7: 使用过的磁珠重复使用时, 建议纯化同种蛋白, 纯化不同种类蛋白时, 建议使用新的磁珠实验参考表一 : 粗蛋白样本,Wash Buffer,Elution Buffer 使用推荐比例粗蛋白样本 Wash Buffer Elution Buffer 1 Elution Buffer 2 1

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永卵苏
5 years ago
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1 使用说明书产品名称 Ni IDA 琼脂糖磁珠产品型号 MAg25K-IDA-Ni 目录号 P20 产品介绍 Enriching Beads Ni IDA 琼脂糖磁珠是专为组氨酸标签 (His-tag) 蛋白纯化而设计的新型功能化材料与传统的金属螯合琼脂糖或者葡聚糖预装柱相比,Ni IDA 琼脂糖磁珠具有顺磁性, 借助外加磁场易实现目标蛋白的分离与纯化 ; 操作简单, 一步纯化即可获得高纯度的组氨酸标签蛋白 ; 可通过洗脱液体积控制目标蛋白浓度, 方便后续的样品处理, Ni 磁珠可简单再生重复使用 Ni IDA 琼脂糖磁珠适合原核细胞 ( 如大肠杆菌 ) 表达的可溶性组氨酸标签蛋白的纯化产品规格平均粒径 25µm 螯合金属离子 Ni 2+ 金属离子密度 50~80μmol/mL(100%,v/v) 固形物浓度 10% (v/v) 分散液 H 2 O 目标蛋白结合量 20mg of 28KD protein/ml beads(100%,v/v) 产品特点结合载量高 ; 非特异性吸附低作用对象细菌, 酵母, 昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达的组氨酸标签蛋白保存条件去离子水, 长期保存建议 20% 乙醇,2 ~8, 请勿冻融使用备注信息 1: 磁珠与蛋白结合量与目标蛋白特性有关, 此处仅作参考值 ; 2: 固形物浓度 10% (v/v) 是指 1mL 磁珠悬浮液中包含 100µL 体积的磁珠 ; 3: 产品可配合英芮诚 ETP-300 型核酸提取仪实现高通量工作 ; 4: 磁珠使用和保存过程中应避免反复冻融, 且不可以干燥 ; 5: 用户可进一步检测经 Ni IDA 琼脂糖磁珠纯化磁场分离后的组氨酸标签蛋白上清液, 优化蛋白纯化流程 ; 6: 本产品可重复使用 8~10 次, 当纯化性能降低时, 建议进行再生处理 ; 1

2 7: 使用过的磁珠重复使用时, 建议纯化同种蛋白, 纯化不同种类蛋白时, 建议使用新的磁珠实验参考表一 : 粗蛋白样本,Wash Buffer,Elution Buffer 使用推荐比例粗蛋白样本 Wash Buffer Elution Buffer 1 Elution Buffer 2 1mL 500~1000µL 200~400µL 100~200µL 表二 :Ni 磁珠与蛋白结合能力 Ni 磁珠使用量 50uL( 建议最低使用量 ) 500uL 1000uL 蛋白结合量 75~150µg protein 750~1500µg protein 1500~3000µg protein 注 : 需要破碎菌体质量 / 体积根据所使用的表达体系和组氨酸标签蛋白的表达水平来决定,Ni 磁珠与不同的组氨酸标签蛋白的结合量略有不同, 参考表 1 和表 2 使用 Ni 磁珠操作流程 1. 实验准备 1.1 离心管, 磁力架, 旋转混合仪或涡旋混合仪 ; 1.2 缓冲液的准备 : 目标蛋白与 Ni IDA 琼脂糖磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率, 各种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度因此, 在较大规模蛋白纯化之前, 用户应该自行设计实验, 筛选出适合纯化目标蛋白的缓冲液体系, 主要包括 Binding Buffer Wash Buffer Elution Buffer Binding Buffer:20mM Sodium Phosphate, 500mM NaCl, 0~20mM Imidazole, ph7.4 Wash Buffer: 20mM Sodium Phosphate, 500mM NaCl, 0~80mM Imidazole, ph7.4 Elution Buffer: 20mM Sodium Phosphate, 500mM NaCl, 400mM Imidazole, ph7.4 注 1:Wash Buffer 中的 Imidazole 浓度推荐先用 10~30mM 进行尝试 2. 样品处理 2.1 高速离心收集大肠杆菌酵母或细胞等 ; 2.2 向上述的细胞沉淀中加入适量体积的 Binding Buffer, 以及蛋白酶抑制剂 ( 如终浓度为的 PMSF), 重悬细胞, 冰浴超声或者高压破碎裂解细胞, 即为粗蛋白样品 3. 磁珠预处理 3.1 将 Ni IDA 琼脂糖磁珠悬浮液充分混匀, 移取所需量到离心管中, 磁性分离去除上清液 ; 3.2 加入去离子水, 充分混匀磁珠, 磁性分离去除上清液 (1 次 ); 3.3 加入 Binding Buffer, 充分混匀磁珠, 磁性分离去除上清液 (1 次 ) 4. 目标蛋白纯化 2

3 4.1 将步骤 2( 样品处理 ) 得到的粗蛋白样品加入含预处理过磁珠的离心管中, 将离心管放置于旋转混合仪上, 室温旋转孵育 30min; 4.2 磁性分离去除上清液或保留上清液以备后续检测 ; 4.3 加入 Wash Buffer, 反复颠倒离心管 1min 使磁珠重悬, 磁性分离, 保留磁珠, 弃上清液或保留上清液以备后续检测 ; 4.4 重复 4.3 步骤 2~3 次注 :1 如果目标蛋白含量较低或者结合能力较弱, 建议延长磁珠与 His 标签蛋白的孵育时间 ; 2 如果目标蛋白易降解, 可以在 2~8 的低温环境下孵育, 孵育时间请延长至 1h 以上 ; 5. 目标蛋白洗脱 5.1 加入适量 Elution Buffer, 充分混匀磁珠, 洗脱 5~10min, 置于旋转混合仪上旋转 10min 以上效果更佳, 用户可根据需要改变洗脱体积, 调整目标蛋白浓度 ; 5.2 磁性分离, 收集洗脱液到新的离心管中, 得到纯化的目标蛋白 ; 5.3 加入适量 Elution Buffer 进行第二次洗脱 6. 磁珠后处理 6.1 在装有磁珠的离心管中加入 Elution Buffer, 充分混匀磁珠, 磁性分离去除上清液, 重复 2~3 次 ; 6.2 加入 1 ml 去离子水, 充分混匀磁珠, 磁性分离去除上清液, 重复 2~3 次 ; 6.3 清洗完毕的磁珠可直接用于下一次同种蛋白的纯化, 或分散于超纯水中短期保存, 长期保存建议分散到 20%(v/v) 乙醇溶液, 置于 2~8 保存 7. 磁珠再生 Ni IDA 琼脂糖磁珠连续使用 8~10 次后, 结合目标蛋白的能力可能会明显降低, 建议进行磁珠再生处理,Ni IDA 琼脂糖磁珠的再生需要先自行配置下列缓冲液 : Stripping Buffer:50mM Tris-HCl 150mM EDTA 的 PBS 溶液,pH=7.2~7.6; Beads Wash Buffer:0.5M NaOH,2M NaCl, 去离子水溶液 ; Recharge Buffer:100~200mM NiSO 4 溶液 ; Storage Buffer:20%(v/v) 乙醇 7.1 将 Ni IDA 琼脂糖磁珠悬浮液磁性分离去除上清液 ; 7.2 加入 1mL Stripping Buffer, 充分混匀磁珠, 室温旋转混合 10min, 磁性分离去除上清液, 重复此步骤 1 次 ; 7.3 加入 1mL 去离子水, 充分混匀磁珠, 磁性分离去除上清液 ; 7.4 加入 1mL Beads Wash Buffer, 充分混匀磁珠, 室温旋转混合 10min, 磁性分离去除上清液, 去离子水重复洗涤 3~5 次, 至洗涤液呈中性为止 ; 7.5 加入 1mL Recharge Buffer, 充分混匀磁珠, 室温旋转混合 30~60 min; 磁性分离去除上清液, 去离子水重复洗涤 5 次以上, 磁珠再生完毕 3

4 注 : 以上再生的磁珠可直接用于 His 标签蛋白的纯化, 或分散于超纯水中短期保存, 长期保存建议分散到 20%(v/v) 乙醇溶液, 置于 2~8 保存蛋白纯化流程的优化以上操作流程适用于大部分组氨酸标签蛋白的纯化, 根据目标蛋白与金属离子螯合磁珠的结合性能不同, 用户可以从以下几个方面对纯化流程进行优化, 以提高目标蛋白的回收率和纯度提高目标蛋白回收率的参考方法 1. 适当降低样品溶液和 Binding/Wash Buffer 中的 Imidazole 浓度 ; 2. 在样品溶液和其它缓冲液中添加表面活性剂等物质 ; 3. 添加合适的蛋白酶抑制剂, 防止目标蛋白降解 ; 4. 适当增加磁珠用量 ; 5. 延长蛋白与磁珠的孵育时间 ; 6. 延长洗脱目标蛋白的时间或增加洗脱次数提高目标蛋白纯度的参考方法 1. 适当提高样品溶液和 Binding/Wash Buffer 中的 Imidazole 和 NaCl 浓度 ; 2. 样品和缓冲液中添加表面活性剂等物质 ; 3. 添加合适的蛋白酶抑制剂, 防止目标蛋白降解 ; 4. 延长清洗时间, 增加清洗次数 ; 5. 采用梯度 Imidazole 浓度洗脱目标蛋白其它该产品可配合英芮诚核酸提取仪 ( 订货号 ETP-300) 进行自动化操作, 也可以配合多功能磁力架 ( 订货号 CQT-0011) 16 位磁力架 ( 订货号 CQT-0001) 手动磁性萃取指套 ( 订货号 CQT-0008) 进行手动操作 4

5 注意事项 1. 首次使用本产品前, 请务必详细阅读本用户手册 ; 2. 磁珠使用和保存过程中应避免冷冻干燥和高速离心等操作 ; 3. 在使用本产品前, 请务必充分振荡使磁珠保持均匀的悬浮状态 ; 4. 请选用质量好的移液器吸头和离心管, 以免磁珠贴壁或混合过程中发生渗漏引起磁珠的损耗 ; 5. 磁珠与溶液混合过程中, 如果溶液粘稠无法通过翻转离心管重悬磁珠, 可采用移液器反复吹打或短时涡旋混合使磁珠充分重悬 ; 6. 用户可根据实际需要保留经磁性分离移去的上清液, 进行取样检测, 以便分析纯化过程和优化蛋白纯化流程 ; 7. 本产品可以重复使用, 当纯化性能降低时, 建议进行再生处理 ; 8. 使用过的磁珠重复使用时, 建议纯化同种蛋白, 纯化不同种类的蛋白时, 建议使用新的磁珠 ; 9. 本产品需与磁性分离器配套使用 ; 10. 本产品在 2~8 可稳定保存, 保质期两年 ; 11. 本产品仅供研究使用 5

6 附 1:Ni 磁珠溶剂耐受性表溶剂种类溶剂名称可耐受浓度备注缓冲液试剂螯合试剂巯基试剂表面活性剂其它添加剂 HEPES Tris-HCl,pH7.4 Tris-Acetate, ph7.4 MOPS EDTA EGTA DTE DTT 带有仲胺或叔胺的缓冲液会将 Ni 离子还原会将 Ni 离子从磁珠上剥离低浓度时会将 Ni 离子还原 β- 巯基乙醇 20mM 防止分子间形成二硫键, 高浓度时 THP 会将 Ni 离子还原 Triton X-100 2% Tween20 2% NP-40 2% Cholate 2% CHAPS 1% Imidazole 500mM Ethanol 20% NaCl 1.5M Na 2 SO 4 Glycerin 50% Citrate 60mM 英芮诚 ( 上海 ) 有限公司地址 : 上海市杨浦区翔殷路 128 号 1 号楼 B 座 301 室电话 : 网址 : 电子邮件 :marketing@bio-enriching.com 版权声明 : 英芮诚 ( 上海 ) 有限公司保留本使用说明书的所有权利版本 :V

Ni NTA Magarose Beads

Ni NTA Magarose Beads 目录 1. 产品介绍...1 2. 注意事项...2 3. 纯化流程...3 4. 订购信息及相关产品.4 1. 产品介绍 Ni NTA Magarose Beads 是专为高效 / 快速纯化组氨酸标签蛋白而设计的新型磁性微球产品, 可以在磁场作用下直接从生物样品中一步纯化出高纯度的目标蛋白, 极大的简化了纯化工艺和提高纯化效率, 适合科研和工业客户高通量地进行组氨酸标签蛋白的纯化

7: 使用过的磁珠重复使用时, 建议纯化同种蛋白, 纯化不同种类蛋白时, 建议使用 新的磁珠 实验参考 表一 : 粗蛋白样本,Wash Buffer,Elution Buffer 使用推荐比例 粗蛋白样本 Wash Buffer Elution Buffer 1 Elution Buffer 2 1

7: 使用过的磁珠重复使用时, 建议纯化同种蛋白, 纯化不同种类蛋白时, 建议使用新的磁珠实验参考表一 : 粗蛋白样本,Wash Buffer,Elution Buffer 使用推荐比例粗蛋白样本 Wash Buffer Elution Buffer 1 Elution Buffer 2 1