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1 HJ 中 华 人 民 共 和 国 环 境 保 护 行 业 标 准 HJ/T 2 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 导 则 The Guild of Safety-Assessment of Microbial Community Used in the Environment ( 征 求 意 见 稿 ) 20 发 布 20 实 施 国 家 环 境 保 护 总 局 发 布

2 目 次 前 言...Ⅱ 1 适 用 范 围 规 范 性 引 用 文 件 术 语 和 定 义 微 生 物 菌 剂 基 因 改 造 实 验 室 研 究 构 筑 物 开 放 环 境 应 用 总 则 评 价 目 的 评 价 原 则 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 主 要 内 容 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 程 序 评 价 内 容 微 生 物 菌 剂 评 价 生 态 安 全 评 价 使 用 环 境 信 息 评 价 其 他 信 息 报 告 编 制 报 告 主 要 内 容 评 价 结 论 的 编 写 编 写 要 求 编 写 内 容 检 测 内 容 及 要 求 检 测 实 验 室 检 测 方 法 必 备 资 料 检 测 报 告...13 附 录 A...15 附 录 B...21 附 录 C...24 附 录 D...28 I

3 前 言 为 贯 彻 中 华 人 民 共 和 国 环 境 保 护 法, 保 障 人 体 健 康, 保 护 生 态 环 境, 促 进 环 保 用 和 可 能 造 成 环 境 危 害 微 生 物 菌 剂 的 安 全 应 用, 规 范 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 工 作, 制 定 本 标 准 本 标 准 是 根 据 国 家 及 地 方 有 关 环 境 保 护 的 法 规 和 标 准, 以 及 微 生 物 菌 剂 环 境 应 用 和 环 境 生 态 学 特 点 制 定 的, 是 作 为 微 生 物 菌 剂 环 境 安 全 评 价 机 构 进 行 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 时 使 用 的 技 术 规 范 本 标 准 规 定 了 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 工 作 的 内 容 和 范 围 评 价 所 引 用 和 依 据 的 相 关 标 准 和 方 法 以 及 评 价 所 涉 及 的 检 测 方 法 等 本 标 准 为 首 次 发 布 本 标 准 为 指 导 性 标 准 本 标 准 由 国 家 环 境 保 护 总 局 科 技 标 准 司 提 出 本 标 准 起 草 单 位 : 上 海 市 环 境 监 测 中 心 本 标 准 国 家 环 境 保 护 总 局 20 年 月 日 批 准 本 标 准 自 20 年 月 日 起 实 施 本 标 准 由 国 家 环 境 保 护 总 局 解 释 II

4 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 导 则 1 适 用 范 围 本 标 准 适 用 于 以 生 态 环 境 保 护 和 污 染 防 治 为 目 的 而 使 用 的 微 生 物 菌 剂 不 适 用 基 因 改 造 的 微 生 物 菌 剂 以 及 实 验 室 研 究 使 用 的 微 生 物 菌 剂 本 标 准 作 为 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 性 测 试 评 价 报 告 书 编 制 与 审 核 的 技 术 依 据 2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 所 含 的 条 款 通 过 本 规 范 的 引 用 即 构 成 本 规 范 的 条 文, 与 本 标 准 同 效 下 列 文 件 出 版 修 订 版 时, 使 用 本 标 准 的 各 方 应 使 用 下 列 标 准 及 文 件 的 最 新 版 本 凡 是 不 注 明 日 期 的 引 用 文 件, 其 最 新 版 本 适 用 于 本 标 准 GB/T 7919 GB/T 7918 GB/T 4789 化 妆 品 安 全 性 评 价 程 序 和 方 法 化 妆 品 微 生 物 标 准 检 验 方 法 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 GB/T 食 品 安 全 性 毒 理 学 评 价 程 序 和 方 法 GB/T 水 质 物 质 对 淡 水 鱼 ( 斑 马 鱼 ) 急 性 毒 性 测 定 方 法 GB/T 水 质 急 性 毒 性 的 测 定 发 光 细 菌 法 3 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准 3.1 微 生 物 菌 剂 微 生 物 菌 剂 由 一 种 或 多 种 通 过 自 然 选 育 从 自 然 界 经 分 离 纯 化 所 获 得 微 生 物 菌 种 ( 株 ) 所 组 成, 应 用 于 生 态 环 境 保 护 和 污 染 防 治 为 目 的 的 微 生 物 菌 剂 1

5 3.2 基 因 改 造 基 因 改 造 是 指 经 现 代 生 物 技 术 ( 如 : 细 胞 融 合 DNA 重 组 等 ) 改 造, 改 变 了 原 有 生 物 遗 传 结 构 与 功 能 的 微 生 物 菌 种 3.3 实 验 室 研 究 实 验 室 研 究 指 在 控 制 系 统 内 的 实 验 室 规 模 的 微 生 物 研 究 3.4 构 筑 物 构 筑 物 指 在 以 生 态 环 境 保 护 和 污 染 防 治 为 目 的 使 用 微 生 物 菌 剂 时, 限 制 微 生 物 菌 剂 或 其 影 响 作 用 于 人 类 健 康 和 环 境 安 全 的 物 理 屏 障 或 物 理 化 学 生 物 学 综 合 屏 障 3.5 开 放 环 境 应 用 开 放 环 境 应 用 指 实 验 室 研 究 构 筑 物 内 应 用 以 外 的 应 用 4 总 则 4.1 评 价 目 的 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 的 目 的 是 分 析 和 预 测 以 生 态 环 境 保 护 和 污 染 防 治 为 目 的 的 微 生 物 菌 剂 及 其 使 用 过 程 中 所 存 在 的 可 能 对 环 境 及 人 畜 健 康 具 有 的 潜 在 危 险 有 害 因 素, 并 提 出 合 理 可 行 的 防 范 应 急 与 减 缓 措 施 4.2 评 价 原 则 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 必 须 遵 循 对 应 性 原 则, 即 内 容 和 要 求 必 须 与 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 管 理 中 相 关 的 内 容 相 对 应, 如 管 理 目 的 适 用 范 围 评 价 以 及 检 测 机 构 的 资 质 要 求 以 及 对 菌 剂 提 供 以 及 使 用 单 位 的 安 全 要 求 等 应 该 包 括 了 菌 剂 产 品 的 特 性 以 及 对 生 态 环 境 和 健 康 安 全 可 能 的 风 险 识 别 2

6 目 前 国 内 外 应 用 情 况 使 用 环 境 的 要 求 及 其 评 价 运 用 过 程 中 的 监 测 控 制 废 物 处 理 和 紧 急 反 应 计 划, 尽 可 能 使 微 生 物 菌 剂 的 使 用 环 境 安 全 评 价 覆 盖 使 用 过 程 的 各 个 环 节, 力 求 评 价 工 作 的 全 面 性 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 必 须 遵 循 前 瞻 性 原 则 要 根 据 微 生 物 的 特 性 应 用 类 型 现 有 的 检 测 水 平 和 控 制 水 平, 就 微 生 物 菌 剂 及 其 使 用 过 程 中 可 能 产 生 的 对 生 态 环 境 以 及 人 畜 健 康 潜 在 影 响 作 出 相 应 的 风 险 评 估, 并 对 此 过 程 中 的 不 确 定 性 进 行 描 述 和 分 析, 以 利 在 有 新 的 数 据 时 进 行 补 充 评 价 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 必 须 遵 循 可 操 作 性 原 则, 要 求 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 工 作 所 涉 及 的 检 测 技 术 方 法 和 标 准, 均 为 现 行 有 效 的 检 测 技 术 方 法 和 标 准, 如 国 标 方 法 (GB) 国 际 公 认 的 标 准 方 法 (ISO OECD AWWA EPA) 等 4.3 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 主 要 内 容 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 应 把 以 下 几 个 方 面 作 为 使 用 环 境 安 全 评 价 工 作 重 点 微 生 物 菌 剂 所 含 各 菌 种 的 致 病 性 微 生 物 菌 种 对 抗 生 素 的 抵 抗 力 以 及 应 用 这 些 抗 生 素 对 人 畜 健 康 进 行 预 防 和 治 疗 的 可 能 性 微 生 物 菌 剂 及 其 使 用 过 程 中 各 类 代 谢 产 物 衍 生 物 对 生 态 环 境 及 人 畜 健 康 可 能 产 生 的 毒 性 ( 包 括 潜 在 毒 性 ) 影 响 微 生 物 菌 剂 使 用 各 环 节 中 可 能 出 现 的 影 响 生 态 环 境 及 人 畜 健 康 的 问 题, 及 其 相 应 合 理 可 行 的 防 范 应 急 与 减 缓 措 施 4.4 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 程 序 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 评 价 的 程 序 主 要 包 括 : 菌 剂 及 使 用 环 境 的 风 险 识 别 确 定 评 价 内 容 和 重 点 选 择 及 制 定 评 价 技 术 路 线 专 项 检 测 和 调 研 使 用 环 境 安 全 性 评 价 提 出 相 关 应 急 措 施 安 全 性 评 价 报 告 编 写 等 见 下 图 所 示 3

7 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 风 险 识 别 评 价 内 容 和 重 点 确 定 评 价 技 术 路 线 制 定 专 项 检 测 与 调 研 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 性 评 价 应 急 措 施 提 出 安 全 性 评 价 报 告 编 写 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 风 险 识 别 分 析 和 预 测 微 生 物 菌 剂 及 其 使 用 过 程 中 各 类 代 谢 产 物 衍 生 物 对 人 畜 健 康 及 生 态 环 境 可 能 产 生 的 致 病 性 和 毒 性 影 响 评 价 内 容 和 重 点 确 定 根 据 风 险 识 别 结 果, 确 定 微 生 物 菌 剂 环 境 安 全 性 评 价 的 内 容 和 重 点 评 价 技 术 路 线 制 定 根 据 安 全 性 评 价 的 内 容 和 重 点, 选 择 和 确 定 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 性 评 价 的 策 略 依 据 和 技 术 路 线 专 项 检 测 和 调 研 委 托 评 价 单 位 以 外 的 具 有 相 关 资 质 的 单 位 和 ( 或 ) 实 验 室 进 行 致 病 性 和 生 态 毒 性 影 响 检 测, 并 对 微 生 物 菌 剂 在 申 报 领 域 使 用 过 程 中 的 各 类 信 息 进 行 调 查 分 析 和 研 究 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 性 评 价 在 上 述 工 作 的 基 础 上 和 申 报 使 用 领 域 内, 进 行 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 性 评 价 应 急 工 作 预 案 提 出 4

8 根 据 微 生 物 菌 剂 的 特 性 以 及 使 用 各 环 节 中 可 能 出 现 的 影 响 生 态 环 境 及 人 畜 健 康 的 问 题, 提 出 相 应 合 理 可 行 的 防 范 应 急 与 减 缓 措 施 评 价 报 告 编 写 在 整 理 分 析 和 研 究 各 类 数 据 和 信 息 的 基 础 上, 编 写 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 性 评 价 报 告 5 评 价 内 容 5.1 微 生 物 菌 剂 评 价 掌 握 微 生 物 菌 剂 各 菌 种 ( 株 ) 的 组 成 来 源 地 理 分 布 及 自 然 习 性 等, 确 认 各 菌 种 ( 株 ) 的 鉴 定 和 检 测 技 术, 对 各 菌 种 ( 株 ) 病 理 学 生 态 学 和 生 理 学 性 状 进 行 相 关 检 测 和 评 价, 同 时 对 微 生 物 菌 剂 的 毒 性 和 代 谢 产 物 进 行 检 测 和 评 价 菌 剂 名 称 明 确 所 评 价 微 生 物 菌 剂 的 商 品 名 称, 确 定 评 价 的 主 体 和 对 象 菌 剂 组 成 明 确 构 成 微 生 物 菌 剂 的 各 菌 种 组 成 菌 种 来 源 及 分 类 描 述 构 成 微 生 物 菌 剂 的 各 种 菌 种 的 来 源 及 其 分 类 特 征 鉴 定 和 检 测 技 术 的 描 述 为 了 便 于 今 后 的 监 督 管 理, 需 要 详 细 阐 述 菌 剂 各 菌 种 的 鉴 定 检 测 技 术 以 及 手 段 鉴 定 和 检 测 技 术 的 敏 感 性 可 信 度 ( 在 定 量 方 面 ) 和 特 异 性 根 据 微 生 物 分 类 特 点, 提 高 监 督 管 理 时 鉴 定 和 检 测 准 确 性, 需 要 加 强 对 各 菌 种 ( 株 ) 敏 感 性 和 特 异 性 的 技 术 描 述 与 此 同 时, 应 选 择 性 地 对 鉴 定 和 检 测 技 术 进 行 必 要 的 确 认 和 评 价 生 物 的 地 理 分 布 及 自 然 习 性 的 描 述 详 细 描 述 构 成 微 生 物 菌 剂 的 各 菌 种 的 地 理 分 布 及 自 然 习 性 通 过 传 代 试 验 和 分 子 生 物 学 技 术 试 验, 证 实 微 生 物 菌 种 的 基 因 稳 定 性 及 其 可 能 的 影 响 因 素 即 构 成 微 生 物 菌 剂 的 各 种 菌 种 遗 传 稳 定 性 的 检 测 及 其 评 价 结 果 病 理 学 生 态 学 和 生 理 学 性 状 : 微 生 物 危 害 分 类 如 微 生 物 菌 剂 中 含 有 病 原 微 生 物, 则 根 据 国 务 院 卫 生 主 管 部 门 制 定 和 公 布 的 法 定 传 染 病 名 录, 确 定 该 病 原 微 生 物 危 害 分 类 等 级 如 名 5

9 录 中 未 见 列 入, 则 通 过 组 织 相 关 专 家 进 行 界 定 在 生 态 系 统 中, 不 同 环 境 条 件 下 被 检 微 生 物 的 繁 殖 信 息 ; 关 于 在 生 态 系 统 中 的 生 存 信 息, 包 括 季 节 性 及 形 成 可 存 活 结 构 ; 致 病 性 产 毒 性 致 敏 性 病 原 体 携 带 者 ( 载 体 ), 可 能 的 载 体, 宿 主 范 围 ( 包 括 非 靶 生 物 ), 潜 伏 病 毒 ( 前 病 毒 ) 激 活 的 可 能, 定 居 在 其 他 生 物 体 内 的 能 力 通 过 动 物 的 急 性 毒 性 试 验 菌 剂 代 谢 产 物 的 致 突 变 试 验 菌 剂 代 谢 产 物 有 无 有 毒 有 害 微 量 有 机 物 和 毒 素 的 检 测 以 及 相 关 资 料 文 献 的 检 索 查 询 等 方 法 和 手 段, 来 明 确 微 生 物 菌 剂 对 生 态 环 境 及 人 畜 健 康 可 能 产 生 的 影 响 抗 药 性 通 过 对 微 生 物 菌 剂 进 行 抗 生 素 的 抗 药 性 试 验, 了 解 各 组 成 菌 种 对 抗 生 素 的 抵 抗 力, 以 及 应 用 这 些 抗 生 素 对 人 畜 健 康 和 生 态 环 境 安 全 进 行 预 防 和 治 疗 的 可 能 对 微 生 物 菌 剂 进 行 抗 药 性 试 验 应 选 用 国 内 常 用 的 抗 生 素 作 充 分 的 检 测 微 生 物 菌 剂 产 品 有 无 常 见 病 原 微 生 物 检 测 为 了 避 免 微 生 物 菌 剂 产 品 在 生 产 过 程 中 受 到 病 原 微 生 物 污 染, 并 通 过 使 用 过 程 中 的 细 菌 增 殖 富 集 而 产 生 对 环 境 和 人 类 健 康 的 影 响, 需 进 行 微 生 物 菌 剂 产 品 中 有 无 常 见 病 原 微 生 物 如 : 志 贺 氏 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 沙 门 氏 菌 等 多 种 常 见 病 原 微 生 物 的 检 测 5.2 生 态 安 全 评 价 针 对 微 生 物 菌 剂 在 以 生 态 环 境 保 护 和 污 染 防 治 为 目 的 应 用 后 产 生 的 各 类 终 产 物 可 能 对 生 态 环 境 产 生 毒 性 和 生 物 学 影 响, 对 各 类 产 物 需 进 行 生 态 毒 性 的 检 测 和 评 价 生 态 毒 性 评 价 根 据 微 生 物 菌 剂 的 使 用 环 境 以 及 终 产 物 的 最 终 排 放 趋 向, 可 有 所 侧 重 地 选 择 以 下 几 个 方 面 的 内 容 对 终 产 物 进 行 检 测, 对 终 产 物 可 能 对 生 态 环 境 局 部 或 全 面 的 影 响 作 出 评 价 (1) 微 生 物 毒 性 试 验 ; (2) 藻 类 毒 性 试 验 ; (3) 微 型 动 物 毒 性 试 验 ; 6

10 (4) 鱼 类 毒 性 试 验 ; (5) 哺 乳 动 物 毒 性 试 验 ; (6) 致 突 变 试 验 如 终 产 物 排 放 在 某 些 特 定 或 敏 感 区 域 ( 如 水 源 保 护 区 等 ), 则 需 增 加 该 区 域 生 态 系 统 内 的 特 定 生 物 类 群 的 群 落 水 平 毒 性 或 效 应 研 究 监 测 方 法 见 表 1 表 1 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 生 态 毒 性 测 试 方 法 序 号 项 目 监 测 方 法 方 法 来 源 1 微 生 物 毒 性 试 验 发 光 菌 急 性 毒 性 测 定 GB/T 藻 类 毒 性 试 验 藻 类 生 长 抑 制 测 试 见 附 录 A 3 微 型 动 物 毒 性 试 验 溞 类 急 性 毒 性 试 验 见 附 录 B 4 鱼 类 毒 性 试 验 鱼 类 急 性 毒 性 试 验 GB/T13267 见 附 录 C 5 哺 乳 动 物 毒 性 试 验 小 鼠 经 口 急 性 毒 性 试 验 GB/T 7919 GB/T 致 突 变 试 验 动 物 骨 髓 细 胞 微 核 试 验 GB/T 7919 Ames 试 验 见 附 录 D 微 生 物 评 价 考 虑 到 微 生 物 菌 剂 本 身 含 有 病 原 微 生 物, 以 及 对 应 用 对 象 中 卫 生 学 微 生 物 指 标 产 生 影 响, 须 对 终 产 物 进 行 病 原 微 生 物 以 及 卫 生 学 微 生 物 指 示 菌 的 检 测 对 终 产 物 中 的 卫 生 学 微 生 物 指 示 菌 进 行 检 测 及 评 价 如 投 放 的 微 生 物 菌 剂 中 含 有 病 原 微 生 物, 则 须 对 终 产 物 检 测 该 病 原 微 生 物 在 单 位 容 积 中 的 数 量 浓 度 及 致 病 性 强 弱 等 针 对 终 产 物 进 入 环 境 后, 就 是 否 诱 变 产 生 新 的 有 害 生 物 以 及 是 否 会 增 强 原 有 生 物 的 危 害 性 做 出 预 测 和 评 价 5.3 使 用 环 境 信 息 评 价 微 生 物 菌 剂 在 以 生 态 环 境 保 护 和 污 染 防 治 为 目 的 的 使 用 过 程 中, 使 用 环 境 的 状 态 以 及 使 用 过 程 的 管 理 等 就 微 生 物 菌 剂 可 能 对 人 畜 健 康 和 生 态 环 境 安 全 产 生 7

11 的 影 响 起 着 相 当 的 作 用 因 此, 须 对 微 生 物 菌 剂 在 构 筑 物 内 使 用 以 及 在 开 放 环 境 使 用 等 的 各 类 信 息 作 出 相 关 的 评 价 构 筑 物 内 使 用 信 息 构 筑 物 的 一 般 描 述 ( 材 质 形 状 结 构 体 积 等 ) 构 筑 物 的 安 放 地 点 及 其 周 围 环 境 的 描 述, 特 别 是 周 围 可 能 存 在 的 敏 感 区 域 的 描 述 微 生 物 菌 剂 使 用 和 处 置 的 相 关 操 作 程 序 明 确 所 有 微 生 物 菌 剂 的 进 料 点 和 可 能 的 释 放 点 构 筑 物 的 安 全 隔 离 措 施 和 效 果 微 生 物 菌 剂 容 器 搬 运 保 存 处 置 程 序 操 作 人 员 的 工 作 活 动 状 况 和 安 全 防 护 措 施 操 作 ( 工 作 ) 人 员 的 培 训 计 划 以 及 实 施 记 录 等 废 弃 物 ( 包 括 终 产 物 ) 的 处 置 计 划 实 施 记 录 等 微 生 物 菌 剂 使 用 过 程 中 泄 露 的 应 急 措 施, 事 故 应 急 计 划 开 放 环 境 使 用 信 息 使 用 的 目 的 和 方 式 开 放 环 境 使 用 的 描 述, 包 括 目 的 过 程 以 及 可 预 见 产 物 等 日 期 及 使 用 的 计 划 时 间, 包 括 频 率 持 续 时 间 等 使 用 方 法 及 程 序 的 描 述 使 用 投 放 的 数 量 浓 度 等 参 数 使 用 地 开 放 环 境 中 对 其 他 非 使 用 目 的 的 各 类 活 动 的 干 扰 使 用 及 其 各 个 环 节 中 工 作 人 员 的 防 护 措 施 使 用 后 使 用 地 点 的 处 理 处 置 计 划 方 案 在 使 用 结 束 后 拟 采 取 的 消 除 或 灭 活 的 方 法 以 前 类 似 使 用 的 信 息 及 结 果, 尤 其 是 在 不 同 尺 度 和 不 同 生 态 系 统 中 的 使 用 信 息 现 场 环 境 和 背 景 8

12 使 用 地 的 地 理 位 置 ( 必 要 时, 加 GPS 定 位 ) 及 标 记 描 述 使 用 现 场 与 人 类 和 其 他 重 要 生 物 群 在 物 理 学 和 生 物 学 上 的 接 近 度 使 用 现 场 与 周 边 重 要 生 境 保 护 区 域 以 及 环 境 敏 感 区 空 间 的 距 离, 生 态 类 型 的 接 近 度 使 用 地 附 近 的 人 口 密 度 及 其 分 布 等 使 用 地 周 围 以 使 用 自 然 资 源 为 基 础 的 居 民 的 经 济 活 动 使 用 现 场 以 及 可 能 受 到 影 响 的 地 区 的 气 候 特 点 使 用 地 地 理 学 地 质 学 及 土 壤 学 方 面 的 特 点 使 用 地 周 边 植 物 区 系 和 动 物 区 系, 包 括 作 物 家 畜 和 迁 徙 物 种 对 可 能 受 影 响 的 目 标 生 态 系 统 及 非 目 标 生 态 系 统 的 描 述 将 接 受 微 生 物 菌 剂 的 自 然 生 境 与 建 议 释 放 地 点 进 行 的 比 较 微 生 物 菌 剂 的 使 用 及 其 释 放 可 能 会 对 环 境 影 响 的 区 域 发 展 计 划 开 放 环 境 使 用 时 与 环 境 的 相 互 作 用 所 使 用 微 生 物 菌 剂 所 含 菌 种 存 活 传 播 或 作 用 的 环 境 条 件 描 述 微 生 物 菌 剂 所 含 菌 种 进 入 环 境 后 发 生 遗 传 变 异 的 能 力 微 生 物 菌 剂 所 含 菌 种 进 入 环 境 后 其 有 害 性 是 否 会 产 生 影 响 ( 宿 主 范 围 致 病 性 传 染 性 毒 性 过 敏 性 等 影 响 ) 微 生 物 菌 剂 所 含 菌 种 在 环 境 中 的 生 活 史 微 生 物 菌 剂 对 使 用 地 土 著 生 物 群 落 结 构 的 可 能 破 坏 或 改 变 情 况 微 生 物 菌 剂 所 含 菌 种 及 其 代 谢 产 物 进 入 环 境 后 是 否 会 产 生 新 的 有 害 生 物 微 生 物 菌 剂 所 含 菌 种 及 其 代 谢 产 物 进 入 环 境 后 是 否 会 增 强 原 有 有 害 生 物 的 危 害 性 在 生 物 地 球 化 学 循 环 或 生 物 循 环 过 程 中 可 能 出 现 的 复 杂 情 况 5.4 其 他 信 息 为 了 全 面 了 解 微 生 物 菌 剂, 体 现 评 价 工 作 的 完 整 性, 以 及 后 续 管 理 的 需 要, 在 展 开 上 述 评 价 工 作 的 同 时, 应 对 微 生 物 菌 剂 在 以 生 态 环 境 保 护 和 污 染 防 治 为 目 的 使 用 时 的 一 些 其 他 信 息 作 出 评 价, 如 控 制 废 物 处 理 和 紧 急 反 应 计 划, 产 品 信 9

13 息 等 监 测 控 制 废 物 处 理 和 紧 急 反 应 计 划 监 测 技 术 微 生 物 菌 剂 所 含 各 种 菌 种 详 细 的 分 类 鉴 定 技 术 资 料 阐 述, 以 及 跟 踪 和 监 测 其 影 响 的 检 测 手 段 方 法 对 所 阐 述 的 微 生 物 菌 种 分 类 鉴 定 技 术 以 及 跟 踪 监 测 方 法, 进 行 监 测 技 术 的 特 异 性 敏 感 性 和 可 靠 性 分 析 针 对 微 生 物 菌 剂 及 其 使 用 特 点, 提 出 检 测 的 持 续 性 频 度 等 建 议 释 放 的 控 制 为 避 免 和 / 或 减 少 微 生 物 在 释 放 地 点 或 指 定 使 用 地 点 以 外 的 区 域 内 扩 散, 建 议 或 需 要 所 采 用 的 方 法 和 程 序 等 保 护 释 放 地 点 不 受 未 授 权 个 人 侵 入 的 方 法 和 程 序 废 弃 物 处 理 明 确 微 生 物 菌 剂 使 用 过 程 中 以 及 使 用 后 所 产 生 废 物 的 类 型, 如 废 水 废 气 以 及 固 体 废 弃 物 等 根 据 处 理 能 力, 推 算 出 废 弃 物 的 预 期 数 量 各 类 型 废 弃 物 可 能 存 在 的 环 境 以 及 健 康 风 险 各 类 废 弃 物 处 理 方 法 的 描 述, 以 及 处 理 计 划 等 应 急 预 案 在 发 生 意 外 时, 控 制 微 生 物 及 其 影 响 扩 散 的 预 案 方 法 手 段 以 及 程 序 等 各 类 信 息 受 污 染 地 区 的 清 理 和 处 置 方 法 及 计 划, 例 如 : 消 除 等 在 扩 散 过 程 中 或 扩 散 后 暴 露 的 植 物 动 物 土 壤 等 生 态 环 境 因 子 的 处 理 及 净 化 技 术 描 述 确 定 和 隔 离 受 扩 散 影 响 的 区 域 的 方 法 在 发 生 不 良 影 响 时 保 护 人 类 健 康 和 环 境 的 计 划 等 10

14 5.4.2 产 品 其 他 信 息 微 生 物 菌 剂 产 品 的 名 称 制 造 商 或 经 销 商 的 姓 名 地 址 等 联 系 方 式 微 生 物 菌 剂 产 品 的 规 格, 以 及 使 用 的 确 切 条 件 描 述 等 微 生 物 菌 剂 产 品 预 期 使 用 的 领 域 和 对 象 一 旦 发 生 微 生 物 意 外 释 放 或 错 误 使 用 拟 采 取 的 应 急 措 施 等 微 生 物 菌 剂 产 品 保 存 及 处 理 的 方 法 微 生 物 菌 剂 产 品 估 计 产 量 为 防 止 在 储 藏 过 程 中 或 后 期 包 装 内 生 物 的 意 外 释 放, 建 议 使 用 的 微 生 物 菌 剂 产 品 包 装 和 运 输 方 式 等 使 用 的 标 签 产 品 在 其 他 国 家 和 地 区 的 使 用 状 况 国 外 情 况 微 生 物 菌 剂 产 品 在 国 外 所 获 得 的 使 用 许 可 证 以 及 其 他 正 式 使 用 许 可 证 明 材 料 在 国 外 微 生 物 菌 剂 产 品 使 用 的 数 量 规 模, 以 及 相 关 生 物 安 全 信 息 微 生 物 菌 剂 产 品 在 国 外 使 用 中 的 应 用 单 位, 含 明 确 的 通 讯 地 址 国 内 情 况 微 生 物 菌 剂 产 品 在 国 内 其 他 地 区 或 部 门 所 获 得 的 使 用 许 可 证 以 及 其 他 正 式 使 用 许 可 证 明 材 料 在 国 内 其 他 地 区 微 生 物 菌 剂 产 品 使 用 的 数 量 规 模, 以 及 相 关 生 物 安 全 信 息 微 生 物 菌 剂 产 品 在 国 内 其 他 地 区 使 用 中 的 应 用 单 位, 含 明 确 的 通 讯 地 址 11

15 6 报 告 编 制 为 统 一 和 规 范 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 性 评 价 报 告 的 编 制, 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 性 评 价 报 告 须 体 现 微 生 物 菌 剂 评 价, 微 生 物 菌 剂 及 其 使 用 过 程 的 环 境 风 险 识 别, 评 价 的 内 容 和 重 点, 评 价 的 策 略 依 据 和 技 术 路 线, 环 境 生 态 安 全 性 评 价, 应 急 措 施, 以 及 评 价 结 论 和 需 要 补 充 说 明 的 问 题 等 6.1 报 告 主 要 内 容 微 生 物 菌 剂 的 评 价 主 要 包 括 : 微 生 物 菌 剂 产 品 的 各 菌 种 ( 株 ) 来 源 及 其 构 成 生 物 学 性 状 技 术 及 其 使 用 特 点 应 用 类 型 和 使 用 范 围, 以 及 对 人 畜 健 康 的 影 响 等 微 生 物 菌 剂 及 其 使 用 过 程 的 环 境 风 险 识 别 根 据 微 生 物 菌 剂 的 菌 种 特 点 应 用 类 型 和 使 用 范 围, 来 界 定 微 生 物 菌 剂 及 其 使 用 过 程 中 可 能 出 现 的 环 境 与 人 类 健 康 的 风 险 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 性 评 价 的 内 容 和 重 点 根 据 风 险 识 别 结 果 以 及 相 关 的 管 理 要 求, 确 定 使 用 环 境 安 全 性 评 价 的 内 容 和 重 点 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 性 评 价 的 策 略 依 据 和 技 术 路 线 主 要 包 括 满 足 各 环 节 安 全 性 评 价 要 求 的 前 提 下, 确 定 与 此 相 关 的 检 验 检 测 方 法 和 技 术 使 用 环 境 生 态 安 全 性 评 价 根 据 获 得 的 各 环 节 的 信 息, 以 及 检 验 检 测 结 果, 依 据 相 关 的 规 范 标 准, 对 微 生 物 菌 剂 在 应 用 领 域 内 的 使 用 环 境 生 态 安 全 性 作 出 评 价 应 急 措 施 针 对 微 生 物 菌 剂 的 特 性 以 及 使 用 各 环 节 中 可 能 出 现 的 影 响 生 态 环 境 安 全 和 人 畜 健 康 的 问 题, 提 出 相 应 合 理 可 行 的 防 范 应 急 与 减 缓 措 施 6.2 评 价 结 论 的 编 写 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 性 评 价 结 论 是 对 申 报 微 生 物 菌 剂 的 全 部 评 价 工 作 的 总 结 编 写 时 应 在 概 括 和 总 结 全 部 评 价 工 作 的 基 础 上, 扼 要 阐 明 申 报 微 生 物 菌 剂 的 生 物 属 性 健 康 危 害 特 性 和 生 态 环 境 危 害 特 性, 使 用 范 围 以 及 相 关 建 议 及 防 护 措 施 12

16 6.2.1 编 写 要 求 要 求 文 字 简 洁 准 确, 分 条 叙 述, 以 便 阅 读 编 写 内 容 (1) 评 价 的 依 据 ; (2) 评 价 的 方 法 ; (3) 评 价 的 结 论 ; (4) 需 要 补 充 说 明 的 问 题 7 检 测 内 容 及 要 求 7.1 检 测 实 验 室 从 事 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 性 检 测 的 机 构, 应 通 过 相 关 项 目 计 量 认 证 或 者 国 家 实 验 室 认 可 的 专 业 机 构 ; 拥 有 部 级 以 上 同 类 资 质 认 定 的 单 位 或 机 构, 如 部 级 重 点 实 验 室 等 7.2 检 测 方 法 当 几 种 等 效 方 法 同 时 存 在 时, 检 测 机 构 应 根 据 自 身 条 件 受 试 物 等 实 际 情 况, 选 择 其 中 相 应 的 方 法 进 行 检 测 7.3 必 备 资 料 微 生 物 菌 剂 使 用 环 境 安 全 性 检 测 前 须 知 晓 的 微 生 物 菌 剂 相 关 特 性 及 数 据, 如 研 发 及 试 用 过 程 获 得 的 相 关 数 据 信 息 评 价 机 构 对 检 测 内 容 和 项 目 的 要 求 等 7.4 检 测 报 告 检 测 报 告 应 包 括 : 13

17 7.4.1 试 验 基 本 信 息 ; 检 测 机 构 名 称 及 一 般 信 息 ; 试 验 的 准 确 起 止 日 期 ; 微 生 物 菌 剂 名 称 ; 检 测 方 法 及 标 准 ; 试 验 条 件 剂 量 或 浓 度 等 ; 检 测 结 果 以 及 评 价 结 论 ; 检 测 机 构 加 盖 印 章 ( 封 面 和 骑 缝 ) 14

18 附 录 A ( 规 范 性 文 件 ) 藻 类 生 长 抑 制 试 验 藻 类 是 水 体 中 的 初 级 生 产 者, 也 是 水 生 食 物 链 的 基 础 环 节 在 光 合 作 用 下 它 们 吸 收 水 中 的 无 机 营 养 盐 和 二 氧 化 碳, 制 造 有 机 物 它 们 的 存 在 无 论 是 水 体 生 产 能 力 还 是 水 体 污 染 的 自 净 作 用 均 具 有 十 分 重 要 的 意 义 因 此, 在 研 究 读 物 或 废 水 对 水 环 境 的 影 响 时, 都 把 藻 类 测 试 作 为 一 种 重 要 内 容 藻 类 生 长 抑 制 试 验 的 目 的 是 确 定 受 试 物 对 单 细 胞 藻 类 生 长 的 影 响, 可 用 于 受 试 物 对 藻 类 短 期 暴 露 效 应 的 初 评 当 暴 露 使 藻 类 的 生 长 率 低 于 未 经 暴 露 的 对 照 组 时, 称 为 藻 类 生 长 抑 制 单 细 胞 藻 类 个 体 小, 世 代 时 间 以 小 时 计 算, 采 用 本 方 法 可 以 在 较 短 时 间 内 得 到 受 试 物 ( 化 学 品 或 环 境 样 品 ) 对 藻 类 许 多 世 代 及 在 种 群 水 平 上 的 影 响 所 得 结 果 可 反 映 受 试 物 对 水 体 中 初 级 生 产 营 养 级 影 响 将 不 同 浓 度 的 受 试 物 加 到 处 于 对 数 生 长 期 的 藻 类 培 养 物 中, 在 规 定 的 条 件 下 进 行 培 养, 每 隔 24h 测 定 藻 类 种 群 浓 度 或 生 物 量 ( 重 量 ) 试 验 时 间 不 少 于 96h 与 对 照 相 比 较 可 确 定 生 长 抑 制 情 况 1. 受 试 化 学 品 的 必 备 资 料 水 溶 解 度 蒸 汽 压 结 构 式 纯 度 水 溶 液 中 的 定 量 分 析 方 法 在 水 中 和 光 中 的 化 学 稳 定 性 正 辛 醇 / 水 的 分 配 系 数 快 速 生 物 降 解 实 验 结 果 2. 仪 器 设 备 1 一 般 的 藻 类 试 验 室 设 备 2 试 验 容 器 : 如 三 角 瓶 等, 根 据 需 要 可 选 择 一 定 容 量 的 试 验 容 器, 同 一 批 试 验 的 容 器 应 规 格 一 致 为 保 证 CO2 的 交 换, 要 有 一 定 的 表 面 积 比 125ml 的 三 角 瓶 中 测 试 液 体 积 应 为 40-60ml,250ml 三 角 瓶 中 为 ml,500ml 三 角 瓶 中 为 ml 3 照 度 计 : 球 面 照 度 计 和 普 通 照 度 计 4 培 养 设 备 : 建 议 使 用 温 度 范 围 为 ±2 且 连 续 均 匀 光 照, 光 谱 范 围 为 nm, 光 通 量 为 光 子 /(m2 s) 的 培 养 箱 ( 用 球 面 测 量 计 测 定 可 产 生 光 强 为 8000lux 的 光 ), 光 照 周 期, 即 光 暗 比 为 12:12 或 14:10 5 机 械 振 荡 器 100±10 次 /min 或 定 时 人 工 摇 动 若 干 次 6 培 养 容 器 应 用 棉 塞 海 绵 塞 滤 纸 纱 布 (2-3 层 ) 锡 箔 纸 封 闭 挥 发 性 化 学 品 试 验 中, 应 采 用 磨 口 玻 璃 塞 完 全 密 闭 7 检 测 细 胞 浓 度 的 设 备, 如 电 子 颗 粒 计 数 仪 荧 光 计 分 光 光 度 仪 比 色 计 显 微 镜 8 在 使 用 分 光 光 度 仪 测 定 细 胞 浓 度 时, 为 了 有 效 测 定, 必 须 使 用 至 少 4cm 的 吸 收 池 作 一 曲 线 3. 受 试 生 物 建 议 使 用 生 长 快 速 的 绿 藻 品 种, 以 便 于 培 养 和 试 验, 如 : 羊 角 芽 藻 (Selenastrum capricormutum) 斜 生 栅 藻 (Scenedesmus obliquus) 普 通 小 球 藻 (Chlorella Vulgaris) 若 使 用 其 他 藻 类, 应 标 出 拉 丁 名 15

19 4. 受 试 生 物 准 备 ⑴ 培 养 基 可 用 于 培 养 藻 类 的 培 养 基 很 多, 其 成 分 和 浓 度 各 不 相 同 本 方 法 建 议 淡 水 藻 类 可 用 表 中 推 荐 的 培 养 基 经 空 气 平 衡 后, 培 养 基 的 ph 接 近 于 8 亦 可 使 用 其 他 培 养 基, 但 对 必 要 成 分 限 制 如 下 : P 0.7mg/L;N 10mg/L; 螯 合 剂 10-3 mmol/l; 硬 度 (Ca+Mg) mmol/l 表 藻 类 培 养 基 营 养 盐 贮 备 液 浓 度 测 试 液 中 最 终 浓 度 贮 备 液 1: 常 量 营 养 盐 氯 化 铵 (NH 4 Cl) 1.5g/L 15 mg/l 氯 化 镁 (MgCl 2 6h 2 O) 1.2 g/l 12 mg/l 氯 化 钙 (CaCl 2 2h 2 O) 1.8 g/l 18 mg/l 硫 酸 镁 (NgSO 4 7H 2 O) 1.5 g/l 15 mg/l 磷 酸 二 氢 钾 (KH 2 PO 4 ) 0.16 g/l 1.6 mg/l 贮 备 液 2:Fe-EDTA FeCl 3 6H 2 O 80mg/L 80μg/L Na 2 EDTA 2H 2 O 100 mg/l 100μg/L 贮 备 液 3: 微 量 元 素 硼 酸 (H 3 BO 3 ) 185 mg/l 185μg/L 氯 化 锰 (MnCl 2 4H 2 O) 415 mg/l 415μg/L 氯 化 锌 (ZnCl 2 ) 3 mg/l 3μg/L 氯 化 钴 (CoCl 2 6H 2 O) 1.5 mg/l 1.5μg/L 氯 化 铜 (CuCl 2 2H 2 O) 0.01 mg/l 0.01μg/L 钼 酸 钠 (NaMoO 4 2H 2 O) 7 mg/l 7μg/L 贮 备 液 4:NaHCO 3 NaHCO 3 50g/l 50 mg/l 配 制 好 的 营 养 盐 类 贮 备 液 经 0.2μm 滤 膜 过 滤 或 高 压 灭 菌 (120 o C,15min) 后 4 o C 避 光 冷 藏 保 存 贮 备 液 4 只 能 用 滤 膜 过 滤 灭 菌 (2) 培 养 基 的 配 制 配 制 培 养 基 时 可 将 营 养 盐 类 按 所 需 浓 度 直 接 加 入 无 菌 的 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 中 应 按 顺 序 逐 一 加 入, 待 一 种 盐 类 完 全 溶 解 后 再 加 另 一 种 为 了 方 便 和 节 省 时 间, 亦 可 先 后 分 别 配 制 各 类 营 养 盐 类 的 浓 贮 备 液 ( 如 浓 缩 1000 倍 ) 经 过 滤 或 灭 菌 后 避 光 了 冷 藏 保 存, 当 需 要 配 制 培 养 基 时, 将 一 定 量 的 浓 贮 备 液 依 次 摇 匀 加 入 到 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 中 即 可 当 保 存 藻 种 需 要 使 用 固 体 培 养 基 时, 可 在 灭 菌 前 加 入 1.5%-2.0%( 重 量 / 体 积 比 ) 的 琼 脂 到 培 养 基 中 (3) 贮 备 培 养 得 到 纯 藻 种 后, 需 要 加 以 保 存, 以 备 试 验 使 用 藻 种 可 在 试 管 内 固 体 培 养 基 斜 面 上 保 存 在 培 养 基 中 加 入 1.5%-2.0% 的 琼 脂, 灭 菌 后 倒 入 试 管, 冷 却 成 斜 面, 然 后 接 种 藻 类, 棉 塞 封 闭, 在 较 低 的 光 照 和 温 度 条 件 下 可 保 存 较 长 时 间 大 约 每 隔 1 个 月 至 2 个 月 转 接 一 次 如 果 经 常 进 行 试 验, 贮 备 培 养 物 应 在 液 体 培 养 基 中 保 存 在 三 角 瓶 中 加 入 约 100ml 培 养 16

20 基, 接 种 藻 类, 在 试 验 要 求 的 相 同 温 度 和 光 照 条 件 下 培 养,7-10d 转 接 一 次, 以 保 持 培 养 物 生 长 良 好, 随 时 有 足 够 的 数 量 可 用 于 试 验 应 该 经 常 检 查 贮 备 培 养 中 藻 类 的 生 长 情 况, 包 括 形 态 和 生 长 速 度, 以 及 有 无 菌 类 和 其 他 藻 类 的 污 染 一 般 当 藻 类 进 入 停 滞 生 长 时 期 时 应 转 接 培 养 物 有 畸 形 生 长 或 受 到 其 他 藻 类 活 菌 类 的 污 染 时 应 废 弃 或 采 取 纯 化 复 壮 等 措 施 (4) 预 培 养 自 贮 备 培 养 物 中 取 出 一 定 量 的 藻 液, 接 种 到 新 鲜 的 无 菌 培 养 基 中, 接 种 藻 细 胞 浓 度 大 约 为 10 4 个 /ml(±25%) 在 试 验 要 求 和 相 同 条 件 下 培 养 应 使 藻 类 在 2-3d 内 达 到 对 数 生 长, 然 后 再 次 转 接 到 新 鲜 培 养 基 中 如 此 反 复 转 接 培 养 2-3 次, 经 检 查 藻 类 生 长 健 壮 并 正 处 于 对 数 生 长 期 时 即 可 用 来 制 备 试 验 种 需 要 的 藻 类 试 验 液 每 次 试 验 中 的 藻 类 试 验 液 必 须 来 自 同 一 个 贮 备 培 养 物 已 经 在 以 前 的 毒 性 试 验 中 使 用 过 的 培 养 物 不 得 再 次 使 用 (5) 设 定 平 行 和 对 照 正 式 试 验 中 每 个 试 验 液 浓 度 至 少 要 设 置 三 个 平 行 样, 每 一 系 列 设 两 个 对 照 样 也 可 根 据 需 要 增 加 浓 度 或 减 少 平 行 的 数 量 当 使 用 助 溶 剂 增 加 受 试 物 的 溶 解 度 时, 对 照 组 中 助 溶 剂 应 与 测 试 液 中 助 溶 剂 浓 度 最 高 时 一 致 试 验 操 作 (1) 预 试 验 ( 确 定 浓 度 范 围 试 验 ) 为 确 定 正 式 试 验 中 受 试 物 的 浓 度 范 围, 可 以 先 进 行 一 次 预 试 验 预 试 验 的 浓 度 可 按 对 数 间 距 排 布, 最 低 浓 度 应 为 受 试 物 的 检 测 下 限, 最 高 浓 度 应 为 饱 和 浓 度 无 需 设 平 行 样 测 定 项 目 个 方 法 可 简 化, 实 验 时 间 也 可 缩 短 如 果 预 试 验 中 在 最 高 浓 度 测 点, 藻 的 生 长 抑 制 低 于 50%, 或 者 在 最 低 浓 度 测 点 中 藻 的 生 长 抑 制 高 于 50%, 可 不 必 再 进 行 正 式 试 验 如 果 有 必 要 进 行 正 式 试 验, 可 根 据 与 试 验 的 结 果 确 定 正 式 试 验 是 受 试 物 的 浓 度 范 围 和 浓 度 间 距 (2) 异 溶 于 水 的 化 学 物 质 的 正 式 试 验 1 受 试 物 试 验 液 : 用 经 过 0.45μm 滤 膜 过 滤 后 的 培 养 基 配 制 受 试 化 学 品 的 贮 备 液,, 其 浓 度 为 测 试 时 所 需 最 高 浓 度 的 二 倍 用 此 贮 备 液 稀 释 配 制 成 一 系 列 不 同 浓 度 的 受 试 物 试 验 液, 其 浓 度 也 分 别 为 测 试 时 所 需 浓 年 /2 度 的 二 倍 试 验 浓 度 可 按 10,n/10 或 10 的 几 何 级 数 或 等 对 数 间 距 设 计 试 验 前 应 测 定 受 试 验 液 的 ph 值, 必 要 使 用 HCl 或 NaOH 液 将 ph 调 整 为 7.5±0.2 试 验 结 束 时 应 测 定 受 试 物 的 浓 度 2 藻 试 验 液 : 藻 试 验 液 是 用 于 进 行 试 验 的 藻 培 养 物, 对 藻 类 进 行 预 培 养 后, 镜 检 其 生 长 情 况, 并 计 数 细 胞 浓 度 然 后 用 培 养 基 稀 释 至 藻 细 胞 浓 度 为 2*10 4 个 /ml, 即 成 为 可 用 于 试 验 接 种 的 藻 试 验 液 3 测 试 液 : 测 试 液 是 正 式 用 于 测 试 的, 含 有 藻 试 验 液 和 受 试 物 试 验 液 的 液 体 现 在 每 个 三 角 瓶 ( 或 其 他 培 养 容 器 ) 中 加 入 50ml 藻 试 验 液, 然 后 再 添 加 50ml 受 试 物 试 验 液 对 照 组 瓶 中 不 加 受 试 物 试 验 液 而 只 添 加 50ml 培 养 基 将 各 瓶 摇 动 均 匀 后 放 入 培 养 装 置, 试 验 正 式 开 始 4 藻 类 生 长 状 况 的 测 定 : 实 验 开 始 后, 每 隔 24h, 即 在 h 时, 从 每 个 瓶 中 取 样 进 行 生 长 测 定 测 定 项 目 包 括 藻 类 细 胞 浓 度 光 密 度 或 叶 绿 素 最 好 同 时 测 定 17

21 前 两 项, 如 果 工 作 量 过 大, 也 可 只 测 定 细 胞 浓 度 当 使 用 颗 粒 计 数 仪 或 分 光 光 度 以 进 行 测 定 时, 过 滤 得 培 养 基 分 别 作 为 背 景 和 空 白 试 验 开 始 和 试 验 72h 后, 应 测 定 ph 值 试 验 期 间 溶 液 ph 偏 差 大 于 1 个 单 位 是 不 正 常 的 (3) 有 限 水 溶 性 化 学 物 质 的 正 式 试 验 如 果 受 试 物 的 水 溶 性 低 于 1000mg/L, 试 验 操 作 应 作 如 下 修 改 : 1 受 试 物 试 验 液 : 用 适 当 的 溶 剂 制 备 受 试 物 的 贮 备 液, 其 浓 度 应 使 测 试 时 所 需 最 高 浓 度 的 10 4 倍 溶 剂 应 对 藻 类 生 长 无 影 响, 并 且 在 试 验 溶 液 中 的 含 量 最 高 不 得 超 过 100mg/L 要 设 置 助 溶 剂 对 照, 其 浓 度 应 与 试 验 液 中 助 溶 剂 的 最 高 浓 度 一 致 2 藻 类 验 液 : 用 培 养 基 将 经 过 与 培 养 的 藻 类 培 养 物 配 制 藻 试 验 液, 使 细 胞 浓 度 为 10 4 个 /ml 3 测 试 液 : 每 个 三 角 瓶 中 加 入 100ml 藻 种 液, 再 添 加 10μl 溶 剂 其 他 步 骤 同 易 水 溶 性 化 学 品 (4) 挥 发 性 化 学 物 质 的 正 式 试 验 目 前, 还 没 有 被 普 遍 接 受 的 方 法 来 测 试 挥 发 性 物 质 当 已 知 一 种 物 质 有 挥 发 倾 向 时, 应 使 用 密 封 的 磨 口 烧 瓶 测 试 应 设 法 测 定 溶 液 中 受 试 物 的 量, 最 后 应 说 明 以 挥 发 性 化 学 品 的 测 试 结 果 是 在 密 封 系 统 中 进 行 的 (5) 废 水 或 环 境 水 样 的 正 式 试 验 当 受 试 物 为 废 水 或 环 境 水 样 时, 水 养 必 须 密 封 低 温 存 放 0-4 o C 样 品 瓶 中 应 充 满 水 养 不 留 空 气, 尽 量 使 样 品 毒 性 变 化 较 小, 而 且 在 试 验 前 的 保 存 时 间 越 短 越 好 测 试 废 水 样 品 或 环 境 水 样 之 前 要 预 先 振 摇 可 直 接 用 水 样 作 为 毒 性 试 验 液 : 如 果 水 样 毒 性 过 大, 也 可 使 用 稀 释 水 配 成 适 当 浓 度 的 试 验 液, 对 于 含 有 难 溶 性 毒 物 的 水 样, 同 时 可 以 使 用 助 溶 剂 或 乳 化 剂 如 果 水 样 所 含 毒 物 在 一 段 时 间 内 不 稳 定, 必 须 定 期 分 析 废 水 的 稀 释 液 浓 度 可 用 体 积 百 分 比 表 示 (6) 藻 类 生 长 测 定 方 法 测 定 藻 类 生 长 的 指 标 和 方 法 很 多, 本 方 法 推 荐 采 用 以 下 测 定 方 法 : 1 细 胞 计 数 : 在 显 微 镜 下, 用 0.1ml 计 数 框 或 血 球 数 板 对 藻 细 胞 的 数 量 计 数 用 计 数 框 时 可 采 用 视 野 法, 即 对 显 微 镜 视 野 中 的 所 有 细 胞 计 数 放 大 倍 数 40*10 每 片 至 少 计 数 10 个 视 野, 如 果 藻 细 胞 密 度 小, 则 要 适 当 增 及 计 数 视 野 藻 数 按 视 野 累 加 每 次 计 数 ( 同 一 批 取 样 的 样 品 ) 应 采 用 相 同 方 法 ( 视 野 数 目 放 大 倍 数 等 ) 每 一 样 品 至 少 计 数 两 次, 如 计 数 结 果 相 差 大 于 15%, 应 予 重 新 计 数 如 工 作 量 过 大, 可 先 取 样, 用 鲁 哥 氏 液 固 定 后 保 存, 留 待 以 后 计 数 镜 检 计 数 工 作 量 较 大, 有 条 件 时 可 采 用 电 子 颗 粒 计 数 仪 2 光 密 度 : 取 一 定 量 的 测 试 液 在 分 光 光 度 计 上 测 定 其 光 密 度, 波 长 可 选 用 nm 或 其 他 波 长, 亦 可 用 荧 光 光 度 计 测 定 3 叶 绿 素 : 样 品 经 离 心 或 过 滤 后, 用 丙 酮 乙 醇 或 其 他 溶 剂 萃 取, 进 行 分 光 测 定, 亦 可 用 荧 光 光 度 计 测 定 5. 质 量 保 证 和 质 量 控 制 1 本 方 法 适 用 于 多 种 淡 水 绿 藻 2 本 方 法 适 用 于 水 溶 性 且 在 试 验 条 件 下 能 保 留 在 水 中 的 物 质 如 果 需 要 适 用 助 溶 剂 ( 有 机 溶 剂 ) 来 获 得 所 要 求 的 浓 度, 该 助 溶 剂 在 水 中 的 浓 度 不 得 超 过 100mg/L, 适 用 乳 化 剂 或 分 散 剂 时, 其 浓 度 应 不 影 响 光 透 性 3 当 受 试 物 是 有 限 水 溶 性 物 质 时, 不 适 于 对 EC50 进 行 定 量 测 定 本 方 法 不 适 用 于 直 接 干 扰 藻 类 生 长 测 定 的 物 质 18

22 4 试 验 开 始 的 3d 内, 对 照 组 藻 细 胞 浓 度 至 少 应 增 加 16 倍 5 因 挥 发 损 失 的 受 试 物 不 得 超 过 20%, 如 果 已 ( 或 可 能 ) 超 过, 则 应 在 密 闭 瓶 内, 在 较 低 的 标 准 产 量 下 进 行 试 验 6 除 非 受 到 受 试 物 的 理 化 性 质 或 生 物 特 性 的 限 制, 浓 度 设 置 应 做 到, 在 某 一 浓 度 下 试 验 组 与 对 照 组 相 比, 生 长 率 没 有 显 著 下 降, 而 且 另 一 浓 度 时,96h 的 生 长 抑 制 应 高 于 50% 7 在 试 验 室 最 好 使 用 推 荐 的 藻 种 类, 以 利 于 提 高 试 验 结 果 的 可 比 性 和 可 重 复 性 若 选 其 他 种 类 应 在 试 验 报 告 中 写 明 方 和 说 明 理 由 6. 数 据 和 报 告 (1) 数 据 处 理 将 测 试 液 和 对 照 组 中 细 胞 浓 度 与 受 试 物 浓 度 测 试 时 间 一 起 制 表 绘 制 每 个 受 试 物 浓 度 和 对 照 组 的 细 胞 浓 度 平 均 值 与 时 间 关 系 得 生 长 曲 线 可 用 下 面 所 推 荐 的 方 法 确 定 浓 度 效 应 关 系 1 浓 度 的 换 算 : 把 显 微 镜 视 野 计 数 结 果 换 算 为 细 胞 浓 度 N: N= Cs *Pn*10 Fs*n 式 中 :N 每 瓶 试 样 中 藻 的 浓 度 ( 个 /ml); Cs 计 数 框 面 积 (20mm*20mm); Fs πr 2 ( 视 野 面 积 ); r 测 量 的 视 野 半 径 值 (mm); n 视 野 数 ; Pn n 个 视 野 藻 细 胞 数 累 加 值 2 生 长 曲 线 下 面 所 包 围 面 积 的 比 较 : 生 长 曲 线 以 下 的 面 积 可 以 按 下 式 计 算 : A= N 1 -N 0 *t 1 + N 1 +N 2-2N 0 *(t 2 -t 1 )+ + N n-1 +N n -2N 0 *(t n -t n-1 ) 式 中 :A 生 长 曲 线 以 下 的 面 积 ; N0 t0 时 刻 每 毫 升 藻 液 中 的 细 胞 数 ; N1 t1 时 刻 每 毫 升 藻 液 中 所 测 得 的 细 胞 数 ; Nn tn 时 刻 每 毫 升 藻 液 中 所 测 得 的 细 胞 数 ; t1 试 验 开 始 后 第 一 次 计 数 的 时 间 ; tn 试 验 开 始 后 第 n 次 计 数 的 时 间 每 一 受 试 物 浓 度 细 胞 生 长 抑 制 的 百 分 率 I A 是 对 照 组 生 长 曲 线 下 所 包 围 的 面 积 (A C ) 与 每 个 受 试 物 浓 度 生 长 曲 线 下 面 所 包 围 的 面 积 A t 之 差 计 算 得 到 见 下 式 : I A = A C -A t *100 A C 在 半 对 数 坐 标 纸 上 或 半 对 数 概 率 之 上, 绘 制 I A 与 相 应 浓 度 之 间 的 关 系 曲 线 若 在 概 率 纸 上 绘 制 的 点 可 以 拟 合 为 一 条 直 线, 或 可 假 设 为 一 个 正 态 分 布 时, 应 给 出 经 计 算 所 得 的 回 归 线 可 过 I A =50% 的 点 画 一 条 过 回 归 线 且 与 横 轴 平 行 的 直 线, 该 线 与 回 归 线 的 焦 点 所 对 的 浓 度 值 为 EC50 值 为 了 准 确 表 示 此 值 与 本 计 算 方 法 的 关 系, 建 议 使 用 符 号 EbC50 表 示 在 本 方 法 中, 指 定 用 EbC50(0h-72h) 表 示 在 24h 48h 72h 测 定 的 EbC50 值 其 他 EC 值 如 EbC10 也 可 以 从 绘 制 的 相 应 浓 度 曲 线 得 到 3 生 长 率 比 较 : 对 数 生 长 期 藻 类 平 均 特 定 生 长 率 (μ) 用 下 式 计 算 : 19

23 μ = ln N n -lnn 1 t n -t 1 平 均 特 定 生 长 旅 也 可 以 用 lnn 对 时 间 的 回 归 线 的 斜 率 导 出 用 每 一 受 试 物 浓 度 与 对 照 组 相 比 所 得 到 的 生 长 率 下 降 百 分 数 对 对 数 浓 度 左 图, 可 直 接 从 图 上 读 出 EC50 为 了 表 明 此 项 EC50 是 由 该 方 法 求 出 的, 建 议 采 用 符 号 ErC50 表 示 必 须 标 明 相 应 测 定 时 间, 如 相 对 于 24h 和 48h 的 试 验 值 用 符 号 ErC50(24h 48h) 表 示 注 意 : 生 长 率 是 一 对 数 项, 生 长 率 微 小 变 化 可 能 会 导 致 生 物 量 的 较 大 变 化 EbC 和 ErC 值 在 数 值 上 是 不 可 比 的 (2) 结 果 评 价 糟 了 生 长 抑 制 毒 性 评 价 的 分 级 标 准 见 表 表 藻 类 生 长 抑 制 毒 性 分 级 标 准 96hEC50(mg/L) < > 100 毒 性 分 级 极 高 毒 高 毒 中 毒 低 毒 (3) 编 写 报 告 报 告 应 包 括 试 验 名 称 目 的 试 验 原 理 试 验 的 准 确 起 止 日 期, 以 及 : 1) 受 试 物 : 名 称 来 源 成 分 表 达 式 批 号 纯 度 等 级 理 化 特 性 数 据 2) 受 试 生 物 : 名 称 来 源 室 内 培 养 号 和 株 号 培 养 基 培 养 方 法 3) 试 验 条 件 : 1 试 验 开 始 和 结 束 日 期, 试 验 持 续 时 间 2 温 度 3 培 养 基 组 成 4 试 验 开 始 和 结 束 时 溶 液 的 ph 值, 若 观 察 到 ph 值 偏 差 大 于 1 个 单 位 应 给 出 解 释 5 用 于 溶 解 受 试 物 的 溶 剂 和 方 法 及 测 试 液 中 溶 剂 浓 度 6 光 强 和 光 质 7 测 试 浓 度 ( 实 测 值 或 规 定 值 ) 4) 试 验 结 果 1 每 一 个 测 试 点 上 每 瓶 中 的 细 胞 浓 度 和 测 试 细 胞 浓 度 的 方 法 2 细 胞 浓 度 的 平 均 值 3 每 一 浓 度 的 时 间 生 长 曲 线 图 4 浓 度 效 应 曲 线 图 5EC50 值 和 计 算 方 法 6 无 可 观 察 效 应 浓 度 (NOEC) 7 其 他 的 观 察 效 应 ( 如 细 胞 色 泽 变 化 形 态 大 小 变 化 粘 连 或 聚 结 情 况 死 亡 情 况 抑 藻 或 杀 藻 效 应 等 ) 5) 结 果 讨 论 20

24 附 录 B ( 规 范 性 文 件 ) 溞 类 活 动 抑 制 实 验 溞 类 是 枝 角 类 (Cladocera) 的 通 称, 在 分 类 上 属 节 枝 动 物 们 (Arthropoda), 甲 壳 动 物 纲 (Crustacea), 鳃 足 亚 纲 (Branchiopoda), 双 甲 目 (Diplostraca), 枝 角 亚 目 (Cladocera) 溞 类 广 泛 分 布 在 淡 水 中, 海 水 中 种 类 较 少 据 调 查, 我 国 共 有 淡 水 溞 类 136 种 溞 类 是 水 体 中 初 级 生 产 者 ( 藻 类 ) 和 消 费 者 ( 如 鱼 类 ) 之 间 的 中 间 环 节, 能 滤 食 水 中 碎 屑 和 菌 类, 对 水 体 自 净 起 着 重 要 作 用, 同 时 又 是 鱼 类 的 天 然 诱 料 溞 类 繁 殖 快, 生 活 周 期 短, 培 养 简 便, 对 许 多 毒 物 敏 感, 因 此 世 界 各 国 广 泛 使 用 溞 类 进 行 水 生 生 态 毒 理 学 研 究 1. 受 试 化 学 品 必 备 资 料 水 溶 解 度 蒸 汽 压 结 构 式 纯 度 水 溶 液 中 的 定 量 分 析 法 在 水 中 和 光 中 的 化 学 稳 定 性 正 辛 醇 / 水 的 分 配 系 数 快 速 生 物 降 解 试 验 结 果 2. 仪 器 设 备 1 溶 解 氧 测 定 仪 2 水 硬 度 计 3 体 视 显 微 镜 4pH 计 5 试 验 容 器 或 装 置 试 验 容 器 最 好 是 全 玻 璃 制 品 或 由 其 他 化 学 惰 性 材 料 制 成 容 积 适 当, 规 格 一 致, 便 于 清 洗 3. 数 据 和 报 告 目 前 世 界 上 用 于 毒 性 试 验 的 溞 类 种 类 很 多 常 用 的 种 类 是 : 大 型 溞 Daphnia magna Straus 蚤 状 溞 Daphnia pulex Leydig 隆 线 溞 Daphnia Carinata King 由 于 大 型 溞 是 溞 科 中 个 体 最 大 的 种 类, 体 长 可 达 6mm, 生 殖 量 多, 是 毒 性 试 验 使 用 最 广 的 一 种 国 际 标 准 ISO 6341 和 我 国 国 家 标 准 GB/T 都 把 大 型 溞 为 准 试 验 动 物 使 用 大 型 溞 或 其 他 适 宜 的 溞 类, 试 验 开 始 时, 溞 龄 应 不 超 过 24h 试 验 室 繁 殖 表 观 健 康, 有 明 确 来 历 ( 繁 殖 方 式 预 培 养 ) 的 溞 种 才 可 用 于 试 验 4. 试 验 程 序 ⑴ 准 备 1 实 验 用 水 : 适 于 培 养 溞 类 的 任 何 水, 不 论 是 天 然 水 或 标 准 稀 释 水 ( 见 附 录 ), 都 可 用 于 测 试 实 验 建 议 在 试 验 前 使 用 的 培 养 水 应 与 试 验 用 水 相 似, 以 利 于 溞 类 的 适 应 标 准 稀 释 水 应 容 许 溞 类 在 其 中 生 存 至 少 48h, 并 尽 可 能 检 查 稀 释 水 中 不 含 有 任 何 已 知 对 溞 类 有 毒 的 物 质, 例 如 : 氯 重 金 属 农 药 多 氯 联 苯 等 2 受 试 物 溶 液 配 制 : 取 一 定 体 积 受 试 物 的 贮 备 液, 加 入 稀 释 水, 定 容, 制 备 成 经 验 要 求 弄 得 21

25 的 试 验 液 对 于 受 试 化 学 品 贮 备 液 的 制 备, 可 将 已 知 量 的 受 试 物 溶 于 一 定 体 积 的 稀 释 水 中, 贮 备 液 应 于 当 天 配 制, 对 于 高 稳 定 性 物 质, 最 多 允 许 配 置 供 2d 使 用 的 贮 备 液 配 置 贮 备 液 时, 难 溶 于 水 的 物 质 可 用 适 当 的 方 法 将 其 溶 解 或 分 散, 包 括 采 用 超 声 波 装 置 和 使 用 对 溞 低 毒 的 有 机 溶 剂 乳 化 剂 和 分 散 剂 等 物 质, 并 应 加 设 助 溶 剂 对 照 试 验 助 溶 剂 对 照 组 的 溶 剂 浓 度 应 为 试 验 溶 液 中 最 高 浓 度 对 于 工 业 废 水, 以 原 水 样 为 试 验 液 (100%), 用 稀 释 水 按 百 分 数 ( 百 分 率 ) 配 制 各 浓 度 采 集 废 水 样 品 时, 应 将 水 样 瓶 充 满 水 样 不 留 空 气, 样 品 采 集 后 应 立 即 进 行 试 验, 尽 可 能 缩 短 水 样 保 存 时 间, 如 果 样 品 采 集 后 6h 之 内 不 能 进 行 试 验, 则 必 须 将 水 样 在 0-4 保 存 对 于 工 业 固 体 废 物, 首 先 磨 碎, 按 1:10 比 例 加 入 去 离 子 水, 摇 匀 后 浸 泡 24h, 滤 纸 过 滤 其 溶 解 部 分 为 被 测 工 业 固 体 废 物 的 浸 出 原 液 (100%), 在 用 稀 释 水 按 百 分 数 配 制 成 各 浓 度 ⑵ 试 验 操 作 1 预 试 验 : 在 正 式 试 验 之 前, 先 进 行 较 大 范 围 浓 度 系 列 ( 如 mg/L) 的 初 步 试 验, 为 正 式 试 验 设 置 受 试 物 体 的 浓 度 提 供 依 据 预 试 验 中 每 个 浓 度 放 五 只 幼 溞, 持 续 时 间 24h ( 或 48h) 用 静 态 方 式 进 行, 不 设 平 行 组 2 正 式 试 验 : 根 据 预 试 验 的 结 果, 在 包 括 使 溞 全 部 产 生 活 动 抑 制 的 最 低 浓 度 和 未 产 生 活 动 抑 制 的 最 高 浓 度 之 间 以 几 何 级 数 设 置 浓 度 系 列 一 般 至 少 设 五 个 浓 度 组, 如 mg/L 最 高 试 验 浓 度 不 应 超 过 1g/L 必 须 设 置 空 白 对 照 若 使 用 助 溶 剂, 尚 应 增 设 助 溶 剂 对 照 组, 其 助 溶 剂 用 量 同 最 高 浓 度 组 每 个 浓 度 组 和 对 照 组 至 少 要 用 20 只 溞, 最 好 分 成 4 组, 每 组 五 只 试 验 期 间 不 要 喂 食 最 大 负 荷 为 1 只 溞 /2ml 试 验 液 试 验 温 度 应 在 (18-20 )±1 光 暗 周 期 无 特 殊 要 求 建 议 毒 性 试 验 在 自 然 光 照 或 相 当 于 自 然 光 照 下 进 行, 每 天 照 明 10h 左 右 稀 释 水 在 加 入 到 受 试 物 中 之 前 曝 气 试 验 开 始 和 结 束 时, 应 测 定 对 照 组 和 试 验 液 中 溶 解 氧 的 浓 度 在 试 验 开 始 和 结 束 时, 应 测 定 对 照 组 和 试 验 液 中 的 ;ph 值 不 可 调 节 试 验 液 中 的 ph 值 如 有 条 件, 应 测 定 受 试 物 的 实 际 浓 度 试 验 期 间, 经 常 观 察 溞 类 的 活 动 与 生 存 情 况, 应 及 时 取 出 死 溞 记 录 24h 和 48h 溞 类 累 计 活 动 抑 制 数 最 好 出 现 0% <50% >50% 和 100% 的 溞 类 抑 制 的 试 验 结 果 5. 质 量 保 证 与 质 量 控 制 1 实 验 结 束 时, 试 验 溶 液 中 的 溶 解 氧 浓 度 应 高 于 空 气 饱 和 值 的 60% 2 试 验 结 束 时, 对 照 组 中 活 动 受 抑 制 溞 数 应 少 于 10% 3 受 试 物 实 测 浓 度 不 能 低 于 设 置 浓 度 的 80% 4 定 期 测 定 参 比 物 的 24hEC 50, 以 检 查 供 试 溞 的 敏 感 性 满 足 参 比 物 重 铬 酸 钾 ( 分 析 纯 ) 的 24hEC 50 值 2.0mg/L, 溞 敏 感 度 符 合 要 求 6. 数 据 处 理 与 报 告 ⑴ 数 据 处 理 用 表 格 形 式 列 出 24h 和 48h 对 照 组 和 各 处 理 组 试 验 溞 个 数 活 动 抑 制 溞 数 个 数 及 百 分 率 以 受 试 物 处 理 浓 度 为 横 坐 标, 死 亡 率 为 纵 坐 标 在 计 算 机 或 对 数 - 概 率 纸 上 作 图, 通 过 图 解 内 插 法 或 计 算 法 求 出 24h 和 48h EC 50 估 计 值, 并 计 算 95% 的 置 信 限 ⑵ 结 果 评 价 溞 类 的 毒 性 可 按 以 下 标 准 分 级 ( 表 5-3-3) 22

26 表 溞 类 急 性 活 动 抑 制 毒 性 分 级 标 准 48h EC 50 (mg/l) 毒 性 分 级 极 高 毒 高 毒 中 毒 低 毒 ⑶ 编 写 报 告 报 告 应 包 括 : 试 验 名 称 目 的 试 验 原 理 试 验 的 准 确 起 止 日 期, 以 及 : 1) 受 试 物 : 对 于 化 学 品, 其 化 学 名 称 其 他 名 称 ( 商 品 名 等 ) 化 学 式 成 分 来 源 ( 制 造 厂 商 等 ) 批 号 纯 度 等 级 以 及 理 化 性 质 等 ; 对 于 废 水 废 渣 等 环 境 样 品, 其 来 源 采 样 地 点 采 样 时 间 等 2) 试 验 用 溞 : 溞 类 名 称 来 源 预 培 养 繁 殖 方 式 ( 包 括 食 物 来 源 种 类 和 数 量 喂 食 频 次 ) 溞 龄 健 康 状 况 等 3) 实 验 条 件 : 1 使 用 的 助 溶 剂 添 加 剂 及 其 浓 度 若 观 察 到 试 验 溶 液 不 能 保 持 均 一 和 稳 定, 对 结 果 的 解 释 应 慎 重, 并 注 明 这 些 结 果 不 能 重 复 2 稀 释 水 : 来 源 理 化 特 性 包 括 硬 度 ph 值 Ca/Mg Na/K 碱 度 等 3 试 验 温 度 4 光 暗 周 期 5 最 好 用 表 格 列 出 试 验 期 间 ph 值 和 溶 解 氧 的 全 部 测 定 值 6 若 使 用 参 比 物, 记 录 其 测 试 结 果 和 数 据 7 试 验 容 器 : 容 积 质 地 密 闭 方 式 溶 液 体 积 每 个 容 器 中 受 试 物 的 数 量, 每 个 浓 度 测 试 容 器 的 数 量, 试 验 容 器 的 处 理, 受 试 物 在 稀 释 水 中 的 引 入 8 试 验 液 的 更 换 情 况, 更 换 顺 序 及 方 案 流 动 情 况, 受 试 物 的 输 送 系 统 及 流 速 9 受 试 物 的 实 测 浓 度 和 测 定 日 期 4) 试 验 结 果 : 1 溞 类 无 活 动 抑 制 (EC 0 ) 的 最 高 浓 度 2100% 溞 产 生 活 动 抑 制 (EC 100 ) 的 最 低 浓 度 324h 48h 时 的 每 个 浓 度 的 累 计 死 亡 率 424h 48h 时 的 EC 50, 及 其 95% 的 置 信 限 5 浓 度 - 抑 制 率 曲 线 图 6 对 照 组 抑 制 率 7 试 验 期 间, 可 能 会 影 响 试 验 结 果 的 隐 患 8 对 照 组 和 浓 度 组 溞 类 的 其 他 异 常 反 应 9 如 果 进 行 参 比 物 试 验, 报 告 试 验 结 果 5) 结 果 讨 论 7 标 准 稀 释 水 的 配 制 新 配 制 的 标 准 稀 释 水 ph 值 为 7.80±.2, 硬 度 为 250mg/L±35mg/L( 以 CaCO 3 计 ),Ca/Mg 的 比 例 接 近 4:1, 溶 解 氧 浓 度 在 空 气 饱 和 值 的 80% 以 上, 不 含 有 任 何 对 大 型 溞 有 毒 的 物 质 人 工 稀 释 水 用 电 导 率 10μS/cm(1mS/m) 的 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 ( 以 下 简 称 水 ) 按 下 述 方 法 配 制 : 1 氯 化 钙 溶 液 : 将 11.76gCaCl 2 2H 2 O 溶 解 于 水 中, 并 稀 释 至 1L 2 硫 酸 镁 溶 液 : 将 4.93gMgSO 4 7H 2 O 溶 解 于 水 中, 并 稀 释 至 1L 3 碳 酸 氢 钙 溶 液 : 将 2.59gNaHCO 3 溶 解 于 水 中, 并 稀 释 至 1L 4 氯 化 钙 溶 液 : 将 0.23gKCl 溶 解 于 去 离 子 水 中, 并 稀 释 至 1L 取 以 上 四 种 溶 液 各 25ml 加 以 混 合 并 用 水 稀 释 至 1L, 必 要 时 可 用 氢 氧 化 钠 溶 液 或 盐 酸 溶 液 调 节 ph 值, 使 其 稳 定 在 7.8±0.2 23

27 附 录 C ( 规 范 性 文 件 ) 鱼 类 急 性 毒 性 试 验 鱼 类 是 水 生 食 物 链 的 重 要 环 节, 也 是 水 体 中 重 要 的 经 济 动 物 鱼 类 毒 性 试 验 在 研 究 水 污 染 及 水 环 境 质 量 中 占 有 重 要 地 位 通 过 鱼 类 急 性 试 验 可 以 评 价 受 试 物 对 水 生 生 物 可 能 产 生 的 影 响, 以 短 期 暴 露 效 应 表 明 受 试 物 的 毒 害 性 因 此 在 人 为 控 制 的 条 件 下, 所 进 行 的 各 种 鱼 类 毒 性 试 验, 不 仅 可 用 于 化 学 品 毒 性 测 定, 水 体 污 染 程 度 检 测 废 水 及 其 处 理 效 果 检 查, 而 且 也 可 为 制 定 水 质 标 准 评 价 水 环 境 质 量 和 管 理 废 水 排 放 提 供 科 学 依 据 1. 受 试 物 及 必 备 资 料 对 于 化 学 受 试 物, 要 求 以 下 必 备 资 料 : 水 溶 解 度 在 水 中 和 光 中 的 稳 定 性 蒸 汽 压 pk a 值 结 构 式 正 辛 醇 - 水 的 分 配 系 数 纯 度 快 速 生 物 降 解 试 验 结 果 水 溶 液 中 的 定 量 分 析 方 法 对 于 环 境 样 品, 采 集 样 品 时 应 将 采 样 瓶 充 满 水 样 不 留 顶 上 空 间, 样 品 采 集 后 立 即 进 行 试 验 如 果 样 品 采 集 后 6h 之 内 不 能 进 行 试 验, 则 必 须 将 水 样 在 0-4 下 保 存, 废 水 稀 释 浓 度 可 用 体 积 百 分 比 表 示 2. 仪 器 设 备 1 溶 解 氧 测 定 仪 2 水 硬 度 计 3 温 度 控 制 仪 4pH 计 5 分 析 天 平 6 试 验 容 器 或 装 置 : 化 学 惰 性 材 料 制 成 的 水 族 箱 或 水 槽, 规 格 一 致, 体 积 适 宜 如 使 用 流 水 试 验 装 置, 应 具 有 控 温 充 气 流 速 控 制 等 功 能 7 抄 网 : 尼 龙 或 其 他 化 学 惰 性 材 料 制 成 对 照 组 和 试 验 组 容 器 分 用 3. 受 试 生 物 种 或 材 料 可 选 用 一 个 或 多 个 鱼 种, 根 据 需 要 自 行 选 择 但 建 议 结 合 相 应 得 标 准 来 确 定 鱼 种 : 如 全 年 可 得 易 于 饲 养 试 验 方 便 相 关 的 经 济 生 物 或 生 态 因 素 等 试 验 用 鱼 应 健 康, 无 明 显 畸 形 还 应 考 虑 来 源 可 靠 稳 定 建 议 受 试 物 为 化 学 品 时 采 用 表 中 的 推 荐 鱼 种 ; 受 试 物 为 环 境 样 品 时, 除 可 采 用 上 述 推 荐 鱼 种 外, 亦 可 采 用 当 地 具 有 代 表 性 的 鱼 种 如 白 鲢 (Hypophthamichthys molitrix), 鳙 鱼 (Aristichthys nobilis), 草 鱼 (Ctenopharyngodon idellus), 鲤 鱼 (Cyprinus carpio) 等 表 推 荐 的 试 验 用 鱼 及 条 件 鱼 种 试 验 温 度 ( ) 试 验 鱼 的 全 长 (cm) 斑 马 鱼 (Brachydanio rerio) ±1.0 稀 有 鮈 鲫 (Gobiocypris rarus) ±1.0 剑 尾 鱼 (Xiphophorus helleri) ±1.0 24

28 用 其 他 淡 水 鱼 海 洋 及 半 咸 水 鱼 做 试 验 时, 试 验 条 件, 特 别 是 关 于 稀 释 水 用 量 水 质 及 温 度 应 做 相 应 的 改 变, 并 提 出 相 应 的 试 验 条 件 4. 试 验 程 序 准 备 (1) 供 试 鱼 的 驯 养 1 供 试 鱼 用 于 试 验 之 前, 必 须 在 试 验 室 至 少 暂 养 12d 临 试 验 前, 应 在 符 合 下 列 条 件 的 环 境 中 至 少 驯 养 7d: 水 : 与 试 验 用 稀 释 水 水 质 相 同 ; 光 : 每 天 12-16h 光 照 ; 温 度 : 与 试 验 鱼 种 相 适 宜 ; 溶 解 氧 浓 度 : 高 于 空 气 饱 和 值 的 80%; 喂 养 : 每 周 三 次 或 每 天 投 食, 至 试 验 开 始 前 24h 为 止 2 驯 养 开 始 48h 后, 记 录 死 亡 率, 并 按 下 列 标 准 处 理 : 7d 内 死 亡 率 小 于 5%, 可 用 于 试 验 ; 死 亡 率 在 5%-10% 之 间, 继 续 驯 养 7d 死 亡 率 超 过 10%, 该 组 鱼 全 部 不 能 使 用 (2) 试 验 用 水 使 用 高 质 量 的 自 然 水 或 标 准 稀 释 水, 也 可 以 使 用 饮 用 水 ( 必 要 时 应 除 氯 ) 水 的 总 硬 度 为 mg/L( 以 CaCO 3 计 ),ph 为 (3) 标 准 稀 释 水 的 配 制 配 制 标 准 稀 释 水, 所 用 试 剂 必 须 是 分 析 纯, 用 全 玻 璃 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 配 制 1 氯 化 钙 溶 液 : 将 11.76g CaCl 2 2H 2 O 溶 解 于 水 中, 稀 释 至 1L 2 硫 酸 镁 溶 液 : 将 4.93g MgSO 4 7H 2 O 溶 解 于 水 中, 稀 释 至 1L 3 碳 酸 氢 钠 溶 液 : 将 2.59g NaHCO 3 溶 解 于 水 中, 稀 释 至 1L 4 氯 化 钾 溶 液 : 将 0.23g KCl 溶 解 于 水 中, 稀 释 至 1L 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 的 电 导 率 应 10Μs/cm 将 这 四 种 溶 液 各 25ml 加 以 混 合 并 用 水 稀 释 至 1L 溶 液 中 钙 离 子 和 镁 离 子 的 总 和 是 2.5mmol/L Ca:Mg 的 比 例 为 4:1,Na:K 比 为 10:1 稀 释 用 水 需 经 曝 气 直 到 氧 饱 和 为 止, 储 存 备 用 使 用 时 不 必 再 曝 气 (4) 试 验 溶 液 1 将 受 试 物 贮 备 液 稀 释 成 一 定 浓 度 的 受 试 物 溶 液 低 水 溶 性 物 质 的 贮 备 液 可 以 通 过 超 声 分 散 或 其 他 适 合 的 物 理 方 法 配 制, 必 须 时 可 以 使 用 对 鱼 毒 性 低 的 有 机 溶 剂 乳 化 剂 和 分 散 剂 来 助 溶 使 用 这 些 物 质 时 应 加 设 溶 剂 对 照 组, 其 助 溶 剂 含 量 应 为 试 验 组 使 用 助 溶 剂 的 最 高 浓 度, 且 不 得 超 过 100mg/L 或 0.1ml/L 2 不 需 调 节 试 验 溶 液 的 ph 如 果 加 入 受 试 物 后 水 箱 内 水 的 ph 有 明 显 变 化, 建 议 加 入 前, 调 节 受 试 物 贮 备 液 的 ph, 使 其 接 近 水 箱 内 水 的 ph 调 节 贮 备 液 的 ph 时 不 能 使 受 试 物 浓 度 明 显 改 变, 或 发 生 化 学 反 应 或 沉 淀 最 好 使 用 HCl 和 NaOH 来 调 节 (5) 暴 露 条 件 时 间 :96h 承 载 量 : 静 态 和 半 静 态 试 验 系 统 最 大 承 载 量 为 1.0g 鱼 /L, 流 水 式 试 验 系 统 承 载 量 可 高 一 些 光 照 : 每 天 12-16h 温 度 : 与 试 验 鱼 种 相 适 宜 ( 见 表 5-3-4), 温 控 范 围 ±2, 对 于 较 严 格 的 试 验 温 控 ±1 范 围 25

29 溶 解 氧 : 不 低 于 空 气 饱 和 值 的 60%, 曝 气 时 不 能 使 受 试 物 明 显 受 损 不 喂 食, 并 避 免 会 改 变 鱼 行 为 的 干 扰 试 验 操 作 在 试 验 之 前, 应 根 据 受 试 物 的 化 学 稳 定 性 确 定 采 用 的 试 验 方 法, 即 静 态 半 静 态 和 流 水 式 试 验, 从 而 选 定 需 用 的 容 器 和 装 置 (1) 预 试 验 用 以 确 定 正 式 试 验 所 需 浓 度 范 围, 可 选 择 较 大 范 围 的 浓 度 系 列, 如 mg/L 每 个 浓 度 组 放 入 五 条 鱼, 可 用 静 态 方 式 进 行, 不 设 平 行 组, 实 验 持 续 48-96h 每 日 至 少 两 次 记 录 各 容 器 内 的 死 鱼 数, 并 及 时 取 出 死 鱼 如 果 一 次 预 试 验 结 果 无 法 确 定 正 式 试 验 所 需 的 浓 的 范 围, 应 另 选 一 浓 度 范 围 再 次 进 行 预 试 验 (2) 正 式 试 验 根 据 预 试 验 得 出 的 结 果, 在 包 括 使 鱼 全 部 死 亡 的 最 低 浓 度 和 96h 鱼 类 全 部 存 活 的 最 高 浓 度 之 间 至 少 应 设 置 五 个 浓 度 组, 并 以 几 何 级 数 排 布 浓 度 间 隔 系 数 应 2.2 每 个 试 验 浓 度 组 应 至 少 设 三 个 平 行, 每 一 系 列 设 一 个 空 白 对 照 如 使 用 了 助 溶 剂, 应 增 设 溶 剂 对 照, 其 浓 度 与 试 剂 中 的 最 高 溶 剂 浓 度 相 同 每 一 浓 度 组 和 对 照 组 至 少 使 用 七 尾 鱼, 条 件 允 许 的 情 况 下, 建 议 使 用 10 尾 鱼 试 验 溶 液 调 节 至 相 应 温 度 后, 从 驯 养 鱼 群 中 随 机 取 出 鱼 并 随 机 迅 速 放 入 各 试 验 容 器 中 转 移 期 间 处 理 不 当 的 鱼 均 应 弃 除 同 一 试 验, 所 有 试 验 用 鱼 应 在 30min 内 分 组 完 毕 在 24h 48h 72h 和 96h 后 检 查 受 试 鱼 的 死 亡 状 况, 如 果 没 有 任 何 肉 眼 可 见 的 运 动, 如 腮 的 煽 动 碰 触 尾 柄 后 无 反 应 等, 即 可 判 断 该 鱼 已 死 亡, 观 察 并 记 录 死 鱼 数 目 后, 将 死 鱼 从 容 器 中 取 出 应 在 试 验 开 始 后 3h 或 6h 观 察 各 处 理 组 鱼 的 状 况, 并 记 录 实 验 鱼 的 异 常 行 为 ( 如 鱼 体 侧 翻 失 去 平 衡 游 泳 能 力 和 呼 吸 功 能 减 弱, 色 素 沉 积 等 ) 试 验 开 始 和 结 束 时 要 测 定 ph 值 溶 解 氧 和 温 度 试 验 期 间, 每 天 至 少 测 定 一 次 至 少 在 试 验 开 始 和 结 束 时, 测 定 试 验 容 器 中 试 验 液 的 受 试 物 浓 度 应 记 录 所 观 察 到 的 亚 致 死 效 应 (3) 极 限 试 验 在 进 行 鱼 类 毒 性 测 定 时, 可 以 进 行 浓 度 为 100mg/L 的 极 限 试 验 如 极 限 试 验 结 果 表 明 LC 5 0>100mg/L 可 直 接 给 出 试 验 结 果 及 评 价 :LC 5 0>100mg/L, 属 于 低 毒 极 限 试 验 至 少 使 用 七 尾 鱼, 与 对 照 自 使 用 的 鱼 数 目 相 等 二 项 式 理 论 表 明 : 表 明 10 尾 鱼, 无 一 死 亡 那 么 LC 5 0>100mg/L 的 概 率 为 99.9%; 使 用 7-9 尾 鱼, 无 一 死 亡, 那 么 LC 5 0>100mg/L 的 概 率 至 少 为 99% 如 果 试 验 与 发 生 死 亡, 则 应 按 本 方 法 前 述 试 验 操 作 (1) (2) 的 试 验 程 序 进 行 试 验 5. 质 量 保 证 与 质 量 控 制 1 试 验 结 束 时, 对 照 组 与 死 亡 率 不 得 超 过 10% 2 试 验 期 间, 试 验 溶 液 的 溶 解 氧 含 量 应 >60% 的 空 气 饱 和 值 3 试 验 期 间, 受 试 物 实 测 浓 度 不 能 低 于 设 置 浓 度 的 80% 如 果 试 验 期 间 受 试 物 实 测 浓 度 与 设 置 浓 度 相 差 超 过 20%, 则 以 实 测 受 试 物 浓 度 来 表 示 试 验 结 果 4 试 验 期 间, 尽 可 能 维 持 恒 定 条 件 如 果 有 必 要, 应 使 用 半 静 态 或 流 水 式 试 验 方 式 6. 数 据 与 报 告 (1) 数 据 处 理 1 已 暴 露 浓 度 为 横 坐 标, 死 亡 率 为 纵 坐 标, 在 计 算 机 或 对 数 - 概 率 坐 标 纸 上, 绘 制 暴 露 浓 度 对 死 亡 率 的 曲 线 用 直 线 内 插 法 或 常 用 统 计 程 序 计 算 出 24h 48h 72h 96h 的 LC 5 0 值, 并 计 算 95% 的 置 信 限 26

30 2 如 果 试 验 数 据 不 适 于 计 算 LC 5 0, 可 用 不 引 起 死 亡 的 最 好 浓 度 和 引 起 100% 死 亡 的 最 低 死 亡 浓 度 估 算 LC 5 0 的 近 似 值, 即 这 两 个 浓 度 的 几 何 平 均 值 (2) 结 果 评 价 鱼 类 急 性 毒 性 可 按 以 下 标 准 分 级 ( 表 5-3-5) 表 鱼 类 急 性 毒 性 分 级 标 准 96hLC 50 (mg/l) < >100 毒 性 分 级 极 高 毒 高 毒 中 毒 低 毒 (3) 编 写 报 告 试 验 报 告 应 包 括 : 实 验 名 称 目 的 试 验 原 理 试 验 的 准 确 起 止 日 期, 以 及 : 1) 受 试 物 质 : 对 于 化 学 品, 其 化 学 名 称 其 他 名 称 ( 商 品 名 等 ) 化 学 式 成 分 制 造 厂 商 批 号 纯 度 等 级 和 理 化 性 质 等 ; 对 于 废 水 或 环 境 样 品, 应 给 出 其 来 源 采 样 时 间 地 点 保 存 条 件 等 2) 试 验 用 鱼 : 实 验 用 鱼 名 称 学 名 品 系 大 小 来 源 驯 ( 养 ) 化 情 况 试 验 开 始 时 的 鱼 龄 规 格 等 3) 试 验 条 件 : 1 使 用 的 试 验 方 式, 如 静 态 半 静 态 或 流 水 式, 以 及 曝 气 承 载 量 等 2 试 验 溶 液 配 制 方 法, 如 果 使 用 助 溶 剂, 应 注 明 使 用 浓 度 及 对 受 试 物 的 毒 性 影 响 3 稀 释 用 水, 来 源 类 型 水 质 (ph 硬 度 碱 度 和 温 度 等 ) 4 试 验 容 器, 质 地 规 格 体 积 及 清 洗 情 况 5 试 验 溶 液, 体 积 浓 度 每 个 浓 度 组 平 行 数, 试 验 液 跟 更 换 情 况 更 换 方 法 流 动 情 况, 以 及 受 试 物 的 加 入 系 统 流 速 清 洗 周 期 及 方 法 受 试 物 的 规 定 浓 度, 实 测 浓 度 及 测 定 日 期 最 好 能 用 表 格 列 出 试 验 期 间 试 验 温 度 ph 值 溶 解 氧 的 全 部 实 测 值 6 每 一 试 验 浓 度 的 用 鱼 数 目 7 光 照, 如 光 的 性 质 强 度 周 期 4) 试 验 报 告 : 1 无 死 亡 发 生 (EC 0 ) 的 最 高 浓 度 2 导 致 100% 死 亡 (EC 100 ) 的 最 低 浓 度 324h 48h 72h 96h 时 的 每 个 浓 度 的 累 计 死 亡 率 424h 48h 72h 96h 的 LC 50, 及 其 95% 的 置 信 限 5 浓 度 死 亡 率 曲 线 图 6 确 定 LC 50 值 的 统 计 学 方 法 7 对 照 组 的 死 亡 率 8 试 验 期 间, 可 能 会 影 响 试 验 结 果 的 隐 患 9 鱼 的 异 常 反 应 5) 结 果 讨 论 27

31 附 录 D ( 规 范 性 文 件 ) 细 菌 回 复 突 变 试 验 ( 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 法, 简 称 :Ames 试 验 ) 1. 目 的 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 回 复 突 变 试 验 是 以 微 生 物 为 指 示 生 物 的 遗 传 毒 理 学 体 外 试 验, 遗 传 学 终 点 是 基 因 突 变, 用 于 检 测 受 试 物 能 否 引 起 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 基 因 碱 基 置 换 或 移 码 突 变 本 方 法 规 定 了 地 表 水 和 给 谁 的 样 品 采 集 预 处 理 的 方 法 和 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 回 复 突 变 试 验 的 基 本 技 术 要 求 2. 原 理 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 的 标 准 试 验 菌 株 为 组 氨 酸 缺 陷 型 突 变 型, 在 无 组 氨 酸 的 培 养 基 上 不 能 生 长, 在 有 组 氨 酸 的 培 养 基 上 可 以 正 常 生 长 诱 变 剂 (mutagen), 又 称 为 致 突 变 剂 或 致 突 变 物, 可 是 沙 门 氏 菌 组 氨 酸 缺 陷 突 变 型 回 复 突 变 为 野 生 型, 在 无 组 氨 酸 培 养 基 上 也 能 生 长 故 可 根 据 在 无 组 氨 酸 的 培 养 基 上 生 成 的 菌 落 数 量, 判 断 受 试 物 是 否 为 诱 变 剂 对 于 间 接 由 编 辑, 可 用 经 多 氯 联 苯 (PCB) 诱 导 的 大 鼠 肝 匀 浆 制 备 的 S-9 混 合 液 作 为 代 谢 活 化 系 统 3. 样 品 的 采 集 (1) 仪 器 设 备 条 件 采 样 瓶 为 棕 色 大 口 玻 璃 瓶, 瓶 盖 具 聚 四 氟 乙 烯 衬 垫, 或 在 样 品 无 腐 蚀 性 条 件 下 使 用 具 铝 箔 外 衬 的 橡 皮 塞 (2) 样 品 采 集 用 采 样 瓶 手 工 采 集 适 量 样 品, 地 表 水 和 废 水 样 品 要 完 全 充 满 容 器, 密 封, 并 于 2h 内 送 至 实 验 室, 尽 快 进 行 处 理 4. 地 表 水 和 废 水 样 品 预 处 理 (1) 仪 器 设 备 条 件 1 分 液 漏 斗 2 贮 水 器, 具 下 口 的 玻 璃 容 器 3 树 脂 柱 玻 璃 管, 高 不 低 于 10cm, 柱 管 直 径 与 柱 长 比 为 1:4~1:10 之 间 4 输 液 泵 5 旋 转 蒸 发 器 或 KD 浓 缩 器 6 高 纯 氮 气 (2) 试 剂 1 纯 水 : 符 合 GB 实 验 室 用 水 规 格 可 用 去 离 子 水 经 全 玻 璃 蒸 馏 器 蒸 馏 制 得 210mol/L 氢 氧 化 钠 溶 液 3(1:1) 硫 酸 溶 液 41mol/L 氢 氧 化 钠 溶 液 51mol/L 盐 酸 溶 液 6 二 氯 甲 烷 甲 醇 丙 醇 正 己 烷, 不 低 于 分 析 纯 级, 应 在 玻 璃 容 器 中 重 蒸 馏 后 方 能 使 用 28

32 7 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 8XAD-2 树 脂 或 等 效 的 大 孔 树 脂 : 树 脂 应 经 纯 水 及 甲 醇 漂 洗 后, 在 索 氏 提 取 器 中 分 别 用 甲 醇 二 氯 甲 烷 正 己 烷 丙 醇 提 取 8h, 去 除 有 机 物 净 化 后 的 树 脂 浸 于 甲 醇 中, 置 4 冰 箱 备 用 (3) 样 品 制 备 1) 有 机 物 的 分 离 提 取 : 1 有 机 物 分 离 提 取 前 的 样 品 预 处 理, 将 采 样 瓶 于 4 静 置 24h, 使 非 水 液 相 水 相 沉 积 固 相 分 离 水 相 按 下 述 原 则 处 理 : 地 表 水 中 悬 浮 物 的 量 低 于 5% 时 刻 直 接 进 行 有 机 物 的 大 孔 树 脂 提 取 ; 悬 浮 物 的 量 高 于 5% 地 表 水 及 废 水 进 行 有 机 物 的 液 - 液 提 取 2 有 机 物 的 液 - 液 提 取 : 取 二 份 1500ml 的 水 样 分 放 到 二 个 2000ml 分 液 漏 斗 中 用 10mol/L 氢 氧 化 钠 将 ph 值 调 至 11 向 每 个 分 液 漏 斗 中 加 入 150ml 二 氯 甲 烷, 振 荡 2min, 注 意 放 气 静 置 至 少 10min, 使 有 机 相 与 水 相 分 层, 分 出 有 机 相 再 各 用 100ml 二 氯 甲 烷 提 取 二 次 将 三 次 提 取 液 合 并 在 1000ml 烧 杯 中 如 有 机 相 与 水 相 建 的 乳 化 层 多 于 溶 剂 层 的 1/3, 可 离 心 以 达 到 两 相 的 分 层 用 (1:1) 硫 酸 溶 液 将 水 箱 的 ph 值 调 至 2 以 下 用 二 氯 甲 烷 150ml 100ml 100ml 分 三 次 进 行 溶 剂 提 取 将 这 三 次 提 取 的 有 机 相 也 并 入 1000ml 烧 瓶 中 3 有 机 物 的 大 孔 树 脂 分 离 提 取 : 将 净 化 后 的 树 脂 连 同 丙 酮 一 起 装 入 树 脂 柱, 树 脂 上 下 端 分 别 垫 盖 玻 璃 棉 排 去 柱 中 丙 酮, 用 纯 水 洗 柱 三 次 ( 注 意 每 次 不 能 把 试 剂 排 空 ) 使 水 样 流 经 树 脂 柱, 流 速 为 1~2 倍 柱 体 积 /min, 水 样 量 不 超 2000 倍 柱 体 积, 用 真 空 泵 抽 去 柱 中 水, 然 后 用 4~8 倍 柱 体 积 85:15 的 正 己 烷 丙 酮 和 8 个 柱 体 积 二 氯 甲 烷 分 别 三 次 浸 柱 以 洗 脱 有 机 物 浸 泡 时 间 为 每 次 10min 然 后 缓 缓 滴 流, 将 洗 脱 液 收 集 至 烧 瓶 中 4 提 取 液 浓 缩 : 使 用 旋 转 蒸 发 器 或 KD 浓 缩 器, 将 获 取 的 提 取 液 或 洗 脱 液 浓 缩 浓 缩 液 50% 供 重 量 分 析 或 化 学 分 析, 余 50% 继 续 浓 缩 至 1ml 5 溶 剂 置 换 : 于 40 水 浴, 用 氮 气 将 浓 缩 的 提 取 液 吹 干 加 入 适 量 DMSO 溶 解 提 取 物, 并 稀 释 备 用 6 样 品 量 计 算 结 果 的 表 示 : 样 品 预 处 理 所 得 水 相 体 积 或 经 树 脂 柱 水 样 的 体 积 以 L 表 示 有 机 提 取 物 的 重 量 以 mg 表 示 结 果 应 换 算 至 原 水 的 水 样 量 5. 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 回 复 突 变 试 验 (1) 仪 器 设 备 洁 净 工 作 台, 恒 温 培 养 箱, 恒 温 水 浴, 蒸 汽 压 力 锅, 匀 浆 器 等 实 验 室 常 用 设 备 低 温 高 速 离 心 机, 低 温 水 箱 (-80 ) 或 液 氮 罐 (2) 培 养 基 制 备 除 说 明 外, 培 养 基 成 分 或 试 剂 应 是 化 学 纯 或 分 析 纯 避 免 重 复 高 温 处 理, 注 意 保 存 温 度 和 期 限 1) 营 养 肉 汤 培 养 基 : 用 作 增 菌 培 养 牛 肉 膏 2.5g 胰 胨 ( 或 混 合 蛋 白 胨 ) 5.0g 氯 化 钠 2.5g 磷 酸 氢 二 钾 (K 2 HPO 4 3H 2 O) 1.3g 蒸 馏 水 至 500ml 加 热 溶 解, 调 ph 值 为 7.4, 分 装 后 0.103MPa 灭 菌 20min,4 保 存, 保 存 期 不 超 过 6 个 月 2) 营 养 肉 汤 琼 脂 培 养 基 : 用 作 基 因 型 (rfa 突 变,R 因 子,pAQ1 质 粒, uvrb) 鉴 定 琼 脂 粉 1.5g 29

33 营 养 肉 汤 培 养 基 100ml 加 热 融 化 后 调 ph 值 为 7.4,0.103MPa 灭 菌 20min 3) 底 层 培 养 基, 用 于 致 突 变 试 验 1V B 液 贮 备 液,50 磷 酸 氢 钠 铵 (NaNH 4 HPO 4 ) 17.5g 柠 檬 酸 (C 6 H 8 O 7 H 2 O) 10.0g 磷 酸 氢 二 钾 (K 2 HPO 4 ) 50.0g 硫 酸 镁 (MgSO 4 7H 2 O) 1.0g 加 蒸 馏 水 至 100ml,0.103MPa 灭 菌 20min 待 其 他 试 剂 完 全 溶 解 后, 再 将 硫 酸 镁 缓 慢 放 入 其 中 继 续 溶 解, 否 则 易 析 出 沉 淀 240% 葡 萄 糖 溶 液 : 葡 萄 糖 40.0g 加 蒸 馏 水 至 100ml,0.055MPa 灭 菌 20min 31.5% 琼 脂 培 养 基 : 琼 脂 粉 15g 蒸 馏 水 930ml 融 化 后 0.103MPa 灭 菌 20min 趁 热 (80 ), 以 无 菌 操 作 加 入 : V B 盐 贮 备 液 50 20ml 40% 葡 萄 糖 溶 液 50ml 充 分 混 匀, 待 凉 至 50 左 右 时 倒 入 培 养 皿, 每 皿 (Φ90mm)25ml,37 培 养 过 夜, 以 除 去 水 分 及 检 查 有 无 污 染 4) 顶 层 培 养 基 1 顶 层 琼 脂 : 琼 脂 粉 0.6g 氯 化 钠 0.5g 加 蒸 馏 水 至 100ml 0.103MPa 灭 菌 20min 20.5mmol/L 组 氨 酸 生 物 素 溶 液 : D 生 物 素 ( 分 子 量 244) 30.5mg L 盐 酸 组 氨 酸 (MW191.17) 23.9mg 加 蒸 馏 水 至 250ml,0.103MPa 灭 菌 20min 顶 层 培 养 基 制 备 : 加 热 融 化 顶 层 琼 脂, 每 100ml 顶 层 琼 脂 中 加 0.5mmol/L 组 氨 酸 生 物 素 溶 液 10ml 混 匀, 分 装 于 灭 菌 试 管, 每 管 2ml, 在 45 水 浴 中 保 温 5) 鉴 定 菌 株 基 因 型 用 试 剂 : 10.8% 氨 苄 青 霉 素 溶 液 ( 无 菌 配 制 ): 称 取 氨 苄 青 霉 素 40mg, 用 0.02mol/L 氢 氧 化 钠 溶 液 5ml 溶 解, 保 存 于 4 冰 箱 20.8% 四 环 素 溶 液 ( 无 菌 配 制 ): 称 取 40mg 四 环 素, 用 0.02mol/L 盐 酸 5ml 溶 解, 保 存 也 4 冰 箱 30.1% 结 晶 紫 溶 液 : 称 取 结 晶 紫 10mg, 溶 于 10ml 灭 菌 蒸 馏 水 4 组 氨 酸 D 生 物 素 板 : 1.5% 琼 脂 培 养 基 914ml V B 盐 贮 备 液 20ml 40% 葡 萄 糖 溶 液 50ml L 盐 酸 组 氨 酸 (0.4043g/100ml) 10ml D 生 物 素 溶 液 (0.02mol/L) 6ml 30

34 分 别 灭 菌 后, 全 部 合 并 (1000ml), 充 分 混 匀, 待 凉 至 50 左 右 时 倒 平 皿 6) 氨 苄 青 霉 素 平 板 ( 保 存 TA97,TA98,TA100 菌 株 的 主 平 板 ); 氨 苄 青 霉 素 四 环 素 平 板 ( 保 存 TA102 菌 株 的 主 平 板 ) 1.5% 琼 脂 培 养 基 914ml V B 盐 贮 备 液 20ml 40% 葡 萄 糖 溶 液 50ml L 盐 酸 组 氨 酸 (0.4043g/100ml) 10ml D 生 物 素 溶 液 (0.02mol/L) 6ml 0.8% 氨 苄 青 霉 素 溶 液 3.15ml 0.8% 四 环 素 溶 液 0.25ml( 氨 苄 青 霉 素 四 环 素 平 板 ) 分 别 灭 菌 或 无 菌 制 备, 注 入 1000ml 瓶 中, 充 分 混 匀, 待 凉 至 50 左 右 时 倒 平 皿 (3) 代 谢 活 化 系 统 的 制 备 1) 大 鼠 肝 S-9 的 诱 导 和 制 备 : 选 健 康 雄 性 成 年 SD 或 Wister 大 鼠, 体 重 150g 左 右, 周 龄 5~6 周 将 多 氯 联 苯 (Aroclor1254 或 国 产 五 氯 联 苯 ) 溶 于 玉 米 油 中, 浓 度 为 200mg/ml, 按 500mg/kg 体 重 一 次 腹 腔 注 射,5d 后 断 头 处 死 动 物, 取 出 肝 脏 称 重 后, 用 在 4 预 冷 的 0.15mol/L 氯 化 钾 溶 液 冲 洗 肝 脏 数 次 每 克 肝 ( 湿 重 ) 加 预 冷 的 0.15mol/L 氯 化 钾 溶 液 3ml, 用 消 毒 后 的 医 用 剪 刀 剪 碎 肝 脏, 用 匀 浆 器 ( 低 于 4000r/min,1~2min) 在 冰 浴 中 制 成 肝 匀 浆 以 上 操 作 需 注 意 无 菌 和 局 部 4 冷 环 境 将 肝 匀 浆 在 低 温 0~4 高 速 离 心 机,12000r/min 离 心 10min 吸 出 上 清 液 为 S-9 组 分, 分 装 保 存 于 液 氮 或 -80 低 温 S9 应 经 无 菌 检 查, 蛋 白 含 量 测 定 (Lowry 法 ) 及 见 解 诱 变 剂 鉴 定 其 生 物 活 性 合 格 2)S-9 混 合 液 的 配 制 : 10.4mol/L 氯 化 镁 1.65mol/L 氯 化 钾 : 称 取 MgCl 2 6H 2 O 8.1g,KCl 12.3g 加 蒸 馏 水 稀 释 至 100ml 0.103MPa 20min 灭 菌 或 过 滤 除 菌 20.2mol/L 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph7.4), 每 500ml 由 以 下 组 分 组 成 : 磷 酸 氢 二 钠 (Na 2 HPO g/500ml) 440ml 磷 酸 二 氢 钠 (NaH 2 PO 4 H2O 13.8g/500ml) 60ml 调 ph 值 至 7.4,0.103MPa 20min 灭 菌 或 过 滤 除 菌 310%S9 混 合 液 的 配 制 : 每 10ml 由 以 下 成 分 组 成, 临 用 时 配 制 灭 菌 蒸 馏 水 3.8ml 磷 酸 盐 缓 冲 液 (0.2mol/L,pH7.4) 5.0ml 1.65mol/L 氯 化 钾 -0.4mol/L 氯 化 镁 溶 液 0.2ml 葡 萄 糖 -6- 磷 酸 钠 (MW305.9,0.05mol/L) 40μmol 辅 酶 (MW765.4,0.05mol/L) 50μmol 肝 S9 液 1.0ml 混 匀, 置 冰 浴 待 用 在 4 以 下, 其 活 性 可 保 存 4-5h 当 日 使 用, 剩 余 的 S-9 混 合 液 废 气 (4) 受 试 生 物 1) 实 验 菌 株 : 采 用 四 株 鼠 伤 寒 沙 门 氏 突 变 型 菌 株 TA97 TA98 TA100 TA102 TA97 TA98 可 监 测 移 码 型 诱 变 剂 :TA100 可 检 测 碱 基 置 换 型 诱 变 剂 :TA102 检 测 移 码 型 和 碱 基 置 换 型 诱 变 剂 2) 增 菌 培 养 : 取 灭 菌 的 25ml 三 角 烧 瓶, 加 入 营 养 肉 汤 10ml, 从 试 验 菌 株 母 板 上 刮 取 少 量 细 菌, 接 种 至 肉 汤 中 37 振 荡 培 养 10h, 存 货 细 菌 密 度 可 达 (1-2) 10 9 /ml (5) 菌 株 鉴 定 和 保 存 31

35 四 种 标 准 试 验 菌 株 必 须 进 行 基 因 型 鉴 定 自 发 回 变 数 鉴 定, 以 及 对 鉴 别 性 诱 变 剂 的 反 应 鉴 定, 合 格 后 才 能 用 于 致 突 变 试 验 1) 菌 株 基 因 型 鉴 定 : 1 组 氨 酸 营 养 缺 陷 鉴 定 ( 组 氨 酸 需 求 试 验 ): 加 热 融 化 底 层 培 养 基 量 瓶 各 100ml 一 瓶 100ml 加 L- 盐 酸 组 氨 酸 溶 液 (0.5g/100ml)1 和 D- 生 物 素 溶 液 (0.5mmol/L)0.6ml; 一 瓶 100ml 加 D- 生 物 素 溶 液 (0.5mmol/L)0.6ml 充 分 混 匀, 待 凉 至 50 左 右 时 各 倒 平 皿 四 块, 即 分 别 为 组 氨 酸 - 生 物 素 平 板 和 生 物 素 平 板 去 组 氨 酸 - 生 物 素 平 板 和 生 物 素 平 板 各 一 块, 将 试 验 菌 株 在 此 两 组 培 养 基 上 划 线 接 种, 经 37 培 养 24-48h, 观 察 生 长 情 况 此 四 种 菌 株 应 在 组 氨 酸 - 生 物 素 平 板 上 生 长, 而 在 无 组 氨 酸 的 生 物 平 板 上 不 能 生 长 2 深 粗 糙 型 (rfa) 鉴 定 ( 结 晶 紫 抑 菌 试 验 ): 深 粗 糙 型 突 变 的 细 菌, 缺 失 脂 多 糖 屏 障, 因 此 分 子 量 较 大 的 物 质 能 进 入 菌 体 鉴 定 方 法 : 用 移 液 器 吸 0.1% 结 晶 紫 溶 液 20, 在 肉 汤 平 板 表 面 涂 成 一 条 带, 待 结 晶 紫 溶 液 干 后, 在 与 结 晶 紫 带 方 向 垂 直 化 纤 接 种 四 种 试 验 菌 株 经 37 培 养 24-48, 观 察 生 长 情 况 此 四 种 菌 株 在 结 晶 紫 溶 液 渗 透 区 出 现 抑 菌, 证 明 试 验 菌 株 有 rfa 突 变 3uvrB 缺 失 的 鉴 定 ( 紫 外 线 敏 感 试 验 ):uvrb 缺 失 即 切 除 修 复 系 统 缺 失 鉴 定 方 法 : 取 受 试 菌 液 在 营 养 肉 汤 琼 脂 平 板 上 划 线 用 黑 纸 覆 盖 培 养 皿 的 一 半, 然 后 再 15W 的 紫 外 线 灭 菌 灯 下, 距 离 33cm 照 射 8s 37 培 养 24h 对 紫 外 线 敏 感 的 三 个 菌 株 (TA97 TA98 TA100) 仅 在 没 有 照 射 过 的 一 半 生 长, 而 菌 株 TA102 在 没 有 照 射 过 的 一 半 和 照 射 过 的 一 般 均 能 生 长 4R 因 子 和 paq1 质 粒 的 鉴 定 : 四 个 试 验 标 准 菌 株 均 带 有 R 因 子, 具 有 抗 氨 芐 青 霉 素 的 特 性 TA102 菌 株 含 有 paq1 质 粒 具 有 抗 四 环 素 的 特 性 用 结 晶 紫 抑 菌 试 验 的 方 法, 在 二 个 肉 汤 平 板 上 分 别 滴 加 氨 芐 青 霉 素 溶 液 20μl( 浓 度 为 1mg/ml, 溶 于 0.02mol/LNAOH) 和 四 环 素 溶 液 20μl( 浓 度 为 0.08mg/ml, 溶 于 0.02mol/L HCl), 并 在 肉 汤 平 板 表 面 涂 成 一 条 带, 待 溶 液 干 后, 垂 直 划 线 接 种 四 种 试 验 菌 株 经 37 培 养 24-48h, 观 察 生 长 情 况 四 个 菌 株 生 长 应 不 受 氨 芐 青 霉 素 抑 制, 证 明 它 们 都 带 有 R 因 子 TA102 菌 株 生 长 应 不 受 四 环 素 抑 制, 证 明 带 有 paq1 质 粒 2) 自 发 回 变 数 测 定 : 取 已 融 化 并 在 45 水 浴 中 保 温 的 顶 层 培 养 基 一 管 (2ml), 加 入 测 试 菌 菌 液 0.1ml, 迅 速 混 匀, 倒 在 底 层 培 养 基 上, 转 动 平 皿 使 顶 层 培 养 基 军 训 分 布 在 底 层 上, 平 放 固 化 翻 转 平 板 于 37 培 养 48h, 观 察 结 果 计 数 回 变 菌 落 数 每 株 的 自 发 回 变 率 应 落 在 表 所 列 正 常 范 围 内 3) 对 鉴 别 性 诱 变 剂 的 反 应 : 试 验 菌 株 对 不 同 诱 变 剂 的 反 应 不 同, 应 该 在 有 合 没 有 代 谢 活 化 的 条 件 下 鉴 定 个 试 验 菌 株 对 诱 变 剂 的 反 应 可 按 下 述 的 点 试 验 或 平 皿 掺 入 试 验 的 方 法 进 行 各 试 验 菌 株 对 鉴 别 型 诱 变 剂 的 反 应 见 表 和 表 表 试 验 标 准 菌 株 生 物 学 特 性 鉴 定 标 准 菌 株 基 因 型 自 发 回 变 菌 组 氨 酸 缺 陷 脂 多 糖 屏 障 抗 氨 芐 抗 四 环 素 uvrb 修 复 落 数 缺 失 青 霉 素 缺 陷 TA97a TA TA TA 注 : + 表 示 需 要 + 表 示 有 抑 制 + 表 示 具 + 表 示 具 有 + 表 示 无 修 组 氨 基 酸 带 有 R 因 子 pqa1 质 粒 复 能 力 32

36 表 鉴 别 性 致 突 变 物 在 点 试 中 试 验 结 果 诱 变 剂 剂 量 S-9 TA97 TA98 TA100 TA102 柔 毛 毒 素 5.0μg 叠 氮 钠 1.0μg ICR μg 丝 裂 霉 素 C 2.5μg inh inh ++ 2,4,7- 三 硝 基 芴 酮 0.1μg - inh 硝 基 -o- 苯 澄 二 胺 20.0μg 硝 基 喹 啉 -N- 氧 化 物 10.0μg 甲 基 磺 酸 甲 酯 2.0μl 敌 克 松 50.0μg 氨 基 芴 20.0μg 甲 基 硝 基 亚 硝 基 胍 2.0μg 注 : 每 皿 或 变 菌 落 数 ( 扣 除 自 发 回 变 ) 的 符 号 :-<20; ; ; ;++++>500 柔 毛 霉 素 和 叠 氮 钠 溶 解 在 水 中, 其 他 所 有 化 合 物 溶 解 在 DMSO 中 ICR-191 为 2- 甲 氧 基 -6- 氯 代 -9-(3-(2- 氯 乙 基 ) 氨 基 丙 胺 ) 丫 啶 2 盐 酸 Inh 表 示 因 毒 性 引 起 的 生 长 抑 制 表 鉴 别 性 致 突 变 物 在 平 板 掺 入 法 中 试 验 结 果 诱 变 剂 剂 量 S-9 TA97 TA98 TA100 TA102 柔 毛 毒 素 5.0μg 叠 氮 钠 1.0μg ICR μg 链 黑 霉 素 0.25μg - Inh Inh Inh 2230 丝 裂 霉 素 C 2.5μg - Inh Inh Inh ,4,7- 三 硝 基 芴 酮 0.1μg 硝 基 -o- 苯 澄 二 胺 20.0μg 硝 基 喹 啉 -N- 氧 化 物 10.0μg 甲 基 磺 酸 甲 酯 2.0μl

37 敌 克 松 50.0μg 氨 基 芴 20.0μg 甲 基 硝 基 亚 硝 基 胍 2.0μg 注 : 表 中 回 变 菌 落 数 取 自 于 剂 量 反 应 曲 线 的 线 性 部 分, 并 已 扣 去 了 对 照 值 4) 菌 株 保 存 : 1 鉴 定 合 格 的 菌 种 应 加 入 DMSO 作 为 冷 冻 保 护 剂, 保 存 在 -80 或 液 氮 (-196 ), 或 者 冰 冻 干 燥 制 成 干 粉,4 保 存 2 主 平 板 保 存 : 作 主 平 板 保 存 时, 将 菌 落 划 线 接 种 于 主 平 板 上, 孵 育 24h 后 保 存 于 4 冰 箱 中 TA97 TA98 TA100 菌 株 保 存 在 氨 芐 青 霉 素 主 平 板 上, 可 使 用 二 个 月 TA102 菌 株 的 氨 芐 青 霉 素 - 四 环 素 住 平 板 上, 可 保 存 二 周 应 按 时 从 保 存 的 主 平 板 上 移 菌, 制 备 新 的 主 平 板 (6) 实 验 程 序 1) 实 验 设 计 : 受 试 物 最 低 剂 量 为 每 平 皿 0.1μg, 最 高 剂 量 为 5mg, 或 出 现 沉 淀 的 剂 量 或 对 细 菌 产 生 最 小 毒 性 剂 量 一 般 选 用 4-5 个 剂 量, 进 行 剂 量 - 反 应 关 系 研 究, 每 个 剂 量 应 由 三 个 平 行 板 容 积 可 选 用 用 二 甲 基 亚 砜 ( 每 皿 不 超 过 0.4ml) 或 其 他 溶 剂 每 次 试 验 应 有 同 时 进 行 的 阳 性 对 照 和 阴 性 ( 溶 剂 ) 对 照 2) 方 法 和 步 骤 : 试 验 方 法 有 平 板 掺 入 法 和 点 试 法 一 般 先 用 点 试 法 作 预 试 验, 以 了 解 受 试 物 对 沙 门 氏 菌 的 毒 性 个 可 能 的 致 突 变 性, 平 板 掺 入 法 是 标 准 试 验 方 法 1 平 板 掺 入 法 : 在 底 层 培 养 平 皿 上 写 上 记 号 取 已 融 化 在 45 o C 水 浴 中 保 温 的 顶 层 培 养 基 一 管 (2ml), 依 次 加 入 受 试 物 溶 液 0.1ml, 测 试 菌 菌 液 ml( 需 活 化 时 加 10%S-9 混 合 液 0.5ml), 迅 速 混 匀, 倒 在 底 层 培 养 基 上, 转 动 平 皿 使 顶 层 培 养 基 均 匀 分 布 在 底 层 上 平 放 固 化 后, 将 平 板 翻 转, 置 37 o C 培 养 48h 观 察 结 果 2 点 试 法 : 在 底 层 培 养 平 皿 上 写 上 记 号 取 已 融 化 并 在 45 o C 水 浴 中 保 温 的 顶 层 培 养 基 一 管 (2ml), 加 入 测 试 菌 菌 液 ml( 需 活 化 时 加 10%S-9 混 合 液 0.5ml), 迅 速 混 匀, 倒 在 底 层 培 养 基 上, 倾 斜 平 皿 使 顶 层 培 养 基 均 匀 分 布 在 底 层 上, 平 放 固 化 取 无 菌 滤 纸 圆 片 ( 直 径 6mm), 小 心 放 在 已 固 化 的 顶 层 培 养 基 的 适 当 位 置 上, 用 移 液 器 取 适 量 受 试 物 ( 如 10μl), 点 在 纸 片 上, 或 将 少 量 固 体 受 试 物 洁 净 夹 道 智 商 或 琼 脂 表 面, 将 平 板 翻 转, 置 37 o C 培 养 48h 观 察 结 果 6. 质 量 保 证 应 对 水 养 预 处 理 和 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 致 突 变 试 验 进 行 质 量 控 制 1 设 置 阴 性 对 照, 即 用 纯 水 代 替 水 样, 完 成 后 样 品 制 备 全 过 程 用 所 得 浓 缩 物 作 为 阴 性 溶 剂 对 照 2 设 置 阳 性 对 照, 用 适 当 剂 量 的 阳 性 对 照 物 经 历 样 品 制 备 全 过 程 3 致 突 变 试 验 标 准 菌 株 应 鉴 定 合 格, 试 验 应 设 置 平 行 样 7. 数 据 与 报 告 (1) 数 据 处 理 结 果 以 均 数 ± 标 准 差 表 达 利 用 适 当 的 统 计 学 方 法 处 理 数 据 了 (2) 结 果 评 价 1 点 试 法 : 凡 在 点 样 纸 片 周 围 长 出 一 圈 密 集 的 his+ 回 变 菌 落 者, 该 受 试 物 即 为 诱 变 剂, 如 只 在 平 板 上 出 现 少 数 散 在 的 自 发 回 变 菌 落 则 为 阴 性, 如 在 滤 纸 片 周 围 见 到 抑 菌 圈, 说 明 受 试 物 具 有 细 菌 毒 性 2 掺 入 法 计 数 培 养 基 上 的 会 变 菌 落 数 如 在 背 景 生 长 良 好 条 件 下, 受 试 物 每 皿 回 变 菌 落 数 等 于 或 大 于 阴 性 对 照 数 的 2 倍, 并 有 剂 量 - 反 应 关 系 : 或 至 少 某 一 测 试 点 有 重 复 的 并 有 统 34