SurePAGE TM 10 8 预制胶版本 : Ⅰ 简介 1 Ⅱ 凝胶选择指导 2 Ⅲ 兼容的电泳槽 4 Ⅳ 预制胶使用简介 4 Ⅴ 凝胶染色 9 Ⅵ Western Blot 操作步骤.. 10 Ⅶ Dot Blot 操作步骤 11 Ⅷ 凝胶实例 12 Ⅸ 问题分析及解决方法 13

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亲胥
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1 SurePAGE TM 10 8 预制胶版本 : Ⅰ 简介 1 Ⅱ 凝胶选择指导 2 Ⅲ 兼容的电泳槽 4 Ⅳ 预制胶使用简介 4 Ⅴ 凝胶染色 9 Ⅵ Western Blot 操作步骤.. 10 Ⅶ Dot Blot 操作步骤 11 Ⅷ 凝胶实例 12 Ⅸ 问题分析及解决方法 13 X 相关产品和订购信息 14 I. 简介金斯瑞 SurePAGE 预制胶是 Express Plus 的升级产品, 它是一款高性能的小型聚丙烯酰胺凝胶, 能满足客户上样量大的需求其独特的胶板设计可以提高条带分辨率, 改善样品在上样孔里的分布状态, 使得条带更加均匀该预制胶为 Bis-Tris 凝胶缓冲系统, 比常规的 Tris-Glycine 系统具有更强的缓冲能力, 于 ph6.4 的弱酸性条件下灌注, 能够更好地减少聚丙烯酰胺的降解, 提高凝胶稳定性 SurePAGE 预制胶不含有 SDS, 依赖于采用合适的电泳缓冲液和相应试剂, 是 SDS-PAGE 和非变性凝胶电泳的理想材料依赖特有的灌注技术可以保证预制胶批次间稳定性和条带分布一致性 SurePAGE 预制胶配套使用 Tris-MOPS 或 Tris-MES 电泳缓冲液, 能够实现高效可靠地分离蛋白质, 便于后续染色或转膜检测 SurePAGE 预制胶提供不同浓度的梯度胶和固定浓度胶梯度胶的浓度包括 4-20% 4-12% 和 8-16%; 固定浓度胶包括 8% 10% 和 12% 每种浓度的预制胶都有 10 个点样孔 12 个点样孔和 15 个点样孔三种规格胶板尺寸 : 长宽高为 mm; 凝胶尺寸 : 长宽厚为 mm 主要特点 : 快速电泳 : 最快 18 min 完成电泳胶韧性强 : 电泳或染色操作时不易碎分辨率高 : 电泳条带更加清晰锐利上样量大 : 最高上样量为 80 µl 常温储存 : 常温 28 左右可保存半年以上重复性高 : 不同批次预制胶的一致性好物美价廉 : 节约实验成本 1

2 II. 凝胶选择指导表 1. 凝胶选择指导产品编号丙烯酰胺浓度孔数上样孔体积电泳缓冲液转移缓冲液分离范围 M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda M % μl MOPS, MES Tris-Bicine kda 2

3 下图的蛋白迁移表可以帮助您选择合适的凝胶进行蛋白电泳表 2. 蛋白电泳迁移表 3

4 III. 可兼容电泳槽 SurePAGE 预制胶可兼容以下电泳槽 : IV. SurePAGE 预制胶的使用简介 A. 电泳缓冲液和电泳槽的准备 1. 取一包电泳缓冲液粉末 (Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder, 产品编号 :M00138) 溶解在 1 L 的去离子水中制成 1 电泳缓冲液 2. 将 SurePAGE 预制胶从包装袋中取出, 撕掉胶板底部的胶带 ( 见图 1) 图 1. 撕下胶板底部胶带 3. 平稳地将梳子从胶板中推出 ( 见图 2) 4

5 图 2. 将梳子从胶板中推出 4. 将胶板放入凝胶电泳装置中请参阅电泳装置制造商的使用说明 Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System 电泳槽的使用注意事项 : 将电泳槽内框架的绿色硅橡胶密封条取出, 然后将其平坦的一面朝外并重新插回内框架的凹槽中 ( 见图 3) 图 3. SurePAGE 预制胶在 Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System 电泳槽中的使用 5

图 4. SurePAGE 预制胶在 Bio-Rad 电泳槽的使用 5. 在电泳槽的内槽中倒入足够的 1 MOPS 或 MES 电泳缓冲液使其覆盖上样孔 5-7 mm, 在外槽中加入相同的电泳缓冲液以确保适当的冷却为了获得最好的效果, 外槽的缓冲液需要加到与内槽持平的位置或稍低, 但不可漫过胶板 ( 注意 :1. 相对于 MOPS 电泳缓冲液来说,MES 更适合用于小蛋白的分离 ;2.

6 图 4. SurePAGE 预制胶在 Bio-Rad 电泳槽的使用 5. 在电泳槽的内槽中倒入足够的 1 MOPS 或 MES 电泳缓冲液使其覆盖上样孔 5-7 mm, 在外槽中加入相同的电泳缓冲液以确保适当的冷却为了获得最好的效果, 外槽的缓冲液需要加到与内槽持平的位置或稍低, 但不可漫过胶板 ( 注意 :1. 相对于 MOPS 电泳缓冲液来说,MES 更适合用于小蛋白的分离 ;2.Tris-Glycine 电泳缓冲液与 SurePAGE 预制胶的 Bis-Tris 缓冲系统不兼容, 请不要使用 ) 6. 使用注射器或其他工具吸取适量 1 的电泳缓冲液, 将上样孔轻轻冲洗干净, 去除气泡和残留的储存缓冲液 B. 样品的制备为了获得更好的结果, 建议使用 4X LDS sample buffer (M00676) 替换常规 5x sample buffer (MB01015) 请参考下表和步骤制备样品表 3. 样品制备样品 x 4X LDS sample buffer 2.5 µl 1M DTT (10X) 1 µl 去离子水加至 10 µl 将以上混合液置于 70 C 孵育 10 分钟, 然后上样 6

Tris base MES SDS EDTA 去离子水表 4. 1x MES 电泳缓冲液配方 : 6.06 g 9.76 g 1.0 g 0.3 g 加至 1000 ml Tris base MOPS SDS EDTA 去离子水表 5. 10x MOPS 电泳缓冲液配方 : 60.6 g 104.6 g 10.0 g 3.

7 Tris base MES SDS EDTA 去离子水表 4. 1x MES 电泳缓冲液配方 : 6.06 g 9.76 g 1.0 g 0.3 g 加至 1000 ml Tris base MOPS SDS EDTA 去离子水表 5. 10x MOPS 电泳缓冲液配方 : 60.6 g g 10.0 g 3.0 g 加至 1000 ml 注意事项 : 金斯瑞提供的电泳缓冲液粉末含有 SDS, 所以不适合非变性电泳 SurePAGE 预制胶的 ph 为 6.4, 不含 SDS 可用于酸性蛋白 (pi<6.4) 的非变性电泳, 但不能用于碱性蛋白的非变性电泳要想获得理想的电泳结果, 需要您对样品蛋白的结构做分析, 对电泳时间和电泳缓冲液的 ph 做一个摸索 C. 电泳过程蛋白质样品上样让上样枪头的尖端垂直插入到上样孔中能够获得最佳的上样效果, 枪头不能戳破胶体, 更不能使胶板变形导致样品漏孔 ( 见图 5) 图 5. 上样方法 7

注意事项 : 最佳上样量必须通过实验来确定, 样品过量会导致条带的拖尾和失真加入过量的含自由状态碳水化合物的蛋白, 可能会导致条带变形或者蛋白无法穿入胶中 ( 见故障诊断 ) 将电泳槽盖子盖好, 并将电源线插头插入电泳仪电源插孔 ( 红对红, 黑对黑 ), 在 200 V

一块 SurePAGE 预制胶的电泳参数 Running Buffer Voltage Started Current Finished Current Run Time per Gel* MOPS 200V 95-120mA 35-55mA 30-45min MES

电泳时间可能会改变, 取决于电源和凝胶浓度 D. 从胶板中取出凝胶 ( 见图 6) a. 电泳结束后, 根据电泳槽制造商的使用说明从电泳槽中取出预制胶 b. 通过撬具或其他合适的工具小心的插入到胶板之间的空隙 c.

8 注意事项 : 最佳上样量必须通过实验来确定, 样品过量会导致条带的拖尾和失真加入过量的含自由状态碳水化合物的蛋白, 可能会导致条带变形或者蛋白无法穿入胶中 ( 见故障诊断 ) 将电泳槽盖子盖好, 并将电源线插头插入电泳仪电源插孔 ( 红对红, 黑对黑 ), 在 200 V 电压下电泳分钟直至溴酚蓝条带跑到凝胶底部 ( 见表 3) 表 6. 一块 SurePAGE 预制胶的电泳参数 Running Buffer Voltage Started Current Finished Current Run Time per Gel* MOPS 200V mA 35-55mA 30-45min MES 200V mA 50-70mA 25-35min * 凝胶的电泳时间取决于实验室的温度, 这些电泳时间是依据实验室中 20 的 MOPS MES 缓冲液得来的重要注意事项 : 确保使用兼容的电泳槽, 内外槽之间液体的泄漏会导致低迁移率 ( 见故障诊断 ) 电泳时间可能会改变, 取决于电源和凝胶浓度 D. 从胶板中取出凝胶 ( 见图 6) a. 电泳结束后, 根据电泳槽制造商的使用说明从电泳槽中取出预制胶 b. 通过撬具或其他合适的工具小心的插入到胶板之间的空隙 c. 用撬具慢慢地上下撬动胶板, 重复上述操作, 撬动上中下三个不同的位置, 直至胶板两侧被完全分开注意小心并最好佩戴护目镜, 以免发生人身伤害 d. 打开之后, 凝胶可能粘在胶板的任意一侧, 将无凝胶的胶板取下, 将有凝胶的胶板上有胶一侧浸入水中贴着水面, 胶板倾斜轻轻提起, 凝胶掉入水中后, 将凝胶从水中取出进行染色 ( 使用后的胶板和梳子请以医疗垃圾或实验废弃物处置, 不可投入生活垃圾桶中 ) 图 6. 打开胶板取出凝胶 E. 储存 SurePAGE 预制胶储存温度为 2-25, 如果 2-8 保存, 可保存 12 个月 8

9 V. 凝胶染色所有标准 SDS 染色流程均适用金斯瑞 SurePAGE 预制胶当使用市售染色剂和设备, 请参考说明书 A. 考马斯亮蓝 R-250 使用微波炉染色 : 1. 配制染色液 : 在 40% 乙醇和 10% 醋酸溶液中溶解终浓度为 0.1% (W/V) 的考马斯亮蓝 R 配制脱色液 : 将终浓度为 10%(V/V) 乙醇 7.5%(V/V) 醋酸溶解在一起 3. 电泳完成后, 撬开胶板取出凝胶, 然后放入装有 100 ml 染色液的染色容器中 4. 盖上容器盖子并放入微波炉中用高热档位加热 8 分钟为了避免危险, 请注意不要让溶液沸腾 5. 从微波炉中取出染色容器, 放在脱色摇床上常温轻摇 5 分钟 6. 倒掉染色液并用去离子水小心清洗凝胶 7. 倒掉去离子水, 并加入 100 ml 脱色液 8. 盖上盖子, 放入微波炉中用高热档位加热 8 分钟 9. 倒掉脱色液, 加入新的脱色液, 重复步骤从微波炉中取出, 放在脱色摇床上常温轻轻震荡至背景清晰 B. 考马斯亮蓝 R-250 常规染色 : 1. 配制染色液 : 在 40% 乙醇和 10% 醋酸溶液中溶解终浓度为 0.1% (W/V) 的考马斯亮蓝 R 配制脱色液 : 将终浓度为 10%(V/V) 乙醇 7.5%(V/V) 醋酸溶解在一起 3. 电泳完成后, 撬开胶板取出凝胶, 然后放入装有 100 ml 染色液的染色容器中 4. 放于摇床上轻摇 1 小时 5. 倒掉染色液并用去离子水小心清洗凝胶 6. 倒掉去离子水, 并加入 100 ml 脱色液 7. 放于摇床上轻摇 1 小时 8. 更换新鲜脱色液, 继续放于摇床上脱色 1 小时 9. 重复步骤 7 8 一次 10. 更换新鲜脱色液, 放于摇床上过夜脱色至次日背景清晰 C. estain 染色设备 ( 产品编号 :L00657C) 金斯瑞 estain L1 蛋白快速染色系统采用金斯瑞专利染色技术, 非常适合 SurePAGE 系列预制胶的染色脱色实验条带清晰, 重复性好,10 分钟轻松完成详情请见官方网站产品页面 9

10 VI. Western Blot 操作步骤 1. 转膜您可以选择传统湿转或者 eblot 快速湿转仪 ( 产品编号 : L00686) 来进行蛋白转膜 A. 传统湿转 1) 用剪刀剪出与海绵大小相仿的滤纸 1 张和 PVDF 膜 1 张, 在 PVDF 膜一角用铅笔标记 2) 用甲醇活化 PVDF 膜后, 再用转移缓冲液 (M00139) 将滤纸和 PVDF 膜浸泡 3) 向托盘中加入转移缓冲液 ( 产品编号 :M00139), 放入海绵 PVDF 膜滤纸和转膜夹 4) 转膜夹的黑色板上先铺一块海绵, 再铺滤纸和凝胶对齐后用玻璃棒赶净气泡 5) 用微量移液器取少量转移缓冲液放在凝胶后铺上 PVDF 膜, 再铺滤纸和海绵对齐后用玻璃棒赶净气泡 6) 将转膜夹夹紧固定后, 黑面对黑面放入转膜固定装置中 7) 将转膜固定装置和装有冰块的冰盒放在转膜槽中用转移缓冲液注满转移槽 8) 接通电源, 一般恒压 100 V-110 V,1 小时左右 ; 小分子量的可以适当缩短时间 ; 或者恒压 30 V, 4 转膜过夜 ; 或者恒流 300 ma,1 小时左右 B. eblot 快速湿转仪使用 eblot 快速湿转仪时, 请您参考快速湿转仪说明书中的操作步骤进行实验, 只需 9-17 min 即可完成蛋白转膜实验 2. 封闭及抗体孵育您可以选择传统方法或者 ONE-HOUR Western blot 试剂盒来进行封闭及抗体孵育 A. 传统方法操作步骤如下 : 1) 关闭电源, 打开转膜夹将 PVDF 膜取出, 用双蒸水冲洗 2) 将 PVDF 膜放在封闭液中, 摇床上 37 封闭 1 小时 3) 弃去封闭液, 用 PBST 缓冲液洗涤, 用一抗工作液孵育, 摇床上 37 孵育 1 小时 4) 弃去一抗工作液, 用 PBST 缓冲液洗涤, 用二抗工作液孵育, 摇床上 37 孵育 1 小时 5) 弃去二抗工作液, 用 PBST 缓冲液洗涤摇床上洗膜 4 次, 每次 5 分钟 B.ONE-HOUR Western Blot 试剂盒关于操作步骤, 请您参考 ONE-HOUR Western blot 试剂盒说明书中的步骤进行实验 3. 显影曝光操作步骤如下 : 10

11 1) 用平板纸吸去膜上残余液体, 将 PVDF 膜平放 2) 用微量移液器取等体积的 ECL 试剂中的 A 液和 B 液放在 EP 管仲恢复至室温 3) 混合后均匀地加到膜上, 避光反应秒 4) 弃去 ECL 混合液置于暗盒中曝光显影, 曝光时间控制在 30 秒左右 VII. Dot Blot 操作步骤操作步骤如下 : 1) 用 PBS 缓存液配制 5 ng,2.5 ng,1.25 ng,0.625 ng, ng 和 0 ng His 标签蛋白, 放在 EP 管中 2) 用微量移液器将 2 μl 的不同浓度 His 标签蛋白点到膜上 3) 将点样后的膜放在 37 恒温培养箱中孵育 30 分钟 4) 将膜放在封闭液中, 摇床上 37 封闭 30 分钟 5) 弃去封闭液, 用 PBST 缓冲液洗涤, 用一抗工作液孵育, 摇床上 37 孵育 1 小时 6) 弃去一抗工作液, 用 PBST 缓冲液洗涤, 用二抗工作液孵育, 摇床上 37 孵育 1 小时 7) 弃去二抗工作液, 用 PBST 缓冲液洗涤摇床上洗膜 4 次, 每次 5 分钟 8) 用平板纸吸去膜上残余液体, 将膜平放 9) 用微量移液器取等体积的 ECL 试剂中的 A 液和 B 液放在 EP 管中恢复至室温 10 ) 混合后均匀地加到膜上, 避光反应秒 11 ) 弃去 ECL 混合液置于暗盒中曝光显影, 曝光时间控制在 30 秒左右表 7. Western/Dot Blot 缓冲液配方配方名称配方内容封闭液 PBS 缓冲液 PBST 缓冲液 5 g 脱脂奶粉,100 ml PBS 3.5 g Na2HPO4 12H2O,0.26 g NaH2PO4 2H2O,8.5 g NaCl, 加 ddh2o 至 1 L 0.5 ml 吐温 -20,1000 ml PBS 11

VIII. 凝胶实例 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 图 7.

12 VIII. 凝胶实例图 % Bis-Tris, 10x8 SurePAGE 预制胶蛋白分离效果图 12 孔 4-12% SurePAGE 预制胶 (L) 与 12 孔 4-12% SurePAGE 预制胶 (R) 蛋白分离效果图, 选用 estain 蛋白染色系统 (R-250) 进行染色 (L): 泳道 1, 3, 5, 7, 9, 11: 4 μl Color Prestained Protein Standard, Broad Range (11-245KDa) (P7712S); 泳道 2, 4, 6, 8, 10, 12: 6 μl E.coli 细胞裂解液 (R): 泳道 1, 2, 3, 4, 12: 4 μl GenScript PAGE-MASTER Protein Standard (for SDS- PAGE) (M00516); 泳道 5, 6, 7, 8: 6 μl E.coli 细胞裂解液 ; 泳道 9, 10, 11: 50 ng, 25 ng, 12.5 ng BSA 12

13 IX. 问题分析及解决方法问题可能原因解决方法条带弯曲上样孔或者凝胶与胶板间存在以注射器或者其他工具用电泳缓冲液冲刷上样气泡孔条带拖尾样本难溶或者含有弱电解质 ( 如碳水化合物 ) 胶浓度错误在 SDS 存在下加热样品, 离心后取上清液上样参照蛋白质迁移表选择合适凝胶条带分辨率低样品条带在凝胶中扩散状溴酚蓝前沿变黄电泳时间过长溴酚蓝前沿附近条带模糊或条带与预期不符电压无法达到设定值凝胶与胶板间出现大量气泡蛋白上样量达不到样品孔的最大体积上样量过载电泳缓冲液不足, 无法降温样品含盐类过多电泳缓冲液从变形损坏的胶板渗入 ph 值下降胶带未撕电泳条件有误凝胶中离子干扰 ( 分析小分子蛋白时容易出现 ) 电泳时内外槽漏液样品中其他盐类干扰电泳缓冲液过热上样不够仔细或太快减少上样量, 单孔总蛋白量不超过 50 μg 外槽的电泳缓冲液增加至与上样孔底部大致齐平, 以改善散热采用透析或者超滤除盐选用合适的电泳槽, 确认胶板是否破损用去离子水重新配置电泳缓冲液撕掉胶板下方胶带使用固定电压和自动电流, 如 :140V 恒压条件进行电泳使用 MES 电泳缓冲液电泳更长时间或者忽略使用合适的电泳槽使用透析或超滤除盐 4 C 时电泳在外槽添加更多的电泳缓冲液需比较慢且小心地上样 13

14 X. 相关产品和订购信息产品产品编号 5x Sample Buffer MB01015 Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder M00138 Transfer Buffer Powder M00139 Smart Advanced Broad-Range Protein Standard M00441 Smart Dual Color Pre-Stained Protein Standard M00442 Smart Multi Color Pre-Stained Protein Standard M00443 Protein Marker for Fluorescent Western Blotting M00124 High Range EasyWestern Protein Standard M00276 PAGE-MASTER Protein Standard (for SDS-PAGE) M00516 PAGE-MASTER Protein Standard Plus MM WB-MASTER Protein Standard M00521 estain L1 蛋白染色仪 L00657C THE His Tag Antibody, mab, Mouse A MonoRab DYKDDDDK Tag Antibody, mab, Rabbit A Mouse Anti-Rabbit IgG Antibody (M205) [HRP], mab A eblot L1 快速湿转仪 L00686 ONE-HOUR Western Standard Kit (Mouse) L00205 南京金斯瑞生物科技有限公司江苏省南京市江宁区科学园雍熙路 28 号订购电话 : 或 Web: For Research Use Only 14

ExpressPlus TM 10 8 预制胶技术手册 No. TM0645 版本 : Ⅰ 简介 1 Ⅱ 凝胶选择指导 2 Ⅲ 兼容的电泳槽 3 Ⅳ 预制胶使用简介 4 Ⅴ 凝胶染色 10 Ⅵ 蛋白转印 11 Ⅶ 凝胶实例 11 Ⅷ 问题分析及解决方法 12 Ⅸ 相关产品和订购信

ExpressPlus TM 10 8 预制胶技术手册 No. TM0645 版本 : Ⅰ 简介 1 Ⅱ 凝胶选择指导 2 Ⅲ 兼容的电泳槽 3 Ⅳ 预制胶使用简介 4 Ⅴ 凝胶染色 10 Ⅵ 蛋白转印 11 Ⅶ 凝胶实例 11 Ⅷ 问题分析及解决方法 12 Ⅸ 相关产品和订购信 ExpressPlus TM 10 8 预制胶技术手册 No. TM0645 版本 : 05312017 Ⅰ 简介 1 Ⅱ 凝胶选择指导 2 Ⅲ 兼容的电泳槽 3 Ⅳ 预制胶使用简介 4 Ⅴ 凝胶染色 10 Ⅵ 蛋白转印 11 Ⅶ 凝胶实例 11 Ⅷ 问题分析及解决方法 12 Ⅸ 相关产品和订购信息 13 I. 简介金斯瑞 ExpressPlus TM 预制胶是一款高性能的小型聚丙烯酰胺凝胶, 能满足客户上样量大的需求

SurePAGE TM 10 8 预制胶 版本 : Ⅰ 简介 1 Ⅱ 凝胶选择指导 2 Ⅲ 兼容的电泳槽 4 Ⅳ 预制胶使用简介 4 Ⅴ 凝胶染色 9 Ⅵ Western Blot 操作步骤.. 10 Ⅶ Dot Blot 操作步骤 11 Ⅷ 凝胶实例 12 Ⅸ 问题分析及解决方法 13

SurePAGE TM 10 8 预制胶版本 : Ⅰ 简介 1 Ⅱ 凝胶选择指导 2 Ⅲ 兼容的电泳槽 4 Ⅳ 预制胶使用简介 4 Ⅴ 凝胶染色 9 Ⅵ Western Blot 操作步骤.. 10 Ⅶ Dot Blot 操作步骤 11 Ⅷ 凝胶实例 12 Ⅸ 问题分析及解决方法 13