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1 Co NTA Beads 6FF 目录 1. 产品介绍纯化流程填料再生问题及解决方案订购信息及相关产品产品介绍 Co NTA Beads 6FF 可以从原核和真核表达系统中一步纯化 His 标签蛋白该产品是以高度交联的 6% 琼脂糖凝胶为基质, 配体以四配位键螯合钴 Co NTA Beads 6FF 相比 Ni NTA Beads 6FF 对 His 标签蛋白具有更高的选择性具体性能见表 1 表 1. Co NTA Beads 6FF 的产品性能性能指标基质高度交联的 6% 琼脂糖凝胶螯合离子 Co 2+ 载量 (/ml 基质 ) >20mg 6 His-tagged protein 微球粒径 (μm) 最大压力 0.3 MPa, 3 bar 储存缓冲液含 20% 乙醇的 1XPBS 储存温度 4 C-30 C Co NTA Beads 6FF 可以耐受一定范围的变性剂和其他的添加剂, 如表 2 表 2. Co NTA Beads 6FF 试剂耐受情况试剂种类浓度还原剂 10 mm β-mercaptoethanol 1 变性剂 8 M urea 6 M Gua-HCl 去污剂 <1% Triton X-100 1% NP-40 1% CHAPS,SDS, sarcosyl 其他类 500 mm imidazole at ph7.0 to 8.0 for elution 30% ethanol 2 20% glycerol 500 mm KCl 1.0 M NaCl 1 / 6 常州天地人和生物科技有限公司

2 20mM MES 50 mm Tris 3 50 mm HEPES 50 mm MOPS Note: 1 Co NTA Beads 6FF 立即用平衡液平衡, 否则介质会变色不要将介质保存在含有 β-mercaptoethanol 的缓冲液中 2 过高浓度的咪唑有可能会降低蛋白回收率 3 乙醇有可能造成蛋白沉淀, 降低蛋白回收率和堵柱子 4 Tris 与金属离子微弱结合造成载量降低避免使用下列试剂 : DTT (dithiothreitol), DTE (dithioerythritol) and TCEP (TRIS (2-carboxyethyl) phosphine). 会降低介质的蛋白载量 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) EGTA (ethylene Glycolbis ([β-amino-ethyl ether]) 会将钴离子从介质上剥落 2. 纯化流程 2.1 溶液的准备推荐使用中性偏碱缓冲液 (ph7-8), 如磷酸盐缓冲液可加入 M 氯化钠减少非特异性吸附在蛋白结合力弱的条件下避免使用 Tris-HCl 应避免使用螯合剂 EDTA 和柠檬酸盐缓冲液可溶性蛋白纯化平衡液 : 50 mm 磷酸盐, 300 mm NaCl, ph 7.4 洗杂液 : 50 mm 磷酸盐, 300 mm NaCl, 5-20 mm 咪唑, ph 7.4 洗脱液 : 50 mm 磷酸盐, 300 mm NaCl, 250 mm 咪唑, ph 7.4 洗杂和洗脱液中的 NaCl 和咪唑浓度可根据需要增加或减少包涵体纯化可在平衡液洗杂液和洗脱液中添加 8M 尿素或 6M 盐酸胍促进蛋白的溶解 2.2 样品准备细菌或酵母表达的蛋白 1) 挑取单菌落到 LB 培养基中, 根据载体使用说明加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间 2) 表达结束后, 将培养液转移到离心杯中,7,000rpm(7,500 g), 离心 15min 收集菌体, 然后按照菌体 : 平衡液 =1:10(W/V) 加入平衡液, 加入终浓度为 1mM 的 PMSF 加入溶菌酶 ( 工作浓度为 mg/ml, 如果表达的宿主细胞内含 plyss 或 plyse, 可以不加溶菌酶 ),( 同时也可加入其他蛋白酶抑制剂, 但不能影响目的蛋白与树脂的结合 ) 3) 将菌体沉淀悬浮起来,( 如果菌液浓度高, 也可考虑加入 10μg/ml RNase A 和 5μg/ml DNase I), 混匀, 放置于冰上, 然后冰上超声破碎细胞, 至菌液基本保持澄清 4) 将澄清的破碎液转移至离心管中,10,000rpm(15,000 g),4 度离心分钟取上 2 / 6 常州天地人和生物科技有限公司

3 清, 置于冰上备用或 -20 度保存酵母昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白 1) 将细胞培养液转移至离心杯,5000rpm(3,800 g), 离心 10min, 收集菌体得上清, 如上清中不含 EDTA 组氨酸和还原剂等物质, 即可直接加入柱子使用 ; 如含有 EDTA 组氨酸和还原剂等物质, 需用平衡液 4 下透析才能加入柱子 2) 对于大量体积的上清, 需加入硫酸铵沉淀浓缩后, 蛋白还需用平衡液 4 透析后才能加入柱子包涵体蛋白纯化 ( 变性条件 ) 1) 将培养液转移到离心杯中,7,000rpm(7,500 g), 离心 15min 收集菌体, 去掉上清 2) 按照菌体 : 平衡液 ( 不含 8M 尿素或 6M 盐酸胍 )=1:10(W/V) 将菌体悬浮起来混匀, 冰浴超声破碎 3) 将破碎液转移至离心管中,10,000rpm(15,000 g),4 度离心分钟去掉上清, 步骤 2) 和 3) 可以重复一次 4) 按照包涵体 : 平衡液 ( 含 8M 尿素 )=1:10(W/V) 将包涵体悬浮起来 5) 变性条件下进行 His 标签蛋白纯化 2.3 Co NTA Beads 6FF 的装填 Co NTA Beads 6FF 被广泛应用于工业纯化, 因此, 涉及到各种中压色谱层析柱的填装, 下面介绍使用 Co NTA Beads 6FF 填装层析柱的方法层析柱的装填 ( 使用储液器装填 ) 1) 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头, 确保柱底筛板上无气泡, 关闭柱底出口, 并在柱底部留出 1-2cm 的去离子水 2) 将树脂悬浮起来, 小心的将浆液连续地倒入层析柱中用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生 3) 如果使用储液器, 应立即在层析柱和储液器中加满水, 将进样分配器放置于浆液表面, 连接至泵上, 避免在分配器或进样管中产生气泡 4) 打开层析柱底部出口, 开启泵, 使其在设定的流速下进行最初应让缓冲液缓慢流过层析柱, 然后缓慢增加至最终流速, 这样可避免液压对所形成柱床的冲击, 也可以避免柱床形成的不均匀如果达不到推荐的压力或流速, 可以用你所使用泵的最大流速, 这样也可以得到一个很好的装填效果 ( 注意 : 在随后的色谱程序中, 不要超过最大装柱流速的 75%) 当柱床高度稳定后, 在最后的装柱流速下至少再上 3 倍柱床体积的去离子水标上柱床高度 5) 关闭泵, 关闭层析柱出口 6) 如果使用储液器, 去除储液器, 将分配器置于层析柱中 7) 将分配器推向柱子至标记的柱床高度处允许装柱液进入分配器, 锁紧分配器接头 8) 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中, 开始平衡如果需要可以重新调整分配器 3 / 6 常州天地人和生物科技有限公司

4 2.4 样品纯化 Co NTA Beads 6FF 装填好后, 可以用各种常规的中压色谱系统纯化 1) 将泵管道中注满去离子水去掉上塞子, 将层析柱连接至色谱系统中, 打开下出口, 将预装柱接到色谱系统中, 并旋紧 2) 用 3-5 倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液 3) 使用至少 5 倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱 4) 利用泵或样品环上样注 : 样品的粘度增加使得即使上样体积很少, 也会导致层析柱很大的反压上样量不要超过柱子的结合能力大量的样品体积也可能造成很大的反压, 使得进样器更难使用 5) 用洗杂液冲洗柱子, 直到紫外吸收达到一个稳定的基线 ( 一般至少个柱体积 ) 注 : 在样品和平衡缓冲液中加入咪唑可以提高样品纯度 6) 用洗脱液采用一步法或线性梯度洗脱一步洗脱中, 通常 5 倍柱体积洗脱液就足够了梯度洗脱可以用一个小的梯度, 例如 20 倍柱体积或更多, 来分离不同结合强度的蛋白质 2.5 纯度检测将使用纯化产品得到的样品 ( 包括流出组分洗杂组分和洗脱组分 ) 以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果 3. 填料再生组氨酸标签蛋白亲和纯化填料所带的钴离子不需要经常去除和重新挂钴离子当填料使用过程中发现反压过高, 填料上面出现明显的污染, 或者填料载量明显变低时, 需要进行对填料进行钴离子剥离和重新挂钴离子, 也就是填料再生将填料装填在合适的层析柱内, 按照下面操作流程进行 1) 使用 5 倍柱体积去离子水清洗填料 ; 2) 使用 5 倍柱体积 100 mm EDTA (ph 8.0) 剥落钴离子 ; 3) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗填料 ; 4) 使用 0.5M NaOH 清洗 5 倍柱体积, 停留 10-15min; 5) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗填料 ; 6) 使用 3-5 倍柱体积 100 mm CoCl 2 再生挂钴 ; 7) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗 ; 填料再生后, 可以立即使用, 如不立即使用, 需要将填料悬浮于等体积的 20% 乙醇中, 置于 4-30 C 保存 4. 问题及解决方案问题原因分析推荐解决方案柱子反压过高填料被堵塞裂解液中含有微小的固体颗粒, 建议上柱前使用滤膜 (0.22 或 0.45μm) 过滤, 或者离心去除 4 / 6 常州天地人和生物科技有限公司

5 样品中含有高浓度的核酸, 加长破碎时间直至粘度降低, 或者添加 DNase I ( 终浓度 5 μg/ml), Mg 2+ ( 终浓度 1 mm), 冰上孵育分钟样品太粘稠有机溶剂或者蛋白稳定试剂 ( 如甘油等 ) 可能会引起反压增高, 降低操作流速洗脱组分中没有目的蛋白蛋白可能是包涵体, 没有在上清中可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白, 包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式表达量太低优化表达条件目的蛋白结合比较弱, 提高洗杂液的 ph, 或者降低咪唑浓度在洗杂步骤被洗下来了目的蛋白结合过强, 不容易洗脱下来降低洗脱液的 ph 值, 或者增加洗脱液中咪唑浓度使用 mM EDTA 溶液剥离钴离子, 同时得到目的蛋白蛋白降解菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂在 4 C 下进行纯化操作洗脱组分不纯洗杂不彻底增加洗杂液体积 ( 含有多种蛋白 ) 样品中含有其他的组氨酸标签蛋白通过调节 ph 值, 或者咪唑浓度来优化洗杂条件再使用其他的纯化手段 ( 如离子交换, 疏水等 ) 进一步纯化洗脱组分填料颜色变浅 Co 离子被剥落参考 part3 重新螯合钴离子上样过程中蛋操作温度太低室温下进行上样白发生沉淀蛋白发生聚集在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂, 如 0.1% 的 Triton X-100 或者 Tween 订购信息及相关产品名称货号规格 SA mL Co NTA Beads SA mL SA mL SA037C 1L SA mL SA mL Co NTA Beads 6FF SA mL SA mL SA038C 1L HisCap Co 6FF SA038C11 1X1mL 5 / 6 常州天地人和生物科技有限公司

6 SA038C51 SA038C15 SA038C55 SA038CS 5x1mL 1X5mL 5X5mL 3X1mL+1X5mL 6 / 6 常州天地人和生物科技有限公司

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Co NTA Beads 目录 1. 产品介绍纯化流程填料再生问题及解决方案订购信息及相关产品产品介绍 Co NTA Beads 可以从原核和真核表达系统中一步纯化 His 标签蛋白该产品是以 4% 琼脂糖凝 Co NTA Beads 目录 1. 产品介绍... 1 2. 纯化流程... 2 3. 填料再生... 3 4. 问题及解决方案... 4 5. 订购信息及相关产品... 5 1. 产品介绍 Co NTA Beads 可以从原核和真核表达系统中一步纯化 His 标签蛋白该产品是以 4% 琼脂糖凝胶为基质, 配体以四配位键螯合钴 Co NTA Beads 相比 Ni NTA Beads 对 His

Co NTA Beads 6FF 目录 1. 产品介绍 纯化流程 填料再生 问题及解决方案 订购信息及相关产品 产品介绍 Co NTA Beads 6FF 可以从原核和真核表达系统中一步纯化 His 标签蛋白 该产品是以

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