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罹习
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1 中央研究院高中生命科學資優生培育計畫專題研究報告阿拉伯芥抗高鹽逆境機轉作者 : 王思堯指導教授 : 中興大學顏宏真教授本班學號 :96091 學校 : 國立臺中女中 0

2 目錄壹摘要 02 貳研究動機 02 參研究目的 03 肆研究設備與器材 04 伍研究過程與方法 05 一阿拉伯芥植株培育 06 二光合系統 II 效率 06 三光合色素含量測定 06 四元素測定分析 07 五蛋白質電泳 08 六二維電泳 09 七種子萌發率測定 10 陸結果 11 柒討論 22 捌結論 27 玖未來展望 28 拾參考文獻 29 1

3 壹摘要植株的生長情形會隨著環境中鹽分的種類及含量之差異而有所不同為了瞭解植物在高鹽逆境下的生長情形及其體內的應變機制, 我們以阿拉伯芥為實驗對象, 配製不同種類及濃度的鹽類溶液, 並以其澆灌阿拉伯芥, 再進一步觀察鹽類溶液對植株生長情形的影響藉由評估光合作用效率, 分析植株的蛋白質和元素含量及計算種子萌發率, 評估植株在不同逆境處理下的生長情形及被誘發的抗鹽機制經過實驗及分析, 發現在 NaCl 和 KCl 的環境下, 光合作用效率顯著下降,NaCl 高鹽逆境甚至造成種子萌發率的銳減另一方面,MgCl2 的添加卻對植株光合作用效率有正面影響此外, 添加 225 mm NaCl 溶液的植株, 其體內則產生了抗高鹽逆境的蛋白質貳研究動機有一天, 我們在 Discovery 頻道看到有關紅樹林的報導, 讓我們發想, 紅樹林植物能夠在高鹽度的環境中生長, 演化出屬於自己的一套抗逆境機制, 那麼在一般自然環境中生長的植物是否有此潛能? 還是只是尚未被誘發? 為了解決我們的疑惑, 經過幾番共同討論, 我們決定使用阿拉伯芥作為實驗的研究對象, 並設計了一系列的實驗來探討高鹽逆境下的植株生理狀態是否有所變異 2

4 參研究目的為了解植物在逆境下的生理反應, 選定具有豐富的生理生化及遺傳資訊之模式植物阿拉伯芥 ( Arabidopsis thaliana ) 進行實驗, 參閱文獻 (Taiz L, Zeiger E. 2006) 後設計出利用四種土壤中常見鹽類, 配合不同濃度的鹽水澆灌植株, 分別是 NaCl ( 75 mm 150 mm 225 mm 300 mm ) KCl ( 15 mm 30 mm 45 mm 60 mm ) MgCl2 ( 2 mm 5 mm 10 mm ) CaCl2 ( 5 mm 10 mm 15 mm 20 mm ), 觀察分析其生理反應, 再利用下列指標檢視高鹽逆境對其生理影響 : 一光合系統 II 效率 : 光合系統 II 將光能轉換成化學能, 此為光合作用光反應部分, 故其效率會影響植物行光合作用的能力, 為了解植物在逆境下光合作用效率的變化, 利用葉綠素螢光儀測定光合系統 II 效率, 藉此觀察阿拉伯芥的光合作用是否因逆境環境造成影響二光合色素含量測定 : 葉綠素 a b 類胡蘿蔔素為植物主要的光合色素, 此色素含量的多寡足以影響光合作用速率 ; 因此, 進一步測量光合色素含量的改變, 以分析逆境對光合色素含量和光合作用的影響三元素測定分析 : 植物的根會從土壤中吸收金屬離子, 以維持植物的正常生理機能 ; 於是希望藉由植株元素含量分析, 了解阿拉伯芥處於高離子濃度的環境下, 是否會表現屬於自己的一套抗鹽機制, 以保持植株離子的正常濃度四蛋白質電泳分析 : 為了解植物在逆境下是否會表現抗逆境的蛋白質, 進而提高植株對逆境之耐受性, 利用蛋白質電泳, 觀察逆境下的蛋白質表現量, 比較其與正常環境下的蛋白質表現量有何不同五蛋白質二維電泳分析 : 由於細胞內蛋白質種類繁多, 一維電泳適合比較多種處理後蛋白質表現的差異, 然而其分離效果有限, 所以若要鑑定特定蛋白質身分, 可進一步利用二維電泳提高蛋白質的分離度, 以找出在逆境下新表現出的蛋白質六種子萌發率測定 : 藉由計算逆境中阿拉伯芥產生的種子萌發的比例, 藉以了解高鹽環境對種子萌發的影響 3

5 肆研究設備與器材一葉綠素螢光測定儀 PEA ( plant efficiency analyzer, Hanstech Instruments, Ltd. Inc., England ) 二分光光度計 Ultrospec ( 2100 pro, Amersham Biosciences, U.S.A. ) 三分光光度計 Ultrospec ( UV-1201, Shimadzu Corporation, Japan ) 四感應耦合電漿離子蝕刻系統 ICP ( Inductively Coupled Plasma ) Atomic Emission Spectrometer ( JY138 Ultrace, Instruments SA. Inc., Edison, NJ ) 五超音波震盪器 Ultrasonic Cleaner ( D150H, Delta, Taiwan ) 六試管震盪 Vortex Genie-2 ( G-560, Scientific Industries, Inc., U.S.A. ) 七低溫離心機 Centrifuge ( 5415R, Eppendorf, Germany ) 八迴轉式振盪器 Orbital Shaker ( S-101, Firstek, UK ) 九高速冷凍離心機 Sorvall Instruments ( RC-5C, Dupont Instruments, Australia ) 十垂直電泳槽 Mighty Small II ( SE250, Hoefer Scientific Instruments, U.S.A. ) 十一介質輔助雷射脫附游離 - 飛行時間質譜儀系統 MALDI-TOF ( Voyager-DEPRO, Applied Brosystems, U.S.A. ) 4

6 5 不同高鹽逆境處理阿拉伯芥植物外觀觀察光合作用的效能植株元素含量分析蛋白質表現量分析種子萌發率測定葉部形態變化各種蛋白質含量的比較二維電泳分析光合系統 II 活性光合色素含量分析蛋白質鑑定一維電泳分析 II 伍研究過程與方法

7 一阿拉伯芥植株培育以野生種阿拉伯芥 ( Arabidopsis thaliana ) 為材料, 種植於盆中泥土以蛭石 : 珍珠石 : 泥炭土 = 1:1:8 之比例混合, 置於國立中興大學生命科學大樓四樓植物培養室光照 100 µmol/m 2 /s, 溫度控制在 25 o C, 植株每天均澆水 100 ml, 並給予適當之肥料 ( 花寶 2 號 ) 至一個月大時, 開始進行不同濃度的鹽類溶液 50 ml 處理, 為期共 7 天, 對照組植株則澆灌清水二光合系統 II 效率 ( 一 ) 實驗儀器 : 由 PEA ( plant efficiency analyzer, Hansatech, Ltd, Inc, England ) 葉綠素螢光測定儀先照射微弱紅光, 測出光合系統 II 效率的基礎值, 再瞬間施予強烈白光, 測出光合色素受到高能, 激發電子所散發出的螢光量, 計算其與基礎值的比值, 就能評估光合色素遭到破壞的程度 ( 二 ) 實驗步驟 : 在澆灌鹽水後, 於每日早上 11 點至下午 1 點進行為期一週的光合系統 II 效率測定測定前一天, 將對照組搬入室內暗處, 供次日測定比對之用測定當日中午, 先將葉片表面泥土撥除, 利用 PEA 葉綠素螢光測定儀夾住葉片特定部分 ( 葉片需完全掩蓋發光孔 ), 以非破壞性方式測定其葉綠素螢光值 ( Fv/Fm ) 三光合色素含量測定 ( 一 ) 實驗儀器 : 分光光度計 ( UV-1201, Shimadzu Corporation, Japan ) 1. 原理 : The Beer-Lambert Law : A=εbc (Ingle and Crouch, 1988) (A: 吸光值 ;ε: 吸光係數 ;b: 光徑 ;c: 濃縮液濃度 ) 2. 濃度校正 : 以 70% 酒精的吸光值定為分光光度計的零點 3. 測量 : 將樣本裝入 cuvett, 測量樣本對波長 340~700 nm 的吸光值 ( 二 ) 實驗步驟取各種鹽類處理一週後的輪狀葉 3 片, 分裝成 48 個樣本, 加入 70% 酒精 1 毫升, 置於黑暗 4 C 冷藏中, 使色素完全溶出將色素萃取液分別放入分光光度計測 6

8 定樣本對波長 340~700 nm 可見光區的吸收光譜變化再將 OD663 OD645 OD440 的值代入公式 ( Wintermans and De Mots, 1965 ), 可計算出葉綠素 a b 和類胡蘿蔔素的總量光合色素含量公式 : 葉綠素 a(mg/g 鮮重 )= ( 12.7* OD * OD645 ) ( V 1000 W ) 葉綠素 b(mg/g 鮮重 )= ( 22.9* OD * OD645 ) ( V 1000 W ) 類胡蘿蔔素總量 (mg/g 鮮重 )Cc=4.695* OD *C ( a+b ) OD 663 : 光合色素萃取液在波長 663 nm 的吸光值 V: 光合色素萃取液的總體積 ( 本實驗為 1mL) W: 葉片的鮮重 ( 本實驗因葉片鮮重受鹽類處理影響變動頗大, 故改以每片葉片之總光合色素含量呈現 ) 四元素測定分析 ( 一 ) 實驗原理 : 1.ICP: 利用高頻電磁感應產生的高溫氬氣電漿, 使導入電漿中的樣品受熱, 並進行去溶劑分解原子 ( 離子 ) 化及激發等反應其分析的依據是利用被激發的待分析元素之原子 ( 離子 ) 所發射出的光譜線, 經由光譜儀的分光及偵測, 進行元素之定性及定量 2. 灰化 : 將植株灰化形成灰分, 以獲得其體內的無機鹽, 同時可使分析物以外的其他物質揮發, 以減少背景吸收的問題 ; 且不造成待測物的漏失 ( 二 ) 實驗步驟 : 將坩鍋以 10% K2Cr2O7 及 10% H2SO4的酸性清洗液浸泡 30 分鐘, 後利用熱水清洗二至三次接著置放於丙酮中浸泡 15 分鐘後, 將坩鍋取出風乾即可備用 ( 需徹底洗淨, 確保無雜質 ) 鹽處理一週之葉片置於 55 C 烘箱中烘乾後磨碎, 混合均勻置放於坩鍋中, 後放入高溫灰化爐內以 470±5 C 進行灰化 16 小時, 並放置於爐內自然冷卻 12 小時至 7

9 室溫將灰化後的葉子連同坩鍋置放於 80 C 的加熱板上, 並於坩鍋中加入 0.2ml 二次水 3ml 6M HCl 0.1ml 10N HNO3加熱蒸乾將蒸乾後的結晶溶於 3ml 二次水和 3ml 6M HCl 中, 所得為酸性萃取液萃取液以濾紙過濾至試管中, 並再各用 3ml 的二次水清洗坩鍋三次, 過濾至試管中最後以二次水定量體積至 50ml 樣品中鈉鉀鎂鈣等四種離子的含量測定, 委託中興大學土壤調查中心進行元素分析, 利用感應耦合電漿離子蝕刻系統 ICP ( Inductively Coupled Plasma ) Atomic Emission Spectrometer ( JY138 Ultrace, Instruments SA. Inc., Edison, NJ ) 進行測定五蛋白質電泳 ( SDS-PAGE ) ( 一 ) 實驗步驟 : 本實驗使用 Hoefer Small Mini-Vertical Electrophoresis SE250 ( Hoefer Scientific Instruments, U.S.A. ) 進行分析先配製 separation gel ( 12.5% acrylamine / bis-acrylamine, M Tris-HCl ph8.8, 0.1% SDS, 0.075% ammonia persulfate, 0.05% TEMED ), 以水壓平膠體, 待 acrylamine 聚合後再配製 stacking gel ( 4% acrylamine / bis-acrylamine, 0.125% Tris-HCl ph6.8, 0.1% SDS, 0.075% ammonia persulfate, 0.05% TEMED ) 蛋白質樣品加入等體積的 2X sample buffer ( 125 mm Tris-HCl ph6.8, 6% SDS, 15% glycerol, 20% β-mercaptoethanol, 少許 bromophenol blue ), 於 Dry Bath ( Incubator, Fisher Scientific, U.S.A. ) 95 加熱 10 分鐘, 使蛋白質變性 12,000 rpm 離心 10 分鐘去除雜質後, 以微量針筒吸取液體注入 well 中, 在直立式電泳槽 ( Mighty, Small2 SE 250, Hoefer Scientific Instruments, U.S.A. ) 中注入 running buffer ( 25 mm Tris-HCl, 0.1% SDS, 1.44% glycine ), 以 15 ma ( stacking ) 及 25 ma ( separation ) 的電流或 100 V ( stacking ) 及 150 V ( separation ) 的電壓進行電泳當蛋白質分離至適當位置時, 將膠體拆下浸至 stain buffer ( 0.2% coomassie brilliant blue R-250, 50% methanol, 7% acetic acid ) 中, 放在 Orbital Shaker ( S-101, Firstek, R.O.C. ) 上以轉速 50 rpm 染色 2 小時, 再用 destain buffer ( 50% methanol, 7% acetic acid ) 退染至背景透明即可 8

10 六二維電泳 ( 一 ) 實驗原理 : 本實驗以 Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System ( GE Healthcare, U.K. ) 進行等電點聚焦 ( 二 ) 實驗步驟 : 1. 樣本處理 : 葉片蛋白質粗萃取液加入等體積的 water-saturated phenol, 充分搖勻後放置高速冷凍離心機 ( Sorvall Instruments, RC-5C, Dupont, U.S.A. ) 以 12,000 rpm 20 分鐘加入四倍體積 ice-cold methanol solution ( 100 mm ammonium acetate, 2% β-mercaptoethanol ) 進行沉澱至隔天將沉澱的蛋白質離心 20 分鐘, 將 pellet 移至 eppendorf 中, 以 methanol solution 清洗兩次, 再用 acetone 清洗三次, 每次離心 12,000 rpm 20 分鐘, 最後風乾即可得到純蛋白質樣品將該樣品溶於 125μL rehydration solution ( 8 M urea, 0.5% CHAPS, 0.2% DTT, 0.5% IPG buffer, ph 3-10, 0.002% bromophenol blue ), 離心後取上清液進行覆水 2. 覆水 : 將蛋白質樣品注入 7 公分 Ettan IPGphor strip holder ( GE Healthcare, U.K. ) 的凹槽中, 自七公分膠條 ( Immobiline DryStrip, Ph 3-10 ) ( GE Healthcare, U.K. ) acid end 移除保護層後膠體面朝下正極朝向 strip holder 的尖端放入 strip holder 的凹槽, 小心避免膠條與 strip holder 間帶有氣泡, 加入 600μL DryStrip cover fluid ( GE Healthcare, U.K. ) 避免樣品蒸發及 urea 結晶, 蓋上蓋子將 strip holder 置於 Ettan IPGphor unit, 於 20 進行覆水 16 小時 3. 等電點聚焦 : 以 Ettan IPGphor unit 進行等電點聚焦, 共同條件為 20 50μV / strip 葉片蛋白質樣品 step1:500 V,30 分鐘 step2:1000 V,30 分鐘 step3: 5000 V 持續至 7500 V / hr 4.SDS-PAGE: 將膠條置於 equilibration solution ( 50 mm Tris-HCl ph8.8, 6 M urea, 2% SDS, 30% glycerol, 50 mg DTT, 0.002% bromophenol blue ) 輕搖 15 分鐘, 以 SDS running buffer 潤洗兩次將膠條置於 stacking gel 上, 在膠條上加入 agarose sealing solution ( 0.5% agarose, 0.002% bromophenol blue) 避免膠條移動或浮起, 以 100 V stacking 30 分鐘, 接著以 150 V 將蛋白質分離至適當位置, 後將膠體拆下 9

11 浸至 stain buffer ( 0.2% coomassie brilliant blue R-250, 50% methanol, 7% acetic acid ) 中, 放在 Orbital Shaker ( S-101, Firstek, R.O.C. ) 上以轉速 50 rpm 染色 2 小時, 再用 destain buffer ( 50% methanol, 7% acetic acid ) 退染至背景透明即可 5. 蛋白質身分鑑定 : 將特定蛋白質由跑完的電泳膠上切除, 經二次水清洗三次後, 以 MALDI-TOF 進行蛋白質身分鑑定, 委由中興大學生物科技發展中心進行蛋白質身分鑑定, 所得資料則利用 Matrix Science 網站 ( ) 與阿拉伯芥蛋白資料庫進行比對七種子萌發率測定將消毒後的種子放在同樣濕度的濾紙上, 置於培養皿中, 並計算種子總數 ; 一週後, 計算發芽的種子數並比較萌發率 10

12 陸結果一光合系統 II 效率澆灌不同鹽類溶液之阿拉伯芥, 光合系統 II 效率改變之情形如下 ( 圖中曲線為趨勢線 ) NaC l 光合作用效率對照組 NaCl 75 mm NaCl 150 mm NaCl 225 mm NaCl 300 mm 時間 ( 天 ) 11

13 正常生長情況下, 阿拉伯芥的葉綠素螢光比值維持在 0.75 附近, 在 NaCl 處理前三天其比值仍可維持在 0.75, 第四天起高濃度 NaCl 處理組葉綠素螢光比值持續下降到 0.4, 此代表光系統 II 已失去大部分激發電子的能力在澆灌 KCl 的阿拉伯芥其光合作用效率亦有下降的趨勢, 而 MgCl2 CaCl2 則沒有明顯影響 ( 其中 MgCl2 2 mm 雖然鹽分濃度仍在正常範圍, 但趨勢線卻下降, 原因將於後面討論解釋 ) 12

14 實驗過程中發現即使同一株植物, 不同位置的葉片所測得之葉綠素螢光比值仍然差異甚大, 以下為不同 NaCl KCl 濃度處理下光合系統 II 效率的折線圖, 由標準差所涵蓋的範圍顯示, 在高鹽逆境下, 不同葉片對逆境的反應不同 ( 個體差異極大 ) 13

15 二光合色素含量測定各種鹽類溶液處理各 3 個樣本, 取平均繪製葉綠素 a b 與類胡蘿蔔素含量的長條圖 (mg/leaf) NaCl 葉綠素 a 葉綠素 b 類胡蘿蔔素光合色素含量對照組 NaCl75mM NaCl 150mM NaCl 225mM NaCl 300mM 圖一以不同濃度的 NaCl 溶液澆灌阿拉伯芥 7 天, 發現葉綠素 a b 的含量皆比對照組低, 類胡蘿蔔素則在高鹽 225 mm 300 mm 處理後較對照組高倍 (mg/leaf) KCl 葉綠素 a 葉綠素 b 類胡蘿蔔素光合色素含量對照組 KCl 15mM KCl 30mM KCl 45mM KCl 60mM 圖二以不同濃度的 KCl 溶液澆灌阿拉伯芥 7 天, 發現葉綠素 a b 類胡蘿蔔素的含量均較對照組低 14

16 (mg/leaf) MgCl2 葉綠素 a 葉綠素 b 類胡蘿蔔素光合色素含量對照組 MgCl2 2mM MgCl2 5mM MgCl2 10mM 圖三以不同濃度的 MgCl2 溶液澆灌阿拉伯芥 7 天, 發現葉綠素 a b 與類胡蘿蔔素的含量在 2 mm MgCl2 處理組較對照組低, 但將鎂離子濃度提高到 5 mm 10 mm 後, 葉綠素 a b 的含量反而有回升的趨勢 (mg/leaf) CaCl2 葉綠素 a 葉綠素 b 類胡蘿蔔素光合色素含量對照組 CaCl2 5mM CaCl2 10mM CaCl2 15mM CaCl2 20mM 圖四以不同濃度的 CaCl2 溶液澆灌阿拉伯芥 7 天, 發現葉綠素 a b 與類胡蘿蔔素的含量均比對照組低從上表可看出, 經四種鹽類處理後, 葉綠素 a b 的含量均有下降之趨勢, 而類胡蘿蔔素含量在高濃度 NaCl 處理組中有增多的趨勢, 伴隨著植株葉片呈現明顯黃化症狀 15

17 三元素含量測定下圖為根據植株元素含量測定所得的數據, 選取同種鹽水中, 以不同濃度澆灌後, 植株元素含量最高者, 將其值相較於對照組計算出比例繪製而成對照組對照組 NaCl 300 mm MgCl 2 2 mm KCl 15 mm CaCl 2 15 mm NaCl 150 mm MgCl 2 10 mm KCl 60 mm CaCl 2 15 mm 澆灌不同鹽類溶液的植株, 其體內相同元素的含量明顯高於對照組及其他各組, 由此可證明各植物體皆有確實吸收澆灌到土壤的鹽類以下的結果分析皆不討論相同元素澆灌對植株該元素含量的影響以 NaCl 澆灌的植株, 除了植物體內鈉元素增加了近 40 倍外, 其體內鉀元素含量則降低了 7 成, 顯示植株體內鈉含量過高會影響鉀元素吸收 16

18 對照組對照組 NaCl 75 mm KCl 15 mm NaCl 75 mm KCl 30 mm MgCl 2 10 mm CaCl 2 15 mm MgCl 2 10 mm CaCl 2 10 mm 無論是以何種鹽類溶液澆灌, 鈣元素的比例在植物體中的變化幅度皆不顯著另外, 以 KCl 及 CaCl2澆灌的植株, 其體內的鎂元素含量在與對照組相較之下, 亦有明顯增加的情形 17

19 四蛋白質電泳 ( SDS-PAGE ) ( 一 )SDS-PAGE 下圖為在不同鹽類與濃度的溶液處理下的阿拉伯芥, 葉片內蛋白質表現量電泳圖 MW (kda) control (mm) MW control (mm) (kda) NaCl KCl MW (kda) control (mm) MW control (mm) (kda) CaCl2 MgCl2 NaCl 處理所誘導之特定蛋白質斑紋 ( 進階做二維電泳 ) RuBisCO 蛋白質所在之位置 18

20 在各種鹽類溶夜處理一週後, 除了 NaCl 處理組外, 其餘處理之蛋白質表現量均無明顯差異, 在 225 mm NaCl 處理後, 對比於對照組, 發現一條約 80 kda 的特殊蛋白質斑紋 ( 如左上圖中紅圈所標示 ) 推測它是因為植物處於逆境, 為了使自己能夠存活下去, 所誘導出的抗逆境蛋白質針對此特殊蛋白質, 繼續進行二維電泳, 希望能對它有更進一步的了解 19

21 五二維電泳針對 SDS-PAGE 觀察到蛋白累積有變化之 225mM NaCl 處理組的植株, 利用解析度較高的蛋白質二維電泳進行分離 MW (kda) ph3 ph10 control MW (kda) ph3 ph10 225mM NaCl Salt- decreased Salt- induced * 取編號蛋白質做蛋白質鑑定 20

22 由此二維電泳的分析, 發現在對照組和加鹽處理兩組樣本中的蛋白質在許多部分都有些微的變化, 我們藉由參考 SDS-PAGE 所鑑定之 80 kda 特殊斑紋所在的位置, 在二維電泳膠上挑選了編號四個蛋白質點, 進行蛋白質的身分鑑定以下為各蛋白質經鑑定及比對後, 所推測得到的蛋白質種類 MOWSE # pep MW Score # mat %Cov (Da)/pI Accession # Species Protein Name % mat # /6/ /6.2 Q9FX85 Peroxidase 10 precursor # /9/ /6.5 Q6R2K1 Protein STRUBBELIG-RECEPTOR FAMILY 5 precursor # /5/ /6.1 Q9LX55 Putative F-box/LRR-repeat protein At3g59160 # /6/ /6.5 Q9FHK7 Probable receptor kinase At5g05160 precursor 六種子萌發率測定各種鹽類溶液處理一週後, 將植株繼續培養到收成種子, 進一步測試種子的萌發率種子萌發率萌發率低高 5 相對濃度 NaCl KCl MgCl2 CaCl2 數據顯示, 在鈉鹽處理下的植株, 其種子在鹽類溶液濃度較高的環境下, 幾乎不萌發而鉀鎂鈣鹽處理對種子的萌發率, 則沒有明顯的影響 21

23 柒討論一葉部形態變化 :( 圖片取各種鹽類溶液最高濃度 ) 澆灌 NaCl( 左圖 ) 的植株, 其輪狀葉由綠轉黃 ( 如圖中紅圈處 ), 且有些葉片萎縮澆灌 KCl( 右圖 ) 的植株, 其輪狀葉則無明顯變化澆灌 MgCl2( 左圖 ) 的植株, 其輪狀葉從葉緣開始發黃 ( 如圖中紅圈處 ) 澆灌 CaCl 2 ( 右圖 ) 的植株, 其幼葉蜷曲, 且略呈黃色 ( 如圖中紅圈處 ) 二光合系統 II 效率 : 結果顯示, 澆灌 NaCl KCl 之阿拉伯芥其光合系統 II 效率有下降的趨勢, 但進一步分析, 發現實驗的誤差值相互重疊, 因此不能斷定其鹽類溶液對光合系統 II 效率有造成下降的影響其可能造成誤差原因 : ( 一 ) 在澆灌鹽類溶液前, 同樣環境中生長的不同植株, 其生長狀況仍然會呈現個體 22

24 差異, 由下圖照片可看出, 其中有些葉片仍然是綠色有些卻已經變黃甚至萎縮, 故會影響到澆灌後的光合系統 II 效率 ( 下圖為以 NaCl 225 mm 的鹽類溶液澆灌的植株 ) ( 二 ) 選擇做光合系統 II 效率分析的葉片時, 採用隨機選取的方式, 每盆測定五個以上的值, 故測定的葉片可能因受其它葉片遮蔽的影響, 未受到光照因而生長不良, 導致其光合系統 II 效率在同一盆栽有所差異, 而使誤差變大 23

25 其中 MgCl2 2 mm 雖然鹽分濃度仍在正常範圍, 但趨勢線卻下降, 原因可能為不同植株間的個體差異此株植物在開始澆灌鎂鹽前, 靠近根部的莖表皮呈現與它株相異的紫紅色, 代表阿拉伯芥植株已遭受逆境, 進而累積花青素 ( Hsieh et al, 1998 ), 推測因植物表面被非光合色素掩蓋, 而造成光合色素的吸光值減少, 所以導致光合系統 II 效率的減低三植株光合色素含量的改變由於鎂元素為葉綠素 a b 結構中必要的成分, 故針對 MgCl2 處理下葉綠素 a b 的含量變化, 藉以觀察阿拉伯芥是否會增加吸收鎂離子, 並利用鎂元素建構更多的葉綠素 a b, 使其在高濃度鹽類溶液中仍能存活圖三顯示, 在 MgCl2 2 mm 至 10 mm 的葉綠素 a b 含量有回升的趨勢, 但整體含量還是少於對照組, 因此初步推定葉綠素 a b 含量仍較對照組少的原因可能為氯元素的毒害為了解鎂元素對逆境下阿拉伯芥的影響, 選擇 MgCl2 10 mm 和 CaCl2 10 mm 的數據交叉比對, 挑選此兩組作比較乃是因其氯元素的體積莫耳濃度相等, 所以氯元素的毒害相同在此兩組數據中,MgCl2 10 mm 處理下葉綠素 a 含量為 8.01 ( mg / leaf ), 葉綠素 b 含量為 5.50 ( mg / leaf ), 而 CaCl2 10 mm 處理下葉綠素 a 含量為 5.92 ( mg / leaf ), 葉綠素 b 含量 24

26 為 3.72 ( mg / leaf ), 顯示 MgCl2鹽處理組葉綠素 a b 含量較高, 故可推測鎂元素的存在可能對逆境下的阿拉伯芥是有益的若要進一步觀察鎂元素在逆境下扮演的角色, 未來可以使用 MgSO4 來取代 MgCl2, 進行提高鎂元素的含量之試驗, 以消除氯元素毒害之疑慮四植株內元素的改變當外在環境因素造成植物體內鈉元素增加時, 其體內鉀元素含量則顯著下降造成此現象乃是因鈉和鉀同為鹼金屬, 彼此有相互競爭的關係 ( Niu et al, 1995 ) 因此在植株內鈉元素與鉀元素的含量會相互拮抗而造成植株鈣元素含量無顯著差異之因素, 我們認為其原因應是 : 鈣元素是植物體中訊息傳遞的物質及重要的調控機制, 植物體會將體內的鈣元素含量控制在一定的範圍之內, 以讓訊息能正常傳遞, 同時也可以減緩高鹽環境對本身的傷害至於澆灌 KCl 及 CaCl2兩種鹽類溶液對植物體中鎂元素含量的影響, 我們推測 : 鎂元素是構成植物體葉綠素的唯一金屬元素, 同時也是許多酶的活化劑, 植物體若缺乏鎂元素則會阻礙植物進行光合作用, 並且造成老葉葉脈間黃化, 新葉彎曲 ( Chen et al, 2007 ) 而高鹽逆境有可能促使植株增加鎂離子的吸收量, 以此增強光合作用, 幫助植物體對抗逆境在另一方面, 圖表中顯示以 NaCl 澆灌的植株, 其鈉元素含量高出其他組別約十倍, 其原因除了是植物體本身對鈉元素的反應較為顯著之外, 不排除可能為實驗進行前未清洗葉片, 導致殘留於葉片上的藥品影響實驗結果五植株內蛋白質變化由一維蛋白質電泳結果中, 發現大多數的植株都會隨著鹽類溶液濃度增高 ( 逆境由小到大 ), 而造成其體內蛋白質減少, 尤其是光合作用相關酵素, 在光系統無法提供足夠能量時, 二氧化碳的固定速率亦會下降, 此時 RuBisCO 等酵素蛋白質所需要之量就減少, 多餘之蛋白質可以經由分解而釋出游離胺基酸, 以供逆境下合成抗逆境蛋白質依據二維電泳的檢測結果, 將挑選出的四個逆境誘導之蛋白質做身份鑑定後, 推測分別是 1. Peroxidase 10 25

27 2. Protein Strubbelig-Receptor family 5 3. Putative F-box/LRR-repeat protein 4. Probable receptor kinase 其中 Peroxidase( 過氧化氫酶 ) 的功能應是分解高鹽逆境下所產生之活性氧 ; 一般逆境常會伴隨氧化逆境, 當光合作用效率降低, 電子傳遞鍊無法順利傳遞電子, 造成電子附在氧氣上, 形成超氧根離子增加氧的活性, 攻擊細胞內具分子如脂肪酸及核酸等, 使植物體加速氧化故推測誘導過氧化氫酶來分解高活性的氧, 減緩老化速度其他三個蛋白質結構及功能均呈高度相關性, 如 2 號 Protein Strubbelig-Receptor family 5 及 3 號蛋白 Putative F-box / LRR-repeat protein, 均含有 LRR ( leucine rich repeat ) domain;2 號 Protein Strubbelig-Receptor family 5 及 4 號蛋白 Probable receptor kinase, 均含有蛋白質激酶 domain, 屬於 receptor kinase, 可能之功能包括參與逆境下細胞壁結構變化加速分解不需要的蛋白質將其轉換為對抗逆境所需要的蛋白質, 以及藉由使蛋白質磷酸化或去磷酸化進行訊息的傳遞, 使植物啟動對抗高鹽逆境的相關機制六種子萌發率測定高濃度 NaCl 環境下的種子幾乎不萌發, 推測是因其花粉粒發育不良使胚珠無法受精, 或是孢子體無法吸收足夠養分進而使種子發育不良所導致, 但因阿拉伯芥的種子顆粒太小, 無法以肉眼觀察區別 26

28 捌結論綜合以上結果, 我們可以得知 : 1. 鎂元素對植物體的光合作用效率可能有正面的影響 2. 在各種高鹽溶液環境下, 植物葉綠素 a 葉綠素 b 含量皆會下降 3. 在 NaCl 225 mm 的環境下, 植物會產生對抗高鹽逆境的蛋白質 4. 在 NaCl 的高鹽逆境下, 會造成種子萌發率銳減 27

29 玖未來展望透過這次實驗, 我們觀察到不同鹽處理之下植株的生長情形, 也測得不同鹽類溶液對植物光合作用效率植株元素含量及種子萌發率的影響, 更進一步分析出受逆境影響而被誘發的蛋白質讓我們對於高鹽逆境和植物體之間的關聯有了更深層的認識若欲於未來進行相關研究, 可針對以下幾點進行更深入之探討 : 一增加鹽類溶液濃度及種類, 探討於不同逆境環境下植物體的反應二使用不同種類的植物進行研究, 並比較不同植物與阿拉伯芥對高鹽逆境的反應之異同三可進一步利用顯微鏡, 釐清影響種子萌發率的原因究竟為何四可以針對因逆境而改變的蛋白質作更深入的研究, 從而更確切了解植物的抗逆境機轉 28

30 拾參考文獻 Chen LJ, Lu KT, Liu CT. Effect of bamboo vinegar on promoting the growth of Brassica chinensis ( Linn ). Taiwan J For Sci, 2007 ; 22 ( 2 ) : Hsieh M-H, Lam H-M, van de Loo FJ, Coruzzi G A PII-like protein in Arabidopsis: putative role in nitrogen sensing. Proc Natl Acad Sci U.S.A., 1998; 95: J. D. J. Ingle and S. R. Crouch, Spectrochemical Analysis, Prentice Hall, New Jersey, U.S.A Niu X, Bressan RA, Hasegawa PM, Pardo JM. Ion Homeostasis in NaCl Stress Environments. Plant Physiol, 1995 Nov ; 109 ( 3 ) : Taiz L, Zeiger E. Plant Physiology, 4th edition, Sinauer Associates, Inc. Publishers, Sunderland, Massachusetts, U.S.A Wintermans, J. F. G. M., and A. De Mots. Spectrophotometric characteristics of chlorophylls a and b and their pheophytins in ethanol. Biochimica et Biophysica Acta, 1965 ; 109 :

P3 膠體電泳法

P3 膠體電泳法 Polyacrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯醯胺膠体電泳莊榮輝 3.1 電泳原理帶電分子在電場中能夠移動, 稱作泳動, 泳動的程度稱為泳動率 (mobility).. 泳動率 ~ ( 所外加電壓 mv) ( 分子之淨電荷 ) 分子與介質間之摩擦力上述