

10 度, 两 小 时 就 足 够 了 ; 你 可 以 参 照 抗 体 说 明 书 至 于 一 抗 和 二 抗 得 稀 释 度, 你 可 以 一 抗 1:1500; 二 抗 1:20000 试 试 另 外 建 议 你 洗 膜 时, 多 洗 几 次, 最 好 是 在 封 闭 ; 一 抗 和 二 抗 后 至 少 是 5x5min, 跑 一 张 好 膜 不 容 易, 多 尽 点 心 吧, 这 样 不 会 浪 费 你 的 时 间, 只 会 节 省 你 的 时 间! V. 免 疫 组 化 和 Western Blot 可 以 用 同 一 种 抗 体 吗? 解 答 : 免 疫 组 化 时 抗 体 识 别 的 是 未 经 变 性 处 理 的 抗 原 决 定 簇 ( 又 称 表 位 ), 有 些 表 位 是 线 性 的, 而 有 的 属 于 构 象 型 ; 线 性 表 位 不 受 蛋 白 变 性 的 影 响, 天 然 蛋 白 和 煮 后 的 蛋 白 都 含 有 ; 构 象 型 表 位 由 于 受 蛋 白 空 间 结 构 限 制, 煮 后 变 性 会 消 失 如 果 你 所 用 的 抗 体 识 别 的 是 蛋 白 上 连 续 的 几 个 氨 基 酸, 也 就 是 线 性 表 位, 那 么 这 种 抗 体 可 同 时 用 于 免 疫 组 化 和 Western, 而 如 果 抗 体 识 别 构 象 形 表 位, 则 只 能 用 于 免 疫 组 化 一 般 抗 体 说 明 书 上 都 有 注 明 此 种 抗 体 识 别 的 氨 基 酸 区 间 ( 限 于 单 抗 ) W. Western Blot 中 抗 体 的 重 复 应 用 问 题 解 答 : 抗 体 工 作 溶 液 一 般 不 主 张 储 存 反 复 使 用, 但 是 如 抗 体 比 较 珍 贵, 可 反 复 使 用 2-3 次 稀 释 后 应 在 2-3 天 内 使 用,4 度 保 存, 避 免 反 复 冻 融 4. 滤 纸 胶 和 膜 的 问 题 X. NC 膜 \ PVDF 膜 \ 尼 龙 膜 怎 样 鉴 别? 解 答 : 尼 龙 膜 是 较 理 想 的 核 酸 固 相 支 持 物, 有 多 种 类 型 ; 硝 酸 纤 维 素 膜 是 目 前 应 用 最 广 的 一 种 固 相 支 持 物, 价 格 最 便 宜 ;PVDF 膜 介 于 二 者 之 间 就 结 合 能 力 而 言 : 尼 龙 膜 结 合 DNA 和 RNA 能 力 可 达 μg/cm2, 可 结

11 合 短 至 10bp 的 核 酸 片 段 ; 硝 酸 纤 维 素 膜 结 合 DNA 和 RNA 能 力 可 达 μg/cm2, 对 于 200bp 的 核 酸 片 段 结 合 能 力 不 强 ;PVDF 膜 结 合 DNA 和 RNA 能 力 可 达 μg/cm2 就 温 度 适 应 性 而 言 : 尼 龙 膜 经 烘 烤 或 紫 外 线 照 射 后, 核 酸 中 的 部 分 嘧 啶 碱 基 可 与 膜 上 的 正 电 荷 结 合 ; 硝 酸 纤 维 素 膜 依 靠 疏 水 性 相 互 作 用 结 合 DNA, 结 合 不 牢 固 ; PVDF 膜 结 合 牢 固, 耐 高 温, 特 别 适 合 于 蛋 白 印 迹 就 韧 性 而 言 : 尼 龙 膜 较 强 ; 硝 酸 纤 维 素 膜 较 脆, 易 破 碎 ;PVDF 膜 较 强 就 重 复 性 而 言 : 尼 龙 膜 可 反 复 用 于 分 子 杂 交, 杂 交 后, 探 针 分 子 可 经 碱 变 性 被 洗 脱 下 来 ; 硝 酸 纤 维 素 膜 不 能 重 复 使 用 ;PVDF 膜 可 以 重 复 使 用 Y. 在 做 Western Blot 时,PBDF 膜 用 甲 醇 浸 泡 的 目 的? 解 答 :PVDF 膜 用 甲 醇 泡 的 目 的 是 为 了 活 化 PVDF 膜 上 面 的 正 电 基 团, 使 它 更 容 易 跟 带 负 电 的 蛋 白 质 结 合, 做 小 分 子 的 蛋 白 转 移 时 多 加 甲 醇 也 是 这 个 目 的 Z. 检 测 磷 酸 化 的 JNK 和 非 磷 酸 化 的 JNK 可 以 在 同 一 张 膜 上 吗? 解 答 : 可 以 AA. 转 膜 后 经 丽 春 红 染 色 的 条 带, 为 什 么 大 蛋 白 分 子 的 一 端 ( 即 点 样 空 的 一 侧 ) 的 转 膜 好 象 不 是 很 好, 为 什 么? 解 答 : 这 是 正 常 的, 大 分 子 的 蛋 白 转 移 的 慢, 你 延 长 转 移 时 间 和 电 流, 大 分 子 一 端 就 会 好 的 多, 但 是 小 分 子 的 就 有 可 能 会 变 淡

12 BB. 我 想 问 您 裂 解 细 胞 用 三 去 污 裂 解 法, 还 是 用 上 样 缓 冲 液? 解 答 : 用 上 样 缓 冲 液, 这 样 有 几 个 好 处, 可 以 提 取 总 蛋 白, 同 时 又 可 以 让 磷 酸 化 酶 失 活 CC. 采 用 tank system 有 什 么 讲 究? 解 答 : 建 议 低 电 压, 长 时 间,( 一 般 tank System 用 衡 压 好 点 ), 如 28V 14-16hrs DD. 做 HSP WESTEN 定 量, 同 样 的 抗 体 免 疫 组 化 能 做 出, 而 WESTEN 却 不 能? 解 答 : 这 多 半 是 抗 体 的 问 题, 要 看 抗 体 的 说 明, 是 否 能 做 Western Blot 和 IHC EE. 膜 一 般 要 如 何 处 理? 解 答 : 一 般 用 甲 醇 泡 泡 就 可 以 了 FF. 如 果 是 6 8 转 印 膜, 要 加 多 少 一 抗? 解 答 : 一 抗 的 稀 释 度 是 有 说 明 的, 根 据 你 的 一 抗 看 看 就 知 道 了, 但 是 那 么 大 的 膜 孵 育 体 积 一 般 最 少 为 3-5ml GG. 上 下 槽 缓 冲 液 有 何 要 求, 怎 样 才 能 达 到 最 佳 效 果 解 答 : 无 要 求 HH. 跑 电 泳 的 时 候 配 的 胶 总 是 缩 是 什 么 原 因 呢? 是 有 的 成 分 不 对 吗? 解 答 : 没 什 么 问 题, 就 是 你 胶 里 的 水 分 被 蒸 发 了 过 夜 时 拿 保 鲜 膜 包 起 来, 在 里 面 加 点 水 保 持 湿 度 就 可 以 了 如 果 过 夜, 胶 里 的 水 分 被 蒸 发, 采 用 保 鲜 膜 包 上 也

13 可 以 ; 也 可 能 母 液 (30% 聚 丙 酰 胺 ) 有 问 题, 你 可 以 重 新 配 制 一 份 观 察 ; 能 够 替 换 的 试 剂, 尽 量 换 一 下, 选 用 好 的 试 剂, 避 免 找 问 题 麻 烦 脱 色 液 中 甲 醇 的 含 量 太 高 也 会 造 成 胶 缩 II. 膜 滤 纸 胶 大 小 有 何 讲 究? 解 答 : 如 果 是 用 的 是 半 干 转, 顺 序 为 : 阴 极 - 滤 纸 - 胶 - 膜 - 滤 纸 滤 纸 的 长 宽 分 别 比 胶 小 1-2mm, 而 膜 的 长 宽 分 别 比 胶 大 1-2mm 绝 对 禁 忌 : 上 下 两 层 滤 纸 因 为 过 大 而 相 互 接 触, 这 样 会 短 路, 电 流 不 会 通 过 胶 和 滤 纸 JJ. 蛋 白 质 的 分 子 量 跨 度 很 大, 如 要 分 离 小 21KD, 中 至 66KD, 大 至 170KD, 可 以 一 次 做 好 吗? 解 答 : 这 么 广 的 分 布 不 好 转 移, 一 般 建 议 :21kd 和 66kd 可 以 一 起 转,12% SDS-PAge, 湿 转 36V,3-5hrs 就 可 以 了, 可 以 根 据 你 实 验 室 的 经 验 调 节 ; 170kd 用 7%SDS-page, 48V 10hrs-16hrs KK. 不 能 很 好 地 将 大 分 子 量 蛋 白 转 移 到 膜 上, 转 移 效 率 低 怎 么 样 解 决? 解 答 : 可 以 考 虑 : 转 移 缓 冲 液 中 加 入 20% 甲 醇 ( 是 指 终 浓 度 )( 优 化 的 转 移 缓 冲 液, 可 以 参 考 蛋 白 质 技 术 手 册 ), 因 为 甲 醇 可 降 低 蛋 白 质 洗 脱 效 率, 但 可 增 加 蛋 白 质 和 NC 膜 的 结 合 能 力, 甲 醇 可 以 防 止 凝 胶 变 形, 甲 醇 对 高 分 子 量 蛋 白 质 可 延 长 转 移 时 间 ; 转 移 缓 冲 液 加 入 终 浓 度 0.1%SDS, 也 是 为 了 增 加 转 移 效 率 ; 用 优 质 的 转 移 膜, 或 使 用 小 孔 径 的 NC 膜 (0.2 微 米 ); 使 用 戊 二 醛 交 联 ; 低 浓 度 胶, 如 低 至 6% 太 大 时 还 可 以 考 虑 用 琼 脂 糖 胶 ; 提 高 转 移 电 压 / 电 流 ; 增 加 转 移 时 间

14 LL. 如 何 选 择 最 合 适 的 蛋 白 杂 交 膜? 解 答 : 蛋 白 质 印 迹 杂 交 是 分 子 生 物 学 实 验 中 极 为 常 用 的 一 门 技 术 选 择 质 量 上 层 合 乎 要 求 方 便 适 用 的 杂 交 膜 是 决 定 这 项 实 验 成 败 的 重 要 环 节 根 据 杂 交 方 案 被 转 移 生 物 大 分 子 的 特 性 以 及 分 子 大 小 等 等 因 素, 我 们 要 量 体 裁 衣, 从 杂 交 膜 的 材 质 孔 径 和 规 格 上 都 要 做 出 合 理 的 选 择 硝 酸 纤 维 素 膜 : 硝 酸 纤 维 素 膜 是 蛋 白 印 迹 实 验 的 标 准 固 相 支 持 物 在 低 离 子 转 移 缓 冲 液 的 环 境 下, 大 多 数 带 负 电 荷 的 蛋 白 质 会 与 硝 酸 纤 维 素 膜 发 生 疏 水 作 用 而 高 亲 和 力 的 结 合 在 一 起, 虽 然 这 其 中 的 机 制 还 不 是 十 分 清 楚, 但 由 于 硝 酸 纤 维 素 膜 的 这 个 特 性, 而 且 易 于 封 闭 非 特 异 性 结 合, 从 而 得 到 了 广 泛 的 应 用 在 非 离 子 型 的 去 污 剂 作 用 下, 结 合 的 蛋 白 还 可 以 被 洗 脱 下 来 根 据 被 转 移 的 蛋 白 分 子 量 大 小, 要 选 择 不 同 孔 径 的 硝 酸 纤 维 素 膜 因 为 随 着 膜 孔 径 的 不 断 减 小, 膜 对 低 分 子 量 蛋 白 的 结 合 就 越 牢 固 但 是 膜 孔 径 如 果 小 于 0.1mm, 蛋 白 的 转 移 就 很 难 进 行 了 因 此, 我 们 通 常 用 0.45μm 和 0.2μm 两 种 规 格 的 硝 酸 纤 维 素 膜 大 于 20kD 的 蛋 白 就 可 以 用 0.45μm 的 膜, 小 于 20kD 的 蛋 白 就 要 用 0.2μm 的 膜 了, 如 果 用 0.45μm 的 膜 就 会 发 生 Blowthroμgh 的 现 象 从 膜 的 质 地 上 来 看, 最 重 要 的 指 标 就 是 单 位 面 积 上 能 够 结 合 的 蛋 白 的 量 硝 酸 纤 维 素 膜 的 结 合 能 力 主 要 与 膜 的 硝 酸 纤 维 素 的 纯 度 有 关, 市 场 上 有 些 硝 酸 纤 维 素 膜 通 常 会 还 有 大 量 的 醋 酸 纤 维 素, 因 而 降 低 了 蛋 白 的 结 合 量 S&S 公 司 采 用 的 是 100% 纯 度 的 硝 酸 纤 维 素, 保 证 了 最 大 的 蛋 白 结 合 量, 可 达 μg/cm2 由 于 100% 的 纯 度, 因 而 也 大 大 减 少 了 非 特 异 性 的 结 合, 降 低 杂 交 背 景, 无 需 高 严 谨 度 的 洗 脱 步 骤 其 次, 膜 的 强 度 和 韧 性 也 是 需 要 考 虑 的 因 素 常 规 的 硝 酸 纤 维 素 膜 比 较 脆, 漂 洗 一 两 次 就 会 破 损, 不 能 反 复 使 用

15 PVDF 转 移 膜 :PVDF 是 一 种 高 强 度 耐 腐 蚀 的 物 质, 通 常 是 用 来 制 造 水 管 的 PVDF 膜 可 以 结 合 蛋 白 质, 而 且 可 以 分 离 小 片 段 的 蛋 白 质, 最 初 是 将 它 用 于 蛋 白 质 的 序 列 测 定, 因 为 硝 酸 纤 维 素 膜 在 Edman 试 剂 中 会 降 解, 所 以 就 寻 找 了 PDVF 作 为 替 代 品, 虽 然 PDVF 膜 结 合 蛋 白 的 效 率 没 有 硝 酸 纤 维 素 膜 高, 但 由 于 它 的 稳 定 耐 腐 蚀 使 它 成 为 蛋 白 测 序 理 想 的 用 品, 一 直 沿 用 至 今 PVDF 膜 与 硝 酸 纤 维 素 膜 一 样, 可 以 进 行 各 种 染 色 和 化 学 发 光 检 测, 也 有 很 广 的 适 用 范 围 这 种 PVDF 膜, 灵 敏 度 分 辨 率 和 蛋 白 亲 和 力 在 精 细 工 艺 下 比 常 规 的 膜 都 要 高, 非 常 适 合 于 低 分 子 量 蛋 白 的 检 测 但 PVDF 膜 在 使 用 之 前 必 需 用 纯 甲 醇 进 行 浸 泡 饱 和 1-5 秒 钟 离 子 交 换 型 转 移 膜 : 硝 酸 纤 维 素 和 PVDF 膜 是 靠 疏 水 作 用 结 合 蛋 白 的, 还 有 一 类 膜 是 根 据 离 子 交 换 的 方 式 结 合 生 物 大 分 子 的 由 DEAE( 二 乙 氨 乙 基 ) 修 饰 的 纤 维 素 制 成 的 DEAE 阴 离 子 交 换 膜 同 样 可 以 作 为 蛋 白 质 印 迹 的 固 相 支 持 物 DEAE 可 以 有 效 的 结 合 阴 离 子 基 团, 包 括 那 些 高 于 其 等 电 点 的 蛋 白 质 在 ph10 以 下, DEAE 基 团 都 能 带 电 荷, 在 低 离 子 强 度 的 转 移 液 中 结 合 蛋 白 分 子 其 最 适 的 ph 环 境 为 5-7 DEAE 膜 可 以 用 于 蛋 白 多 糖 病 毒 酶 以 及 血 红 蛋 白 的 研 究 这 种 0.45μm 孔 径 的 DEAE 膜, 除 了 可 以 做 Western Blotting 外, 还 可 以 用 于 核 酸 结 合 研 究 还 有 一 种 离 子 交 换 型 膜 是 羧 甲 基 (CM) 修 饰 的 纤 维 素 膜, 它 可 以 结 合 蛋 白 和 多 肽 分 子, 以 及 其 他 的 一 些 带 正 电 荷 的 样 品, 最 适 结 合 ph 范 围 在 4-7 结 合 的 多 肽 分 子 可 以 从 CM 膜 上 洗 脱 下 来, 用 于 氨 基 酸 系 列 分 析 或 微 测 序 5. Marker 的 相 关 疑 问

16 MM. 我 用 的 是 可 视 marker(bio_rad), 但 是 电 泳 总 跑 不 全 8 条 带, 请 问 什 么 原 因? 怎 样 改 善? 胶 用 过 8%,10%,12%, 都 是 这 样 marker 是 新 买 的 解 答 : 一 般 来 说, 是 小 分 子 量 Marker 跑 走 了, 增 加 胶 浓 度 或 减 少 电 泳 时 间 试 试 看 当 然 梯 度 胶 也 是 不 错 的 选 择 NN. 用 的 是 Roche molecular Biochemicals 公 司 的 由 100kd,75kd,45kd, 30kd,20kd,10kd 组 成 的 marker 开 始 做 Western Blot 时 还 能 够 看 到 marker, 当 然 也 仅 能 看 见 其 中 最 多 三 条 带 用 80V 进 行 SDS-PAGE 电 泳, 用 恒 压 10V45min 转 印 的 前 几 次 做 Western Blot 时 没 有 进 行 丽 春 红 染 色, 但 尽 管 用 了 此 方 法 也 仅 能 看 到 marker 有 一 条 大 约 是 30KD 的 条 带 出 现 再 就 是 把 70KD 和 130KD 两 个 目 的 蛋 白 同 时 在 一 块 胶 上 进 行 分 析, 用 培 养 基 样 品 进 行 分 析, 没 有 用 间 接 法, 而 是 直 接 用 融 合 蛋 白 C 端 的 V5 表 位 的 酶 联 抗 体 (Anti-V5-HRP) 但 就 是 出 不 来 结 果, 我 很 茫 然 谢 谢 您 过 给 予 指 点! 解 答 :1 我 用 的 是 Roche molecular Biochemicals 公 司 的 由 100kd,75kd, 45kd,30kd,20kd,10kd 组 成 的 marker 开 始 做 Western Blot 时 还 能 够 看 到 marker, 当 然 也 仅 能 看 见 其 中 最 多 三 条 带 有 的 时 候,Prestained Marker 放 久 了 效 果 就 会 变 差, 电 泳 是 条 带 不 清 晰, 扩 散 但 是 你 的 问 题 可 能 还 有 其 他 的 方 面 的 问 题, 可 能 是 蛋 白 跟 膜 结 合 的 不 紧 密 转 移 是 多 加 点 甲 醇 2 前 几 次 做 Western Blot 时 没 有 进 行 丽 春 红 染 色, 但 尽 管 用 了 此 方 法 也 仅 能 看 到 marker 有 一 条 大 约 是 30KD 的 条 带 出 现 转 移 时 半 干 法 建 议 用 恒 流, 你 这 样 的 也 就 30kd-50kd 的 转 移 地 比 较 好 3 再 就 是 把 70KD 和 130KD 两 个 目 的 蛋 白 同 时 在 一 块 胶 上 进 行 分 析, 用 培

17 养 基 样 品 进 行 分 析, 没 有 用 间 接 法, 而 是 直 接 用 融 合 蛋 白 C 端 的 V5 表 位 的 酶 联 抗 体 (Anti-V5-HRP) 是 否 检 测 了 表 达 量, 二 抗 是 否 是 好 的, 你 做 了 阳 性 对 照? 你 要 做 这 么 大 的 蛋 白 最 好 转 移 时 间 延 长 到 1.5hrs 6. 染 色 的 选 择 OO. Western Blot 哪 种 染 色 好? 解 答 :(1) 阴 离 子 染 料 是 最 常 用 的, 特 别 是 氨 基 黑, 脱 色 快, 背 景 低 检 测 极 限 可 达 到 1.5μg, 考 马 虽 然 与 氨 基 黑 有 相 同 的 灵 敏 度, 但 脱 色 慢, 背 景 高 丽 春 红 S 和 快 绿 在 检 测 后 容 易 从 蛋 白 质 中 除 去, 以 便 进 行 随 后 的 氨 基 酸 分 析 缺 点 是 : 溶 剂 系 统 的 甲 醇 会 引 起 硝 化 纤 维 素 膜 的 皱 缩 或 破 坏 不 能 用 语 正 电 贺 的 膜 灵 敏 度 低 (2) 胶 体 金, 灵 敏 度 高, 检 测 范 围 可 到 pg 级, 但 染 色 比 稳 定 (3) 生 物 素 化 灵 敏 度 位 于 1 2 之 间, 可 用 于 任 何 一 种 膜 7. 参 照 的 疑 问 PP. 是 否 Western Blot 实 验 半 定 量 一 定 要 加 ACTIN 内 参? 解 答 : 对 于 发 表 文 章 的 实 验 最 好 加 内 参, 实 验 严 谨 QQ. 用 BANDSCAN 分 析 结 果 行 吗? 解 答 : 分 析 一 般 的 结 果 没 问 题

18 RR. 核 内 抗 原 Western Blot 内 参 选 择 什 么 合 适? 解 答 : 可 以 选 用 组 蛋 白, 组 蛋 白 在 细 胞 核 中 的 表 达 是 很 稳 定 的, 有 很 多 都 可 以 当 成 内 参, 在 网 上 查 查 就 可 以 选 出 你 要 的 内 参 SS. 转 膜 时 采 用 电 流 是 否 比 电 压 准 确, 是 否 根 据 0.8mA/cm2, 一 般 1 小 时 左 右? 解 答 : 不 是 的, 半 干 法 推 荐 用 恒 流, 一 般 根 据 目 的 蛋 白 的 大 小 来 确 定 电 流 和 时 间 TT. 做 半 定 量 人 卵 巢 癌 细 胞 系 的 Western Blot, 内 参 B-actin,GAPDH, 那 个 好? 解 答 : 选 用 beta-actin 就 可 以 8. 缓 冲 液 配 方 的 常 见 问 题 UU. 转 膜 后 的 脱 脂 奶 粉 封 闭 时, 所 用 的 防 沫 剂 A 是 什 么? 还 有 Tris-HCl 是 不 是 就 是 用 Tris 和 盐 酸 配 出 来 的 呢? 解 答 : 转 膜 后 的 脱 脂 奶 粉 封 闭 液 是 5% 的 TBST 脱 脂 奶 粉 Tris-HCl 就 是 Tris 盐 用 HCl 调 ph 值, 配 置 而 成 VV. 准 备 做 大 鼠 脑 子 的 Western Blot, 蛋 白 质 位 于 细 胞 核 中, 请 问 此 蛋 白 质 的 提 取 液 及 操 作 方 法 是? 每 一 步 都 必 须 要 低 温 吗? 这 种 蛋 白 质 是 磷 酸 化 的 蛋 白 质, 操 作 时 如 何 防 止 去 磷 酸 化 的 发 生? 解 答 : 可 以 用 提 取 总 蛋 白 的 buffer 提 核 蛋 白, 可 以 加 NaF 防 止 去 磷 酸 化

19 WW. 想 问 一 下 细 胞 裂 解 液 选 择 蛋 白 酶 抑 制 剂 时 有 什 么 原 则 吗? 受 不 受 组 织 来 源 的 影 响? 胞 膜 和 胞 浆 有 区 别 吗? 解 答 : 一 般 来 说 提 取 时 加 入 光 谱 的 蛋 白 酶 抑 制 剂 就 可 以 了, 操 作 时 保 持 低 温 除 非 有 文 献 特 别 指 明 用 特 殊 的 方 法, 一 般 来 说 都 没 有 区 别 XX. 最 近 作 了 两 次 Western Blot, 不 但 没 阳 性 结 果, 显 色 背 景 都 没 有, 电 泳 和 转 膜 都 染 过, 有 条 带 底 片 和 显 色 液 及 DAB 显 色 液 均 试 过, 没 问 题 1 检 测 GAD-- 分 子 量 67kd, 提 取 液 有 蔗 糖, 其 余 同 三 去 污 裂 解 液 蔗 糖 不 会 有 影 响 把? 样 本 --20 度 放 置 一 周 内 测 2 一 抗 放 置 2 年, 可 能 效 价 不 高! 用 的 是 1:100 如 果 是 一 抗 的 原 因, 不 会 背 景 都 没 有 把?3 第 一 次 有 不 均 匀 背 景, 因 为 一 抗 过 夜 时 密 封 袋 不 均 匀 后 两 次 无 背 景 显 色 4 封 闭 液 用 的 是 含 15% 脱 脂 奶 粉 TBST, 漂 洗 液 用 的 是 含 1%BSA 的 TBST 液,TWEEN-20 为 0.1%, 不 会 是 封 闭 液 的 问 题 吧? 解 答 : 可 以 在 下 面 几 个 问 题 上 找 找 原 因 1. 封 闭 液 用 5%Milk, 漂 洗 液 ( washing buffer 用 TBST)2. 看 看 一 抗 是 否 能 work, 降 到 1:20 3. 看 看 二 抗 是 否 有 问 题 YY. 加 甲 醇 的 目 的 是 什 么? 解 答 : 加 甲 醇 起 着 一 定 的 固 定 作 用, 因 为 小 分 子 蛋 白 质 容 易 转 出 去.( 特 别 是 在 硝 酸 纤 维 素 膜 上, 因 为 NC 膜 结 合 蛋 白 质 的 能 力 较 弱 ) ZZ. 转 膜 后 的 脱 脂 奶 粉 封 闭 液 是 5% 的 TBST 脱 脂 奶 粉, 其 中 TBST 最 后 那 个 T 是 Tween 吗, 浓 度 多 大? 解 答 : 是 Tween, 配 方 如 下 :Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve

20 8.8g of NaCl, 0.2g of KCl, and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the ph to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving. AAA. 封 闭, 一 抗, 二 抗 时 的 温 度 有 没 有 什 么 规 定 呢, 比 如 现 在 我 就 在 室 温 里 做, 或 者 要 在 4 度 下? 解 答 : 均 可 在 室 温 进 行, 如 果 时 间 不 够, 一 抗 孵 育 可 以 先 在 室 温 进 行 一 个 小 时, 然 后 4 度 过 夜 BBB. 实 验 室 暂 无 NP40 我 用 sds 可 以 吗? 另 外 有 过 用 尿 素 和 硫 脲 提 取 膜 蛋 白 吗? 配 方 如 下 :7M 尿 素,2M 硫 脲,Triton-x ml, 新 鲜 加 入 :65mM DTT 蛋 白 酶 抑 制 剂 : 试 剂 盒 HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v) 是 用 于 抽 提 双 向 电 泳 用 蛋 白 的 配 方 不 止 用 于 抽 提 细 胞 全 蛋 白 ( 主 要 是 想 得 到 其 中 的 膜 蛋 白 ) 是 否 可 行? 改 良 的 RIPA 裂 解 缓 冲 液 (Tris.HCl, 50 mmol/l, ph 7.5; NaCl, 150 mmol/l; NP-40,1%; 脱 氧 胆 酸 钠,0.5%; SDS,0.1%; EDTA,1 mmol/l; PMSF, 1 mmol/l; Leupeptin, 2 μg/ml) 不 知 对 于 膜 蛋 白 效 果 如 何? 此 外 该 方 中 的 EDTA, 是 否 用 做 蛋 白 酶 抑 制 剂? 解 答 : 做 2-D 绝 对 不 推 荐 使 用 NP-40( 因 为 即 使 进 口 的 NP-40 也 不 纯,, 其 中 的 杂 质 会 影 响 质 谱 结 果 ) 对 于 动 物 细 胞, 其 蛋 白 酶 活 性 较 弱 ( 相 对 于 组 织 和 大 肠 杆 菌 等 ), 可 以 不 使 用 cocktail, 因 为 7M 尿 素 +2M 硫 脲 +4%CHA PS 构 成 的 变 性 环 境 已 经 足 以 抑 制 大 部 分 蛋 白 酶 的 活 性,2M 硫 脲 +4%CHA PS 对 于 抽 提 膜 蛋 白 有 很 大 的 帮 助, 不 过 如 果 您 专 职 做 膜 蛋 白 建 议 采 用 分 级 抽 提

21 法 此 外 还 可 以 采 用 梯 度 离 心 法 和 一 些 基 于 去 垢 剂 的 方 法 EDTA 用 于 灭 活 金 属 蛋 白 酶 ( 主 要 是 其 鏊 合 作 用 ) 加 过 多 的 蛋 白 酶 抑 制 剂 可 以 导 致 蛋 白 质 的 修 饰, 做 WB 无 所 谓, 做 MAILDI 时 会 给 正 确 鉴 定 带 来 麻 烦 裂 解 缓 冲 液 中 少 了 两 性 电 解 质 ( 在 2-D 裂 解 缓 冲 液 中, 两 性 电 解 质 起 的 作 用 : 提 供 连 续 的 PH 梯 度, 从 很 大 程 度 上 增 加 蛋 白 质 的 溶 解 性 ; 还 可 以 去 除 一 部 分 核 酸 ); 也 不 推 荐 采 用 SDS, 因 SDS 会 与 蛋 白 质 结 合 导 致 其 等 电 点 发 生 改 变, 如 果 您 实 在 要 用, 终 浓 度 降 到 0.1% 以 下 METHOD2 (50ml 总 量 ):?-mercaptoethanol 342 μl;20% SDS 5 ml;tris-cl ph ml; 加 ddh2o 至 50 ml 方 法 : 将 用 过 的 膜 浸 入 stripping buffer 中, 置 50 水 浴 箱 中 30min, 间 断 振 摇 之 后 用 TTBS 洗 3*5min 就 好 此 时 你 已 经 可 以 按 新 的 转 移 好 的 膜 来 再 次 使 用 了 该 方 法 的 优 点 : 省 事, 省 力, 省 钱, 符 合 国 际 惯 例 METHOD3 1 beta-metaptoethanol 35ul 2 10%SDS 1ml 3 tris (0.5M,pH6.7) 625ul 4 dh2o 3.34ml 50-55,30min METHOD4

22 stripping buffer 应 该 是 可 以 放 置 很 久 的 不 过 我 习 惯 于 现 配 毕 竟, 加 了 β-mercaptoethanol 以 后 太 难 闻 了, 配 了 就 用 ; 而 且, 有 了 现 成 的 Tris-HCl 缓 冲 液 和 SDS 的 母 液, 现 配 还 是 很 方 便 的 每 次 用 量 5ml 少 了 点, 我 每 次 用 50ml METHOD5 0.5M NaCl,0.5M HAc; 室 温 摇 床 15min METHOD6 将 用 过 的 膜 泡 在 1*TBS 中 室 温 振 摇 过 夜, 中 间 可 以 换 液 2-3 次, 然 后 封 闭, 加 一 抗, 二 抗 ( 同 第 一 次 发 光 ), 实 践 证 明 方 法 完 全 可 行 不 管 用 那 种 方 法, 洗 脱 后 都 要 用 PBS 或 TBS 再 洗 几 次 9. 条 件 的 摸 索 DDD. 用 的 是 Santa Cruz 的 抗 体, 也 实 验 过 一 抗 和 二 抗 肯 定 能 结 合, 二 抗 加 DAB 肯 定 能 显 色 电 泳 的 胶 用 考 马 斯 亮 蓝 染 色 没 问 题, 但 是 不 知 道 与 Marker 对 应 的 条 带 是 否 是 我 要 的 ( 我 目 的 蛋 白 的 分 子 量 分 别 是 55KD 29KD) 半 干 法 2 小 时 转 膜 后, 丽 春 红 染 色 发 现 大 分 子 量 蛋 白 转 过 去 的 较 少 难 道 是 裂 解 液 出 了 问 题? 我 用 的 是 三 去 污 剂, 但 没 加 叠 氮 钠 和 大 概 叫 Apoptin 的 那 种 蛋 白 酶 抑 制 剂 冰 上 裂 解 -80 度 冻 存 的 细 胞,4 度 12000g 离 心 5 分 钟, 取 上 清, 与 分 子 克 隆 ( 第 二 版 ) 上 的 加 样 buffer 混 合, 沸 水 变 性 5 分 钟, 上 样 不 知 道 是 哪 里 出 了 问 题? 解 答 : 建 议 :1 首 先 确 定 您 提 的 蛋 白 质 量 如 何? 可 用 PIERCE 公 司 的 BCA 试 剂 盒 测 蛋 白 的 浓 度, 一 般 来 讲, 其 浓 度 应 该 在 几 -20 微 克 / 微 升

23 2 若 是 蛋 白 没 问 题, 哪 就 看 是 不 是 电 泳 的 问 题, 首 先 要 看 胶 的 浓 度, 您 目 的 蛋 白 的 分 子 量 分 别 是 55KD 29KD, 建 议 分 别 用 10% 和 12% 的 胶 60-80V,1 小 时 左 右 跑 过 积 层 胶 与 分 离 胶 的 线 时, 换 用 100V,3-4 小 时 3 转 膜, 建 议 恒 压,15V, 不 用 转 2 小 时,45 分 钟 足 以 您 所 说 的 大 蛋 白 转 过 去 的, 并 不 是 真 正 的 少, 而 是 因 为 在 提 的 蛋 白 中 大 蛋 白 本 身 就 很 少 我 曾 经 也 转 过 2 小 时, 但 和 45 分 钟 的 区 别 并 不 大 4 根 据 MARKER 的 条 带 ( 我 的 是 7 条 带 : KD), 您 根 据 MARKER 的 条 带 剪 下 25 与 35 之 间 ( 29KD) 的 条 带,45-66 之 间 ( 50KD) 的 条 带 这 样 第 一, 可 以 节 省 抗 体, 第 二, 您 要 的 目 的 条 带 肯 定 在 上 面 5 延 长 1 抗 2 抗 孵 育 时 间 ( 我 曾 室 温 1 小 时,4 度 过 夜 ), 适 当 加 大 1 抗 浓 度 6 我 买 的 也 是 Santa Cruz 的 抗 体, 我 觉 得 质 量 还 可 以, 我 想 您 应 该 先 找 其 他 方 面 的 原 因 EEE. 电 泳 用 的 是 恒 流, 一 块 胶,20mA,100 分 钟 左 右 转 膜 也 是 恒 流,38mA, 100 分 钟 而 且 我 用 别 人 的 细 胞 和 一 抗 在 我 的 整 个 反 应 体 系 下 做 出 来 了, 当 然 彼 此 的 目 的 蛋 白 不 同 所 以, 我 想 问 题 应 该 出 在 抗 原 和 一 抗 上, 不 知 对 不 对 解 答 : 电 泳 的 条 件 : 样 品 的 分 子 量 决 定 了 胶 的 浓 度, 一 般 使 样 品 跑 至 胶 的 中 部 即 可 正 常 条 件 下, 电 泳 时 溴 酚 蓝 和 10kd 左 右 蛋 白 跑 在 一 起 由 此 可 以 决 定 电 泳 的 电 压 和 时 间 建 议 你 用 恒 压 伏 FFF. BIO-RAD 的 半 干 转 运 系 统 有 一 个 很 致 命 的 弱 点 就 是 无 法 控 温 ( 我 用 的 就 是 这 种 ), 当 电 流 过 高, 而 系 统 的 散 热 又 比 较 差, 滤 纸 的 吸 水 性 比 较 差 的 情 况 下,

24 就 很 容 易 烧 胶 就 转 膜 时, 是 采 取 恒 压 还 是 恒 流 的 问 题, 我 想 和 大 家 探 讨 一 下, 我 感 觉 我 这 个 系 统 用 恒 流 很 容 易 烧 胶, 我 的 胶 有 68cm2, 用 50mA 恒 流 来 转 膜, 刚 开 始 电 压 就 很 高, 有 20 v 左 右, 而 用 恒 压, 开 始 电 流 有 110mA, 但 15min 后, 电 流 就 降 到 8OmA,30min 后 就 稳 定 在 40mA, 不 就 相 当 于 恒 流 吗? 解 答 : 恒 流 时 电 压 逐 渐 升 高 的 原 因 是 湿 滤 纸 逐 渐 变 干 因 而 电 阻 逐 渐 增 大 的 缘 故, 如 果 电 压 升 得 太 快, 可 以 使 滤 纸 更 湿 一 些 以 克 服 就 我 的 感 觉,20V 的 电 流 30min 以 后 20Kd 以 下 的 分 子 丢 失 很 多, 不 过 我 用 的 是 小 胶 40cm2, 不 知 有 无 不 同 GGG. 我 想 尽 量 提 高 转 膜 的 效 率 ( 我 的 实 验 要 求 转 到 膜 上 的 蛋 白 越 多 越 好, 不 管 是 什 么 大 小 蛋 白 ) 不 知 道 有 那 些 办 法? 解 答 : 不 管 怎 么 转 都 会 存 在 蛋 白 转 移 不 完 全 ( 电 压 过 小 时 间 过 短 ) 或 过 度 转 移 ( 电 压 过 大 时 间 过 长 ) 的 问 题, 鱼 ( 小 分 子 量 蛋 白 ) 和 熊 掌 ( 大 分 子 量 蛋 白 ) 不 可 得 兼 呵 呵 建 议 把 胶 切 成 两 半, 比 如 以 35KD 为 界, 分 别 进 行 转 膜, 下 半 时 间 短, 上 半 时 间 长 一 点, 应 该 会 好 一 些 HHH. 请 问 一 下 PVDF 膜 和 硝 酸 膜 结 合 蛋 白 的 原 理 是 什 么? 解 答 : 一 般 而 言, 硝 酸 纤 维 素 膜 是 通 过 疏 水 作 用 来 和 蛋 白 质 相 联, 这 样 的 话, 反 复 洗 几 次 后, 蛋 白 容 易 掉 下 来, 结 果 较 差 尼 龙 膜 主 要 通 过 它 膜 上 的 正 电 荷 和 蛋 白 接 合 ( 注 : 常 用 的 PVDF 即 带 正 电 荷 的 尼 龙 膜 ), 同 时 也 有 疏 水 作 用, 但 相 对 较 弱 这 样 的 话,PVDF 膜 和 蛋 白 接 合 较 牢, 不 易 脱 落, 结 果 较 好 III. 1 煮 好 后 的 样 品, 若 没 有 及 时 上 样 分 离, 应 如 何 保 存, 可 以 保 存 多 久?2 有 没 有 人 在 用 bio-rad 的 小 型 垂 直 电 泳 槽, 有 没 有 操 作 手 册?3 湿 式 转 移 时 是

25 否 必 须 要 用 bio-rad 的 专 用 滤 纸?4 恒 压 转 移 的 条 件 如 何 确 定, 因 为 我 要 分 离 小 至 21KD, 中 至 66KD, 大 致 170KD 的 蛋 白 质, 转 移 条 件 能 够 相 同 吗?5 凝 胶 的 浓 度 是 不 是 可 以 用 一 个 浓 度? 书 上 写 不 同 的 凝 胶 浓 度 分 离 的 分 子 量 范 围 不 同, 还 给 出 了 一 个 线 形 范 围, 是 不 是 不 在 这 个 范 围 内 也 能 分 离, 只 是 就 不 是 线 性 范 围 了? 解 答 :1 煮 好 后 的 样 品, 放 到 -20, 我 们 在 一 个 月 后 此 样 品, 效 果 一 样 2 bio-rad 的 小 型 垂 直 电 泳 槽 的 操 作 手 册 在 他 们 的 主 页 Bio-Rad USA 上 有 3 转 移 时 一 般 的 WATERMEN 滤 纸 就 可 以 4 转 移 条 件 是 和 蛋 白 质 大 小 有 关 的 : 以 次 确 定 电 压 和 时 间 具 体 可 让 ptglab 帮 你 定 夺 5 凝 胶 的 浓 度 也 是 和 分 离 蛋 白 质 大 小 有 关 不 是 随 心 所 欲 选 的, 否 则 分 离 效 果 可 能 不 是 你 所 期 望 的 JJJ. 怎 样 设 计 实 验 来 确 定 最 佳 的 条 件? 解 答 : 随 便 说 一 点, 具 体 的 还 是 需 要 自 己 想 : 1 在 每 个 上 样 孔 里 上 同 样 的 蛋 白 样 品, 量 也 一 样, 最 好 是 组 织 样,( 也 可 以 跑 1 个 大 well, 不 插 梳 子, 多 上 样,)SDS-page; 2 转 移, 设 定 电 流 或 电 压 ; 3 每 隔 1(or n) 小 时, 取 一 点 膜 染 色, 看 转 移 效 果 KKK. 我 要 测 两 种 抗 体, 一 种 为 磷 酸 化 的 目 的 蛋 白, 一 种 为 总 的 目 的 蛋 白, 不 知 道 用 什 么 方 法 strip 最 好, 我 用 甘 氨 酸 (PH2.9) 漂 洗 15 分 钟, 似 乎 没 什 么 效 果?

26 解 答 : 你 可 以 加 巯 基 乙 醇 (loading buffer 一 样 的 浓 度 ),56 度, 30mins, 看 看 LLL. 1 在 用 PBS 洗 涤 抗 原 - 抗 体 -ProteinA-Agarose 复 合 物 时, 每 次 要 重 悬 多 长 时 间 合 适?2 最 后 用 2xSDS 重 悬 抗 原 - 抗 体 复 合 物 离 心 后, 由 于 2XSDS 中 已 经 加 入 了 溴 芬 兰, 因 此 下 面 的 Agarose 珠 子 几 乎 看 不 到, 所 以 吸 取 上 清 加 样 时 也 不 知 道 里 面 是 否 吸 进 了 Agarose 不 知 有 什 么 方 法 可 以 解 决 这 个 问 题, 或 者 即 使 吸 进 了 一 些 Agarose 也 不 要 紧 呢? 解 答 :1 不 用 重 悬 多 久, 重 悬 起 来 了 就 可 以 离 心 了 2 加 2X BUFFER 前 大 体 上 已 经 知 道 有 多 少 胶 粒 了, 吸 到 那 个 位 置 时 小 心 点 就 是 了 我 也 试 过 一 些 次, 首 先 离 心 稍 微 长 一 点, 长 20 秒 吧, 希 望 胶 粒 能 沉 得 结 实 点 ( 我 想 象 的 ), 再 吸 取 如 果 感 觉 枪 头 不 是 很 顺 畅 的 时 候 可 能 就 是 碰 到 胶 粒 了 很 难 一 点 胶 粒 也 吸 取 不 上 来 的, 尽 力 做 好 就 是 了 MMM. 磷 酸 化 抗 体 的 检 测 样 本 制 备 时 是 否 一 定 要 加 NaF 等? 解 答 :NaF 是 一 种 广 谱 磷 酸 化 酶 的 抑 制 剂, 一 般 最 好 加 但 是 不 加 也 可 以, 大 部 分 时 候 是 不 用 加 的 我 做 的 时 候 从 未 加 过, 都 做 出 来 了 NNN. Western Blot 中 block 的 最 短 时 间? 解 答 : 每 一 步 1 小 时 足 够 了, 中 间 换 抗 体 要 洗 的 话 多 换 液 几 次, 每 次 时 间 10 分 钟 就 够, 洗 3 次 只 要 半 小 时 跑 胶 1 小 时, 转 移 1 小 时,block 半 小 时 就 行, 1 抗 1 小 时, 洗 半 小 时,2 抗 1 小 时, 洗 半 小 时, 显 色 10 分 钟 一 般 跑 两 块 胶, 一 块 染 色, 一 块 western 一 天 肯 定 完 事, 一 般 不 用 等 到 第 二 天

27 OOO. 想 用 Western 检 测 基 因 转 染 后 细 胞 培 养 上 清 中 表 达 的 目 的 蛋 白 ( 定 性 ), 分 子 量 为 20KD, 浓 度 约 为 几 百 ng/ml 蛋 白 样 品 需 浓 缩 纯 化 吗? 如 何 浓 缩 纯 化 上 清 液 中 的 目 的 蛋 白? 对 小 分 子 蛋 白 Western blot 时 需 特 别 注 意 哪 些 条 件? 解 答 : 按 照 你 提 供 的 浓 度, 如 果 做 Western Blot, 是 不 用 浓 缩 样 品 的. 对 于 20kd 的 小 分 子 的 蛋 白,Western Blot 中 要 注 意 的 是 : 1 转 移 时 的 时 间, 2 转 移 时 的 电 流 或 电 压. 3 transfer buffer 中 加 20% 的 甲 醇. 4 可 以 用 13-15% 的 分 离 胶. PPP. 蛋 白 分 子 量 大 小 分 别 为 21kd 28kd, 用 的 是 湿 转, 请 问 多 大 电 流, 多 长 时 间 比 较 合 适? 解 答 : 分 子 量 比 较 小, 最 好 是 用 干 转, 湿 转 效 率 太 高, 易 转 过 了 干 转 的 话, 用 2.5 A/cm2, 30min 就 应 该 够 了 湿 转, 按 照 bio-rad 的 说 明, 用 100mA, 也 得 要 半 个 多 小 时 吧 QQQ. 需 要 测 同 一 种 蛋 白 质 的 总 量 与 磷 酸 化 的 量, 但 相 互 间 干 扰 太 大, 怎 么 办? 解 答 : 将 膜 放 入 stripping buffer(sds 2%,Tris Cl (PH=6.7) 62.5mM,beta- 巯 基 乙 醇 100mM) 中,50 孵 育 30 分 钟,TTBS 西 三 次, 再 重 新 加 入 一 抗, 进 行 另 一 种 抗 原 的 检 测 RRR. 做 Western Blot 实 验 时, 发 现 转 膜 时 的 电 流 总 是 偏 小, 转 膜 的 效 率 也 偏 低. 100V 恒 压 转 膜 时 的 电 流 只 有 190mA 左 右, 而 以 前 都 有 250mA 体 系 和

28 条 件 都 和 以 前 一 样, 只 是 环 境 温 度 比 以 前 低 了 很 多 解 答 : 有 可 能 重 复 使 用 了 转 移 缓 冲 液, 随 着 离 子 的 逐 渐 减 少, 电 阻 越 来 越 大, 当 然 恒 压 时 电 流 越 来 越 小 了 建 议 更 换 转 移 缓 冲 液 反 复 使 用 不 要 超 过 三 次 环 境 温 度 低 是 有 利 于 转 移 的 SSS. 我 电 泳 用 的 是 恒 流, 一 块 胶,20mA,100 分 钟 左 右 转 膜 也 是 恒 流,38mA, 100 分 钟 而 且 我 用 别 人 的 细 胞 和 一 抗 在 我 的 整 个 反 应 体 系 下 做 出 来 了, 当 然 彼 此 的 目 的 蛋 白 不 同 所 以, 我 想 问 题 应 该 出 在 抗 原 和 一 抗 上, 不 知 对 不 对 一 抗 我 买 的 是 单 抗, 推 荐 的 稀 释 度 是 1:100 1:1000 我 用 的 是 1:100 难 道 非 要 用 多 抗 吗? 按 道 理 单 抗 也 应 该 出 条 带 呀! 细 胞 用 三 去 污 剂 裂 解 的, 没 有 做 定 量, 加 巯 基 乙 醇 变 性 后, 每 孔 上 样 20 微 升 提 出 的 蛋 白 我 保 存 在 4 度 了, 这 样 行 吗? 解 答 :1 建 议 您 用 恒 压 进 行 电 泳, 先 用 70V, 等 跑 过 积 层 胶 与 分 离 胶 的 界 限 时, 换 用 V, 再 跑 3 小 时 左 右 2 转 膜 可 用 恒 流, 但 要 根 据 你 的 膜 的 面 积 及 所 要 检 测 的 蛋 白 的 分 子 量 的 大 小 来 确 定 电 流 的 大 小, 一 般 来 讲, mA/CM2, 分 子 量 大 的 蛋 白 就 用 的 电 流 大 些, 譬 如, 你 膜 的 面 积 是 30CM2, 蛋 白 的 分 子 量 是 80KD, 那 么 你 就 可 以 以 2.0mA/CM2 的 条 件 进 行, 你 就 可 以 60mA 的 电 流 进 行 3 我 觉 得 你 的 抗 体 应 该 没 问 题 4 你 提 出 的 蛋 白 怎 么 保 存 在 4 度 呢? 我 们 实 验 事 都 是 保 存 在 -20 度 的, 提 出 蛋 白 分 装 保 存 在 -20 度 TTT. 目 的 蛋 白 是 一 种 6KD 的 分 泌 性 蛋 白,RT-PCR 就 显 示 细 胞 中 mrna 表 达 不 高, 估 计 将 培 养 上 清 冻 干 浓 缩 后 采 用 Western Blot 还 可 能 检 测 不 出, 但 如 果 用 western, 是 否 一 定 要 用 0.2μm 的 膜? 用 Tris-tricine SDS-PAGE 电 泳, 电 泳 时 分 别 管 制 三 层 凝 胶, 分 离 胶 用 40%T 丙 稀 酰 胺 (2.6%C) 浓 度 为 16.5%,

29 另 外 两 层 都 用 30% 丙 稀 酰 胺, 中 间 一 层 浓 度 为 10%, 积 层 胶 浓 度 为 4%, 凝 胶 厚 度 1mm, 转 膜 的 条 件 试 过 30V70 分 钟, 膜 上 可 见 到 小 分 子 蛋 白 marker 的 条 带, 似 乎 见 到 目 的 条 带, 上 样 量 为 60μg 细 胞 胞 浆 总 蛋 白, 转 膜 的 条 件 怎 么 样 合 适? 解 答 : 一 定 要 用 0.2μm 的 膜, 并 且 转 移 的 条 件 要 摸 索 一 下, 小 分 子 的 Western 不 好 做, 要 根 据 你 的 实 验 器 材 来 定, 一 般 你 要 是 有 prestained marker 就 可 以 参 照 一 下, 如 果 相 应 的 分 子 量 大 小 的 marker 转 移 的 好 就 可 以 了 UUU. 怎 样 才 能 把 胶 跑 的 非 常 漂 亮, 泳 道 和 band 都 能 很 直, 是 不 是 上 样 的 量 很 重 要, 罐 胶 有 什 么 技 巧 吗? 想 跑 漂 亮, 是 不 是 应 该 先 小 电 压, 再 高 电 压, 总 体 上 电 压 小 些 会 跑 的 好 些? 还 有 前 面 有 人 说 电 泳 液 平 玻 璃 板 会 使 电 泳 条 带 漂 亮 些? 解 答 : 影 响 跑 胶 跑 的 质 量, 有 以 下 几 个 因 素 :1 电 压, 小 的 电 压 会 使 胶 的 分 子 筛 效 应 得 到 充 分 发 挥 电 压 越 小, 条 带 越 漂 亮, 浓 缩 胶 80v, 分 离 胶 100v 就 能 跑 得 很 好 2 胶 的 均 匀 度, 胶 越 均 匀, 条 带 越 窄, 分 离 越 均 匀 倒 胶 之 前, 一 定 要 充 分 混 匀, 玻 璃 板 一 定 要 干 净, 双 蒸 水 隔 离 时, 一 定 要 比 较 轻 地 加 上 去, 避 免 稀 释 上 层 的 分 离 胶, 使 胶 不 均 匀 VVV. 为 什 么 提 高 大 分 子 量 蛋 白 的 转 移 的 时 候, 小 分 子 量 蛋 白 会 丢 失 一 些 哪? 什 么 原 因? 解 答 : 小 分 子 的 蛋 白 在 转 移 过 程 中, 会 透 过 膜 去, 所 以 大 分 子 的 上 去 以 后, 有 一 部 分 小 分 子 的 就 透 过 去 了 WWW. 上 次 转 染 了 1.6*106 细 胞, 收 集, 收 集 到 了 400 微 升 体 积, 加 6*loading buffer, 95 度 煮 5 分 钟,-20 度, 交 替 3 次, 离 心, 上 样,7% 分 离 胶, 先

30 80v 跑 进 分 离 胶, 在 100v 电 泳 至 溴 酚 兰 出 胶,biorad 半 干 转 PDVF 膜,15v 转 30 分 钟, 预 染 marker 全 部 进 膜, 转 移 后 的 胶 考 马 斯 亮 兰 染, 可 见 残 留 的 蛋 白 带, 大 分 子 量 多 些.blot 时, 封 闭 用 5% 奶 粉 TTBS 1 小 时, 抗 体 稀 释 液 TTBS, 一 抗 (1:10, 单 抗 上 清,2000 年 制 备 )1 小 时, 二 抗 (1:2000)1 小 时, 均 在 室 温. 结 果,50kd 的 小 分 子 显 色,160kd 大 分 子 未 显 色 原 因 分 析 及 准 备 改 进 : 转 染 大 容 量 的 质 粒 ( 融 合 蛋 白 的 质 粒 ) 的 效 率 会 相 对 较 低, 大 分 子 量 表 达 也 会 相 对 较 低, 加 上 大 分 子 量 蛋 白 的 转 移 不 完 全, 可 能 是 我 没 有 拿 到 大 分 子 量 条 带 结 果 的 原 因 另 外 背 景 稍 微 有 一 些 脏 ( 背 景 整 体 均 匀 一 致 ), 估 计 是 二 抗 的 浓 度 高 了 些, 准 备 降 至 1:5000, 另 外 抗 体 稀 释 液 准 备 改 用 5% 奶 粉 TTBS, 封 闭 改 为 室 温 2 小 时 这 个 过 程 有 没 有 问 题? 解 答 : 首 先 分 析 你 的 整 个 实 验 步 骤 我 发 现 了 两 个 比 较 大 的 毛 病 : 1 一 抗 用 TBST 稀 释 按 照 我 的 理 解, 一 抗 最 好 用 5% 的 TBST 脱 脂 牛 奶 稀 释, 和 你 的 封 闭 液 相 一 致, 这 样 可 以 降 低 背 景 2 biorad 半 干 转 PDVF 膜,15v 转 30 分 钟, 你 是 这 么 做 的 吗? 因 为 我 大 部 分 时 间 是 做 的 恒 流 转 移, 用 的 是 0.1mA/ 膜,100kd--200kd 转 2 小 时 到 最 后 电 压 会 升 到 20v 左 右 你 用 恒 压 法, 我 不 是 很 肯 定 你 转 30 分 钟 能 将 大 分 子 (160kd) 的 抗 原 转 上 去 我 建 议 你 最 好 能 将 时 间 延 长, 如 果 是 恒 流, 可 按 我 的 做 法 ; 如 果 是 恒 压, 可 摸 索 一 下, 适 当 延 长 时 间 有 时 候 你 的 marker 也 有 可 能 欺 骗 你, 因 为 marker 的 量 比 较 大, 是 很 容 易 转 上 去 的, 实 际 上 目 标 蛋 白 的 量 远 远 少 于 marker 量 我 对 你 的 结 果 分 析 如 下 : 1 你 的 结 果 很 好, 估 计 离 目 标 不 远 了, 很 快 就 可 以 成 功

31 2 没 有 160kd 的 带 是 因 为 你 的 转 移 时 间 过 短, 适 当 延 长 转 移 时 间 ( 我 怀 疑 这 是 主 要 的 问 题 ) 3 你 的 一 抗 用 1:10,2 抗 可 以 降 到 1:5000, 背 景 会 低 一 点 10. 方 法 的 介 绍 XXX. 我 想 将 hbx 转 到 hepg2 细 胞 里 通 过 检 测 hbx 蛋 白 的 水 平 来 检 验 转 染 的 效 率 不 知 道 可 不 可 行? 解 答 :Western Blot 检 测 HBX 蛋 白 的 表 达 来 检 测 转 染 效 率 不 是 一 个 好 办 法, 建 议 还 是 : 1 最 好 是 带 有 荧 光 标 签 的 HBX 转 染 来 看 转 染 效 率, 最 可 靠 2 其 次,HBX 和 荧 光 载 体 共 转 染, 相 对 说 明 问 题 3 荧 光 载 体 单 独 转 染, 主 要 是 看 细 胞 好 不 好 转 了 呵 呵 转 染 效 率 高 低 荧 光 显 微 镜 下 一 目 了 然 了 有 的 细 胞 荧 光 强, 有 的 细 胞 荧 光 弱, 有 的 没 有 所 以 HBX 表 达 强 很 可 能 是 少 数 细 胞 荧 光 强 的 结 果, 不 代 表 转 染 效 率 YYY. 半 干 法 转 移 与 胶 的 面 积 和 蛋 白 分 子 两 大 小 好 像 都 有 关 系, 那 么 湿 法 转 移 是 不 是 所 有 的 转 移 条 件 都 一 样 呢? 一 般 的 条 件 是 怎 样 的? 解 答 : 半 干 转 的 电 流 大 小 是 按 照 面 积 来 算 的, 时 间 是 根 据 蛋 白 分 子 大 小 定 的 ; 而 湿 转 的 话 电 流 是 恒 定 的, 时 间 也 是 根 据 分 子 量 而 定 ZZZ. 转 膜 时 何 为 湿 法, 何 为 半 干 法? 解 答 : 半 干 法 和 湿 法 转 移 是 两 种 不 同 的 转 移 装 置 下 的 转 移 系 统, 将 膜, 胶, 滤 纸 整 个 浸 泡 在 buffer 的 Tank 里 转 移 的, 叫 湿 法 ; 用 滤 纸 吸 buffer 来 做 转 移 体 系 的 叫 半 干 法

32 AAAA. 为 什 么 浓 缩 胶 和 分 离 胶 的 电 压 不 一 致? 同 样 的 电 压 可 以 吗? 解 答 : 浓 缩 胶 的 目 的 使 得 loading 的 样 品 能 够 在 同 一 条 水 平 线 上 进 入 分 离 胶, 如 果 电 压 太 大 前 端 的 蛋 白 容 易 在 后 面 的 蛋 白 赶 上 来 前 进 入 分 离 胶 而 在 分 离 是 理 论 上 ( 实 际 上 也 是 ) 小 电 压 长 时 间 分 离 的 效 果 会 更 好, 但 是 在 操 作 过 程 中 没 有 必 要 等 那 么 长 的 时 间, 所 以 就 用 大 电 压 快 点 跑 BBBB. 如 果 目 的 蛋 白 比 较 小,21 和 38kd, 转 膜 时 (Biorad 的 湿 转 仪 ) 时 间 是 否 能 缩 短 些?100 伏 电 压, 甲 醇 的 量 是 否 也 可 以 相 应 增 加? 解 答 : 如 果 是 小 蛋 白 可 以 用 小 电 压 28V-36V,4-6hours,( 4 度 ) 甲 醇 10% -20% 就 可 以 了 DDDD. 显 色 目 的 条 带 又 细 又 浅, 靶 蛋 白 是 27KD 的 bcl-xl 和 67KD 的 c-myc, 应 该 是 高 表 达 每 个 涌 道 上 50-70μg 蛋 白, 开 始 用 半 干 转 移, 后 来 用 湿 转 14v, 16h, 用 PVDF 膜 转 移 胶 转 移 后 染 色 检 测, 发 现 小 分 子 量 的 基 本 转 移 走 了, 可 是 为 什 么 条 带 老 是 不 粗 不 浓 呢? 解 答 : 可 能 跟 你 的 一 抗 有 关 系, 还 有 应 该 高 表 达, 那 实 际 做 的 阳 性 对 照 是 否 是 高 表 达 ; 还 有 跟 抗 原 量 相 关, 你 多 上 点 蛋 白 会 好 的 多 ; 跟 显 色 条 件 相 关 EEEE. 背 景 很 花, 当 然 条 带 也 很 淡, 如 果 我 在 显 影 液 中 多 洗 一 会 儿, 背 景 就 很 深, 以 致 无 法 辨 认, 但 有 时 条 带 又 很 明 显, 背 底 很 淡 解 答 : 这 跟 你 washing 的 时 间 和 强 度 有 关, 很 可 能 你 在 这 方 面 没 有 掌 握 好 显 影 时 间 是 有 范 围 的, 久 了 肯 定 不 行

33 FFFF. 纯 化 过 的 目 的 带 包 括 其 上 下 都 出 现 了 色 带, 而 且 对 照 菌 也 出 现 了 条 带, 会 是 什 么 原 因? 解 答 : 一 抗 有 问 题, 效 价 太 低, 且 未 纯 化 ; 表 达 量 太 低 ; 提 蛋 白 时 可 能 出 了 问 题 GGGG. 做 Western Blot 的 检 测 的 时 候, 用 DAB 显 色 还 能 看 出 条 带, 但 是 换 成 ECL 的 时 候 什 么 样 结 果 都 没 有 我 用 的 NOVA 公 司 的 发 光 底 物, 胶 片 是 普 通 的 X 片, 定 影 液 和 显 影 液 都 是 别 人 留 下 来 的, 不 知 道 是 什 么 原 因? 解 答 : 一 般 的 说,Ecl 比 DAB 更 灵 敏, 但 是 DAB 是 HRP 最 敏 感 的 底 物, 所 以 有 几 种 可 能 : ECL 底 物 失 活 了, 你 可 以 检 测 一 下 ; 敏 感 度 正 好 不 到 ECl 底 物 的 范 围 DAB 能 显 色 可 不 能 催 化 ECL 底 物 ; 显 影 液 没 用 了 HHHH. 怎 样 分 析 结 果, 需 要 什 么 软 件? 解 答 : 如 果 你 做 定 量 或 办 定 量, 至 少 要 用 到 一 个 光 密 度 扫 描 分 析 软 件, 如 果 不 是, 直 接 分 析 就 可 以 了 IIII. 积 层 胶 分 离 胶 一 般 多 少 左 右 合 适? 解 答 : 一 般 电 泳 是 积 层 胶 60-80v, 分 离 胶 100v JJJJ. 采 用 生 物 素 标 记 的 二 抗 -SABC-DAB 检 测 系 统 做 western, 非 特 异 性 的 条 带 和 背 景 高? 总 蛋 白 考 染 的 时 候 发 现 接 近 积 层 胶 的 条 带 比 较 清 楚, 条 带 也 很 窄, 可 是 越 靠 下 面 的 条 带 越 来 越 宽, 有 的 跑 得 都 连 在 一 起 了, 这 是 什 么 原 因, 如 何 解 决?sds-page 的 时 候 恒 压 和 恒 流 哪 个 好? 解 答 : 非 特 异 性 的 条 带 和 背 景 高 : 可 能 性 太 多 了, 一 抗, 二 抗, 封 闭 的 原 因 都 可

34 能 总 蛋 白 考 染 的 时 候 发 现 接 近 积 层 胶 的 条 带 比 较 清 楚, 条 带 也 很 窄, 可 是 越 靠 下 面 的 条 带 越 来 越 宽, 有 的 跑 得 都 连 在 一 起 了, 这 是 什 么 原 因, 如 何 解 决? 正 常 的, 另 外, 是 否 是 你 的 积 层 胶 有 问 题 sds-page 的 时 候, 恒 压 和 恒 流 都 可 以 用 KKKK. 血 清 样 品 进 行 Western Blot 分 析, 目 的 蛋 白 21kD, 结 果 显 色 出 来 后, 目 的 条 带 很 淡, 而 白 蛋 白 和 IgG 条 带 很 浓? 解 答 : 可 能 是 因 为 白 蛋 白 为 67kD 和 目 的 蛋 白 相 差 教 大, 且 他 的 浓 度 较 低, 你 可 以 以 底 物 二 氨 基 联 苯 胺 和 0.01% 过 氧 化 氢 溶 液 显 色 的 时 间 延 长 为 30 分 钟, 再 用 去 离 子 水 漂 洗 以 终 止 反 应 ; 也 可 能 是 抗 体 的 特 异 性 不 好 把 封 闭 的 时 间 延 长, 同 时 提 高 封 闭 液 的 浓 度, 可 以 减 少 以 下 背 景 噪 音 同 时 洗 的 时 候 要 彻 底, 而 目 的 条 带 弱, 说 明 浓 度 不 足, 如 果 不 考 虑 后 续 功 能 的 话, 你 可 以 过 G-50( 细 ) 柱 子, 纯 化 你 的 靶 蛋 白, 接 着 真 空 冷 冻 浓 缩, 可 以 得 到 很 漂 亮 的 结 果 LLLL. Western 转 膜 已 经 成 功 了, 但 是 Marker 泳 道 未 见 蛋 白 条 带 ( 正 常 应 该 有 6 条 ), 其 余 各 泳 道 均 有 清 晰 的 蛋 白 条 带, 经 考 马 斯 亮 蓝 染 胶, 结 果 相 同 经 5% 的 脱 脂 牛 奶 封 闭 1 小 时 45 分 钟 后, 进 行 一 抗 孵 育 (1:200, 建 议 起 始 浓 度 ) 过 夜, 二 抗 孵 育 5 个 半 小 时 (1:2000), 均 在 室 温 下,DAB 显 色, 虽 出 现 蛋 白 条 带, 但 较 弱, 且 出 现 非 特 异 性 条 带 请 问 :1 Marker 是 MBI 公 司 的, 可 分 离 KD 的 蛋 白, 买 了 大 概 有 一 年 的 时 间, 是 否 有 问 题?2 一 抗 ( 为 多 克 隆 抗 体 ) 二 抗 的 浓 度 及 孵 育 的 时 间 是 否 合 适? 3 封 闭 的 时 间 是 否 太 短? 解 答 :1. marker 有 可 能 被 降 解 了, 也 有 可 能 是 它 标 称 的 上 样 量 太 少, 不 够,

35 我 做 过 一 个 标 称 每 次 5ul 可 我 上 了 20ul 才 行 的 2. 建 议, 一 抗 4 度 过 夜 也 很 好, 建 议 1:100, 室 温 2hrs 就 够 了, 3. 二 抗 室 温 1 小 时,1:2000, 我 喜 欢 4 度 封 闭 过 夜 ( 室 温 2hr 就 够 了 ),1 抗 室 温 1hr,2 抗 室 温 1hr, 最 好 是 一 抗 4 度 过 夜 ( 或 室 温 2 小 时 )1:200,2 抗 室 温 1 小 时 1:2000, 换 ECL 法