Western blotting 实验详细步骤 : 一 蛋白样品的制备 ( 蛋白抽提 ) 1. 培养细胞蛋白样品的制备 (1) 细胞培养至 80% 左右密度时, 以含 0.05% 胰蛋白酶 (AR1007) 消化经细胞刮处理, 细胞经预冷的 PBS(AR0030) 漂洗两次,3000 g/min 离

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1 WB 实验流程 培养细胞总蛋白提取试剂 \ 哺乳动物组织总蛋白提取试剂 蛋白抽提 细菌总蛋白提取试剂 细胞胞浆和胞核蛋白提取试剂 细胞真核膜蛋白提取试剂盒细胞线粒体提取试剂盒红细胞裂解液快速沉淀和浓缩蛋白试剂盒 蛋白定量 BCA 蛋白定量试剂盒微量 BCA 蛋白定量试剂盒考马斯亮蓝增强型蛋白定量试剂盒 蛋白酶抑制剂 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液 上样 电泳 SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒 SDS-PAGE 电泳缓冲液 彩色预染蛋白分子量标准 生物素标记蛋白质分子量标准 凝胶蛋白质蓝染试剂盒快速凝胶蛋白质蓝染试剂盒蛋白质银染检测试剂盒 染胶 转膜 硝酸纤维素 NC 膜转膜缓冲液蛋白转膜滤纸 印迹膜丽春红染色液 染膜 封闭 Western 漂洗缓冲液 Western 封闭缓冲液 博士德免疫分子生物试剂目录 孵育一抗 Western 专用 一抗二抗稀释液 孵育二抗 HRP 羊抗小鼠 IgG HRP- 羊抗兔 IgG 化学显色方法检测 化学发光方法检测 DAB 显色试剂 DAB 显色检测试剂盒 BCIP/NBT 显色试剂 超敏化学发光 ECL 底物超敏化学发光 ECM 试剂盒显影定影试剂盒蛋白印迹膜再生液 X 光片背景去除液试剂盒 WB 实验流程图

2 Western blotting 实验详细步骤 : 一 蛋白样品的制备 ( 蛋白抽提 ) 1. 培养细胞蛋白样品的制备 (1) 细胞培养至 80% 左右密度时, 以含 0.05% 胰蛋白酶 (AR1007) 消化经细胞刮处理, 细胞经预冷的 PBS(AR0030) 漂洗两次,3000 g/min 离心 2-3 分钟 去除上清, 向沉淀中加入 5-7 倍沉淀体积的博士德培养细胞总蛋白提取试剂 (AR0103), 反复吹打混匀 (2) 若有粘稠物存在可用超声细胞破碎仪超声处理, 超声时间为 2 秒, 间歇 2 秒, 功率为 瓦, 至溶液无粘稠为止 处理完后置冰上裂解 4-5 小时 (3) 再次超声处理至无粘稠,10000 g/min 离心 10min 弃上层脂类和下层细胞碎片, 取中层蛋白溶液, 加入等体积的博士德 2x 蛋白上样缓冲液 (AR0131) 或 1/4 体积 5x 蛋白上样缓冲液 (AR1112), 混匀, 样品置 100 水浴箱中变性 5 分钟 至此样品制备完成 ( 样品可立即使用, 也可以分装冻存 -20 存放的样品可稳定维持数月,4 可保存 1-2 星期 ) 2. 组织蛋白样品的制备 (1) 手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中, 洗去表面的血迹, 将组织称量后切成几个较小的组织块 (0.1-1g), 放入组织匀浆器中, 按组织净重 (g): 哺乳动物组织总蛋白提取试剂体积 (ml)=1:10 的比例加入相应体积的哺乳动物组织总蛋白提取试剂 ( 需提前加入博士德酶抑制剂 ) 进行匀浆, 至组织研磨完全 (2) 超声处理 ( 同细胞蛋白样品的制备 ), 处理完后置冰上裂解 4-5 小时 (3) 样品 g/min 离心 10min, 取中层蛋白溶液, 加入等体积的博士德 2X 蛋白上样缓冲液 (AR0131) 或 1/4 体积 5X 蛋白上样缓冲液 (AR1112), 混匀, 置 100 水浴箱中变性 5 分钟 3. 蛋白定量收集完蛋白样品后, 为确保每个蛋白样品的上样量一致, 需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度 常用蛋白定量试剂盒有博士德 BCA 蛋白定量试剂盒 (AR0146), 微量 BCA 蛋白定量试剂盒 (AR1110), 考马斯亮蓝增强型蛋白定量试剂盒 (AR0145) 考马斯亮蓝增强型蛋白定量操作简便迅速, 消耗样品量少, 但不同蛋白质之间差异大, 且标准曲线线性差 高浓度的 Tris EDTA 尿素 甘油 蔗糖 丙酮 硫酸铵和去污剂可改变测定液的 ph 值, 从而影响显色和干扰蛋白质定量 BCA 蛋白定量操作更简单, 试剂及其形成的颜色复合物稳定性更好, 几乎没有干扰物质的影响, 灵敏度高 ( 微量检测可达到 0.5 μg/ml), 应用更加灵活 与考马斯亮蓝增强型

3 蛋白定量法相比,BCA 法的显著优点是不受去垢剂的影响 二 凝胶的制备 : 使用博士德凝胶制备试剂盒 (AR0138) 蛋白分子量 (KD) 分离胶浓度 (%) >100 8% 30~100 10% 10~30 12% <10 15% 1 根据目的蛋白的分子量按比例配制分离胶, 轻缓摇动混匀, 切勿过于剧烈而混入过多氧气 待凝胶溶液混合均匀, 将凝胶溶液平缓注入灌胶装置的两层玻璃板中, 在液面上小心注入一层水, 以阻止氧气接触凝胶溶液影响凝胶的聚合, 保持水平, 在 37 恒温箱中静置约 1 小时, 直至凝胶溶液完全聚合凝固 2 按比例配制浓缩胶, 轻缓摇动混匀, 滤纸吸去已凝固分离胶上的水, 平缓注入浓缩胶溶液, 小心插入梳子, 并注意齿尖不可有气泡 在 37 恒温箱中静置约 1h, 直至凝胶溶液完全聚合凝固, 小心拔出梳子, 准备上样 三 上样向电泳槽中加入博士德电泳缓冲液, 使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔, 外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部 玻璃板内侧液面高于外侧 然后开始上样 ( 已处理好的样品, 博士德组织和细胞阳性对照蛋白样本和阳性对照重组蛋白, 彩色蛋白预染 Marker), 保证每孔总蛋白量在 30-50ug, 总上样量小于 30ul, 注意上样时间尽量短, 避免样品扩散 四 电泳上样完毕, 正确放置电泳槽盖, 注意正负极, 并选择适当的电压进行电泳 通常在不连续的系统中, 上层浓缩胶的电泳电压 ( 建议 70-80V) 要低于分离胶电泳电压 ( 建议 V), 以达到更好的浓缩效果, 使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上 电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳, 电泳时间约 2-3 小时

4 五 染胶电泳完毕可通过使用博士德凝胶蛋白质蓝染试剂 (AR0140), 凝胶蛋白质快速蓝染试剂 (AR0170), 蛋白质银染检测试剂 (AR0171) 检测电泳是否成功 染胶只用于检测样品电泳是否成功 染胶检测后的凝胶不能进行后续转膜等操作 六 转膜湿式电转膜 1. 电泳结束后取出凝胶, 在博士德转膜缓冲液中浸泡 分钟 按 三明治 模型 : 打开电转印夹, 每侧垫上一块专用的用转膜液浸泡透的海绵垫, 再各放一块转膜液浸透的博士德快速高效蛋白转移垫 ( 定性滤纸 ), 将凝胶平放在阴极侧滤纸上, 最后将转膜液浸透博士德硝酸纤维素 NC 膜平放在凝胶上, 去除气泡, 夹好电转印夹, 注意 NC 膜与胶,NC 膜与滤纸, 滤纸与胶之间不可有气泡 2 槽加满转膜缓冲液, 插入电转印夹, 将转印槽放入冰箱内 (-20 ), 确保 NC 膜最靠近正极, 带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移 3 选择恒流, 每个转印槽建议电流为 mA, 时间依据胶的浓度适当调整 4 结束后, 可染膜检测转膜效率 : 将 NC 膜置于博士德印迹膜丽春红染色液 (AR0142) 中, 室温 5-10 分钟即可见红色条带, 用洗涤缓冲液漂洗数次可洗去红色条带进行后续实验 七 封闭 1 印迹膜 : 使用博士德 Western 洗涤缓冲液室温漂洗 10 分钟 3 次 2 迹膜, 放入博士德封闭缓冲液中, 摇床摇动,4 封闭 小时

5 八 抗体的孵育先加入未标记的博士德特异性一抗抗体, 抗体与膜上的抗原蛋白结合, 再加入博士德酶标 ( 过氧化物酶和碱性磷酸酶 ) 二抗抗体进行孵育检测 1 封闭后的印迹膜加入博士德 Western 专用一抗二抗稀释液 (AR1017) 稀释后的一抗,4 孵育过夜 2 缓冲液洗膜 10 分钟 3 次 3 Western 专用一抗二抗稀释液 (AR1017) 稀释后二抗,4 度孵育 2h, 洗膜 3-6 次, 每次 10 分钟 九 蛋白检测 ( 显色 ) 根据标记二抗的标记物的不同, 其杂交的结果检测方法也不同, 常用的检测系统有博士德的化学发光检测 (ECL) 和化学显色 DAB 检测系统 博士德的化学发光检测 (ECL): 利用 HRP 催化化学发光物质, 生成一种不稳定的中间物质, 其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带, 利用胶片感光原理, 将结果记录下来 1 L 显色试剂配制 : 按 1ml 水加入博士德超敏化学发光底物 ( 浓缩型 )A.B 各 50ul 混匀 ; 博士德超敏 ECL 化学发光即用型底物 A,B 等体积混匀 2 合好的显色底物覆盖印迹膜 1-5min 3 在暗室用放射自显影胶片或化学发光成像系统记录结果 4 放射自显影胶片, 曝光几秒到数分钟, 以显影效果确定所测抗原的正确曝光时间 5 完的胶片先在博士德显影液中冲洗至出现条带为止, 再放入定影液中漂洗 ( 显影定影试剂盒 AR0132) 6 片背景较高或有阴影杂点, 推荐用博士德 X 光片背景去除液试剂 (AR0154) 去除胶片的高背景和阴影杂点, 可得到理想效果的胶片 7 膜上蛋白如需重复使用, 推荐用博士德 Western Blot 蛋白印迹膜再生液 (AR0153) 去除膜上一抗二抗, 重新进行抗体杂交

6 ECL 发光检测图例 博士德化学显色 DAB 检测 : 1 德 DAB 显色液的配制 : 按照 1ml 水加显色剂 A.B.C 各一滴混匀 2 将适量的 DAB 显色液平铺在杂交后的印迹膜上, 室温放置观察, 可出现明显的棕黄色蛋白条带 DAB 显色检测图例

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