293细胞的大规模培养

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1 C Ad5 E1 McMaster University F.L.Graham J.S.Miley 1976 DNA 293 Ad Ca CelliGen CelliGen PlusTM Bioflo cm2/g 293 Hela CHO %

2 293 Vero CHO Cytodex? Cytopore Cytoline BIOSTAT?B NBS CelliGen CelliGen PlusTM Bioflo3000 Cell-lift 293 1L spinner /ml S 293S 293S /ml

3 % 5% PH PH PH6.8 PH NaHCO3 NaHCO3 CO2 HEPES PH PH 4 1

4 2 5-20% ml 250ml 100ml 2 1cm 200ml 100ml 50ml 25ml 10ml 10ml 3 30mm 60mm 120mm 4 1ml 10ml 5 50ml 30ml 15ml 10ml 5ml

5 g ml ml A B 120 C

6 % NaOH % % NaOH 5% 30 A B C %

7 B 1 5ml 5ml PMRI PRMI ml 10ug/ml 1ml B B 5ml 4-5ml 2 PRNI ml 0.06ug/ml M KCL 10% ml 1000rpm ml rpm ml rpm8 8 60% rpm8 9 3m G B 1 2,5% 75% PRMI F10 F12 KCL 2 F-12 85% 15% 100u/ml A ml rpm10 0.5ml 3 30mm ml 48

8 ug/ml MKCL 5ml ml ml B ml 100ml 10ml 5-10ml A % 0.5-1ml/ rpm KCL 10ml ml PHA PHA Go PHA HPA 1 2.5% 75% M199 KCL 2 RPMI % 10% PHA 0.1ml 3% 10u/ml 2% 100u/ml 10ml 5ml % 75% 0.5-1ml ug/ml 4 10ml 2000rpm MKCL8ml

9 1-2ml rpm ml rpm PHA A 1 10g 75% ml ml ml ml rpm30 10ml 4 100ml PHA 2ml G5 B1 20g 75% ml rpm30 10ml 4 1 PRMI M199 DMEM % KCL % 5-15% 100u/ml % ug/ml A 90% B 0.025% 0.5-1ml/

10 3-5ml 2000rpm MKCL8ml ml rpm ml ml 1 2.5% 75% ml KCL ml ug/ml PH PH PHA

11 PHA PH PH PHA

12 PHA

13 2000 G G G 1 Giemsa gGiemsa 2 Giemsa 500ml 250ml ml 2 0.9%

14 3%tris 0.25% Gremsa % 100ml 0.25% 1ml 0.025% 4-5 tris PH ml 3 tris PH Giemea 1ml ml Giemsa 2-3

15 8 Giemsa tris Gremsa tris 9 Giemsa 80 2 SCE SCE DNA DNA SCE SCE 1 5- BudR, DNA BudR DNA BudR DNA BudR DNA BudR DNA Giemsa BudR DNA 2 BudR BudR 5mg 0.5ml 1N NaOH 5ml 1000ug/ml BudR 3 BudR 2 SSC

16 20W 4 1 BudR 24 BudR 5-15mg/ml ug/ml SSC cm PH6.8 2%Giemsa 15 6 G BudR fra MEM-Fra CT199 2

17 MEM-Fra 90-95% 5-10% 100u/ml PH X FraX Xq27 fra X q X MR fra X q27 FraX 1/2500 X MR 1/2-1/3 MR 1-2%

18 1 1m1 Hanks 1m1 2m1 ( 2000r min 20min 4 ( 2 1) ( ) Hanks 2000r min 10min RPMI l m1 2 T B B T RPMI l640 T B RPMI l640 B ( ) 3 CD4 CD8 1 CD4 T SephDdexC 10 RPMll CD4 2 CD8 Tris IgG( 10 g m1) 4 PBS CD8 T ( 1 l0 7 m1)3m1 4 2 PBS 10m1 PBS RPMI l640 CD4 4 ( ) 37 C02 1 RPMI HeLa 1

19 NaHC030 HeLa Hanks EDTA (PS) 5 6 (5m1 1m1) 1 HeLa Hanks EDTA 4 5ml 1min min 37 4 EDTA Hanks 4 5m min [ ] 1 MEM (P S)1 5 6 NaHCO3 ph (P S) NaHCO3 ph (P S) NaHCO3 ph (P S) NaHCO3 ph (K562) K562 RPMI l640 (5m1 1m1) 1 K562 2 K C h

20 0 1ml D Hanks 0 8m mI( ) 4 4 ( ) 10 2 (3 5) 10 5 m1 (1 3) 10 5 m1 [(2 6) 10 5 ml 37Y CPE ( 2 ) ( EDTA EDTA ) (dendritic cell,dc) Th TC T GM-CSF IL-4 IFN- HanKs(CMF-HanKs) GM-CSF(hrGM-CSF) hril-4 hr IFN- 1 RPMI1640 RPMI % FCS +2mmol/LL- +100IU/ml +100 g/ml +1g/L +1 mmol/l mol/l 2 2 RPMI1640/IL-4/GM-CSF: RPMI +IL-4(40ng/ml)+GM-CSF(50ng/ml). 3 RPMI1640/IFN- : RPMI + IFN- 1 ~ 10ng/ml 25 ml 75 ml CO2 3

21 1 2 IL-4 GM-CSF RPMI /ml 5% CO IL-4 GM-CSF 1640 CO2 4 IL-4 GM-CSF 7 IL-4 GM-CSF 1640 IFN- RPMI1640 5%CO % 2 CD14 90% ~ 100% IL-4 GM-CSF 7 IFN- 9 CD14 MHC- CD1 3 4 CD34 + CD LAK LAK(Lymphokine activated killer cell) IL-2 IL-12 3~5 LAK IL-2 hr12 LAK LAK MHC. CMF-Hanks. 1 RPMI1640 (RPMI+10mmol/LHEPES+2mmol/L g/ml ) 2 LAK RPMI % AB +IL /ml. 3 X-VIVO cm2 CO2 1 (PBMC) O 40ml 3 IL-2 CMF-Hanks 2000r/min 20min PBMC 2 CMF-Hanks PBSPBMC2 LAK RPMI %AB /ml IL /ml IL-2 X-VIVO 15 PBMC 2x10 6 /ml 4

22 6 5%CO ~ Kg 5min -20 TIL 4 RPMI1640 X-VIVO x10 8 ~ 1x10 9 FACS CTL NK [ ] 1 LAK NK CD56 + CD3 - CD25 + T CTL CD3 + CD8 + CTL CD56 + NK RaJi 2 LAK AIM-V 10% RPMI1640 X-VIVO15 LAK TIL tumor infiltrating lymphocyte,til IL 2 TIL LAK IL RPMI AB IL 2 200u/ml X VIVO15 IV 230u/g I DNA 3600u V 1500u/g 75cm 2 15ml CO2 1 RPMI mm u DNA 50µg 125u RPMI ml r/min RPMI1640 X VIVO TIL r/min 20min 100 TIL 75 RPMI1640 X VIVO15 TIL TIL 10 AB 20 LAK 200u/ml IL 2 RPMI LAK 200u/ml IL 2 X VIVO15 RPMI ml, 75cm 2 5 CO TIL 3 5

23 1 TIL 50u/ml 1000u/ml IL 2 LAK 1000u/ml IL 2 2 TIL 70 3 feeder cell, EB B B EBV TIL TIL TIL T T NK T T 1 IL 2 PHA PBMC T T T 50GY PBMC RPMI1640 RPMI1640 1mmol/L 2mmol/L 100u/ml 100 g/ml 10 AB PHA A 10 4 u/ml hril 2 PBS 1 BSA 96 U 24 CO U ml RPMI u/ml IL 2 1µg/ml PHA A µl T 6

24 20u/ml IL 2 T 10 6 ml ml C ml 5ml CM 20u/ml IL µl C µl/ µl C µl/ µl C mlCM, 96 50µl/ 5 ; mlCM, 50µl/ µl T 100µl IL 2 20u/ml 2 T µl 50µl IL 2 20u/ml µl 50µl IL 2 20u/ml PHA A 1µg/ml µl µl/ T 2 3 IL 2 20u/ml IL 2 20u/ml PHA 1µg/ml T TCRV RT PCR TCR V 2 3 T PHA 4 T HLA NK 7

25 NK NK NK NK PHA 100µg/ml IL 2 ril u/ml 0 5ml/ 20 4 IL 2 1 RPMI FCS 0 5µg/ml PHA 200u/ml IL 2 10g/L 100u/ml 100µg/ml 1mmol/L 2 RPMI FCS 10g/L 100u/ml 100µg/ml 1mmol/L 3 NK RPMI FCS 10g/L 100u/ml 100µg/ml 1mmol/L 0 2u 100u/ml IL 2 4 RPMI FCS PBMC 96 CO2 1 NK 1 NK 2 NK 10 6 ml 2 NK 1 PBMC g 12min ml rad g 12min ml µl 60ml NK 7 NK µlNK CO NK µl ml NK 100µl 1 50ml 2 30ml 5000rad g 12min 4 NK ml µl NK 100µl 5 NK NK

26 NK 96 NK 96 3 NK 1 PCR PCR 16srRNA PCR 16sr RNA EB 16sr DNA 40umol/L ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3 pbr322 40umol/L CATCTCGGGCAGCGTTGGGT AGCGCAAGCGGAGTCAGTGAGC-3 10mmol/L Tris-HCL(pH8.3), 50mmol/L KCL, 2.5mmol/L Mgcl 2, 5g/L Tween20 5g/L TritonX-100 K proteinase K K 20 mg/ml 50% C DNA Taq 10X TAE A1 10mg/ml 6X 40% 0.125% 125mmol/L EDTA. DNA 50ng/ml pbr322 DNA DNA UV PCR 0.5ml 0.2ml 1) 9

27 ml 15min 2 100ul K 60ug/ml C 1h 95 0 C 10min 2) PCR 1 PCR 10X PCR 25mmol/L dntps 40umol/L 16sr DNA 40umol/L pbr322 DNA pbr322 DNA 1pg/ml DNA 5U/ml 5.0ml 0.4ul 1.0ul 2.0ul 2.0ul 0.2ul 35.4ul 45ul 2 1:10 1:100 3 eppendorf 45ul PCR 1:10 1:100 5ul 4 eppendorf 50ul DNA 5 DNA 95 0 C 10min 95 0 C 30S 58 0 C 1min 72 0 C 1min, C 10min 3 PCR 1 EB 0.1ug/ml 1% TAE 2 PCR 10ulPCR 2ul 10ul DNA 3 TAE 80V 60-90min 4 EB DNA DNA 1 1 DNA 10ngDNA C ul PCR 5ul 2 45ul PCR eppendorf 2ul pbr322 DNA 1pg/ml 3 PCR pbr DNA Taq 2 DNA DNA Hoechst diamidino-2-phenylindole DAPI DNA 10

28 CKI 1 IFO5003 JCRB0008 Vero ATCC CCL ml mycoplasma hyorhinis (ATCC 29052) M.orale(IFO 14477) MEM 10 FBS PBS mlPBS Hoechst Dye 5mg thimerosal 10mg 30min 1ml ml 100mlPBS g/ml Hoechst Dye 0 15 g/ml thomerosal 30min 60mm 10ml r/min, 10min 6 1ml 20 30min r/min 10min, CKI 1 Vero ml 4 1ml CO2 24h ml i 0.1ml ii 0.1ml iii iv 100cfu/0.1ml M.hyorhinis M.orale 4 CO2 6 3 CMF PBS 1ml 10min ml 30min, CKI 1 vero 3T6 ARCCCCL Hoechst DAPI 11

29 4, 80 5 M.hyorhinis M.orale 6 DNA DNA M.hyorhinis M.orale M.salivarium M.hominis M.fermentans 97 1cfu cfu/ml DNA RNA / BM-cyclin 25cm 2 CO /ml 25cm 2 10ml IC 50 5~ h C 5~10h 18h 41 0 C 50 0 C 4~6min 37 0 C 1~3 limulus amoebocyte lysate,lal LAL 12

30 LAL LAL 0.125EU ml ( ) CSE LAL 10mm, 75mm ( ) 0 1mol/L 0 1 mol/l l ml PH PH parafilm 1 LAL CSE LAL CSE , EU ml 0.25,0.125, EU/ml ( 0.1ml) 2 0.1mlCSE 0.1ml LAL CSE 5 GEP 10 m,m= e/f, e log f GEP CSE 2 ph NaOH HCL ph GEP GEP GEP A CSE (0 1ml LAL ) B LAL ( 0 1m1 ) C LAL (0 1m1) D CSE CSE 2 13

31 2 (0 1m1) 0 1m1 LAL 3 ( ) ( ) 4 B 1 CSE RSE CSE BSE 2 CSE min EU/ml CSE 2 1ml CSE 3EU CSE min min 4 LAL 5min LAL 5 3 log 2 3 log 3 log EU EU LAL 25030min LAL 60,30min min EU 10000EU 3 14

32 4 3 log 1. Immunological techniques made easy P24-34.P Rosenberg,S A. Lymphokine-activated killer cells: a new approach to the immunotherapy of cancer. JNCI 1985,75: Rosenberg,S A. a new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science : P

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23 29 15.6% 23 29 26.2% 3 25 2 15 1 5 1,542 12,336 14,53 16,165 18,934 22,698 25,125 25 2 15 1 5 5,557 7,48 8,877 11, 13,732 17,283 22,485 23 24 25 26 4, 197823 2916.3%29 335, 23 29.5% 23 29 16.3% 14 35 33,535 14 135 13 125 1,292 1,3 1,38 1,314 1,321 1,328 1,335 3 25 2 15 1 5 1. 1.1 13,582 15,988 1.4 18,322 11.6 11.9 21,192 24,953 3,67 9. 8.7 12 1 8

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