His 标签蛋白纯化亲和层析介质使用说明书 Uni IDA-80Ni Uni NTA-80Ni Uni IDA-80L Uni NTA-80L 使用之前请认真阅读产品使用手册全国咨询热线 : 苏州纳微科技有限公司中文网站 : En

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1 His 标签蛋白纯化亲和层析介质使用说明书 Uni IDA-80Ni Uni NTA-80Ni Uni IDA-80L Uni NTA-80L 使用之前请认真阅读产品使用手册全国咨询热线 : 苏州纳微科技有限公司中文网站 : English Website: 公司总部地址 : 苏州工业园区百川街 2 号苏州中国

2 通用缩略术语 : 280 nm: 在指定波长的紫外吸收 M: 物质的量的浓度单位,mol/l 的简写 mm: 物质的量的浓度单位,mmol/l 的简写 BV: 柱体积,bed volume 的简写 Mr: 相对分子量 MPa: 兆帕斯卡 Bar: 压强单位, 工程上公斤力的单位 psi: 压强单位, 磅每平方英寸压强单位之间换算 :1 MPa = 10 bar 145 psi

3 索引目录 1. 标签蛋白纯化亲和层析产品简介层析纯化操作步骤层析柱装填柱效评价清洗平衡金属螯合上样洗脱再生在位清洗储存故障排除订购信息... 8

4 1. 标签蛋白纯化亲和层析产品简介重组蛋白的富集和纯化一般采用已知大小的标签, 通过重组表达之后, 利用标签和填料的特异性相互作用, 达到分离纯化效果固定金属离子或金属螯合亲和层析 (MAC) 利用蛋白表面的某些氨基酸 ( 如组氨酸色氨酸半胱氨酸等 ) 和固定在层析介质上的过渡金属离子 (Ni 2+,Cu 2+,Zn 2+,Co 2+,Fe 3+ 等 ) 以配位键结合, 从而实现对不同标签蛋白质的分离影响蛋白质与金属离子鳌合作用大小的因素, 主要是蛋白质表面可结合的氨基酸 ( 种类数目和分布 ) 金属离子的种类和密度层析条件(pH 盐的种类和浓度添加剂等) 固定金属离子亲和层析介质具有吸附容量大选择性好分辨率高易于再生成本较低等优点, 广泛用于生物制药和生物制品的下游蛋白质核酸及多肽的分离纯化, 尤其是组氨酸标记 (His-Tag) 蛋白质的分离纯化纳微科技提供的固定金属离子亲和层析介质以多孔聚丙烯酸酯为基质, 具有良好的稳定性生物相容性和溶剂相容性, 既有利于保持生物药或制品的生物活性和提高产品的收率, 还有利于扩大层析操作条件的选择范围 UniIDA-80L 和 UniNTA-80L 为螯合固定金属离子的介质, 使用者可以根据需要螯合不同的过渡金属离子 (Ni 2+,Cu 2+,Zn 2+,Co 2+,Fe 3+ 等 );UniIDA-80Ni 和 UniNTA-80Ni 为预先螯合了 Ni 2+ 的介质, 使用者不需要螯合固定金属离子即可直接使用 2. 层析纯化操作步骤 2.1 层析柱装填匀浆液的浓度是指层析介质沉降至恒定体积时的体积与匀浆液的总体积的比值为了获取最佳的固定金属离子层析介质的装柱效果, 我们推荐 2 M NaCl 匀浆, 匀浆液浓度为 30~50% 具体装柱方法如下 : 1) 首先计算所装色谱柱的柱体积 Vc,Vc = Ac L,Ac= π r2* * Vc: 色谱柱柱体积 ;Ac: 色谱柱横截面积 ;L: 色谱柱高度 ;r: 色谱柱半径 2) 在原容器中轻轻搅动金属螯合亲和层析介质, 使其完全分散在液体中形成匀浆液量取所需原液的质量或体积 * * 一般情况下, 金属螯合亲和层析介质在压力作用下都会被压紧导致体积收缩, 为了获得紧密的柱床, 推荐填料的体积过量一些, 一般为柱体积的 1.2 倍左右 3) 将所需金属螯合亲和层析介质转移至适当容器, 自然沉降后, 倾斜倒去上清液 4) 装柱前, 过滤原液 *, 并用 3 倍柱体积去离子水清洗 * 纳微科技的金属螯合亲和层析介质保存在 20% 乙醇溶液 5) 用 2 M NaCl 溶液匀浆, 推荐匀浆液浓度 30~50%( 体积比 ) 6) 在建议的压力范围内使用泵装柱, 推荐装填流速为至少两倍常规操作流速

5 2.2 柱效评价装好的色谱柱应使用 3~5 BV 去离子水清洗色谱柱装填好后, 用去离子水以 50~200 cm/h 流速平衡并进行柱效测试具体测试参数详见下表 : 表 2.1 金属螯合亲和层析色谱柱的柱效测试样品 : 上样量 : 洗脱液 : 线性流速 : 检测 : 5% (v/v) 丙酮的水溶液或 2 M NaCl 1~5% 柱体积去离子水 50~200 cm/h 5% 丙酮上样 : 280 nm 2 M NaCl 上样 : 电导检测仪清洗装好的色谱柱应使用至少使用 5 BV 的去离子水清洗 2.4 平衡在进行柱层析前, 使用 3 到 5 倍柱体积的流动相一般为缓冲液, 如 :20 mm PBS M NaCl, ph 7.0 平衡 2.5 金属螯合本介质可以根据需要螯合不同的金属离子, 如 Ni 2+ Cu 2+ Zn 2+ Co 2+ Fe 3+ 等一般情况下,Cu 2+ 与蛋白质结合最强,Ni 2+ 与蛋白质结合适中,Zn 2+ 与蛋白质结合最弱, 可根据实际需要选择使用者也可选择螯合了相应金属离子的介质 ( 如 UniIDA-80Ni 和 UniNTA-80Ni, 首次使用无需螯合金属离子步骤 ), 也可自行螯合具体的鳌合步骤如下 : (1) 层析柱 ( 未螯合或再生后 ) 用 5 BV 的去离子水清洗 ; (2) 选择合适的金属离子 (Ni 2+ Cu 2+ Zn 2+ Co 2+ Fe 3+ 等 ), 溶解在中性或弱酸性溶液中 ( 其中 Fe 3+ 必须在较低 ph( 约为 3) 下鳌合, 以防止 Fe 3+ 产生沉淀 ), 金属离子浓度为 0.1 mol/l, 过滤后备用 ; (3) 将 5 BV 的金属离子溶液用泵上层析柱, 鳌合金属离子 ; (4) 用 5 BV 以上的去离子清洗层析柱, 去除未被螯合的金属离子用 5 BV 以上的平衡缓冲液平衡层析柱, 实际操作中, 一般选用中性 (ph 7~8) 的高盐 (0.2~1.0 M NaCl 或其它中性盐 ) 缓冲液, 如 :20 mm PB M NaCl, ph 7.0 对

6 于结合力较强的蛋白质, 平衡缓冲液中可加入低浓度 (5~50 mm) 的咪唑 ( 具体浓度需要根据样品进行优化 ) 此外, 也可以直接把清洗干净或再生后的介质和金属离子溶液混合后在摇床上振荡 2 小时, 鳌合金属离子, 然后再装柱 * UniIDA-80Ni 和 UniNTA-80Ni 首次使用不需要螯合 2.6 上样条件将经过离心或膜过滤后的上样液溶解在缓冲液中 (20 mmpbs 缓冲液 ph M NaCl + 5~50 mm 咪唑 ) 为了减少杂蛋白在层析柱上的吸附, 其中咪唑的浓度根据不同的蛋白决定, 一般的蛋白可选择 5-50 mm 浓度范围 ( 与平衡缓冲液浓度保持一致 ) 2.7 洗脱上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线稳定, 样品可以根据实际情况采取提高缓冲液中咪唑的浓度或通过改变洗脱缓冲液 PH 值 ( 大多数蛋白质在 ph 4~6 的范围内可被洗下来 ) 洗脱吸附于层析介质上的样品 ( 需在洗脱缓冲液中加入 0.2~1.0 M 的 NaCl 以抑制离子交换作用 ) 如使用提高咪唑浓度方法, 建议的洗脱条件为 :20 mm PBS 缓冲液 ph M NaCl M 咪唑 ( 洗脱时咪唑的浓度根据不同蛋白决定 ) 对于包涵体蛋白, 可在平衡上样和洗脱的缓冲液中加入 8 M 尿素或 6 M 盐酸胍, 洗脱后再对变性蛋白进行复性 2.8 再生介质使用数次后 ( 约 3~20 次, 具体与原料来源样品体积等有关 ), 或者更换螯合金属离子类型前, 需要进行再生处理具体操作步骤如下 : (1) 使用 5 BV 的去离子水清洗层析柱 ; (2) 使用 5 BV 的 20 mm PB M NaCl +50 mm EDTA,pH 7.0 清洗层析柱, 以除去金属离子 ; (3) 使用 5 BV 的 20 mm PB M NaCl,pH 7.0 溶液清洗层析柱 ; (4) 使用 5 BV 的去离子水清洗层析柱 ; (5) 按照 Ⅱ-5 操作步骤重新螯合金属离子 2.9 在位清洗为了保持层析柱的性能, 若有蛋白质或其他杂质在再生过程中未能有效去除, 可执行在位清洗步骤, 在位清洗时, 也可采用反向冲洗的方法, 具体操作步骤如下 : (1) 使用 5 BV 的 20 mm PB M NaCl +50 mm EDTA,pH 7.0 清洗层析柱, 以除去金属离子 ; (2) 对于以离子键结合的蛋白, 可用 3 BV 以上的 2 M NaCl 清洗, 并用 3 BV 以上的去离子水清洗 ; (3) 对沉淀蛋白以疏水性结合的蛋白或脂蛋白, 可用 0.2~0.5 M NaOH 清洗 ( 与层析介质

7 接触时间 1~2 小时 ), 并用 5 BV 以上平衡液和 3 BV 以上的去离子水清洗 ; (4) 对疏水性结合的蛋白脂蛋白和脂类物质, 可用 5 BV 以上的 50% 乙醇或 30% 异丙醇清洗 ( 与层析介质接触时间 0.5~1 小时 ), 并用 5 BV 以上的去离子水清洗也可用含非离子表面活性剂的碱性或酸性溶液清洗, 如用 0.1~0.5% 的 Triton X M 乙酸清洗 1~2 小时, 并用 5 BV 以上的 50% 乙醇冲洗去除去污剂, 然后用 5 BV 以上的纯水冲洗 ; 按照 Ⅱ-5 操作步骤重新螯合金属离子 3. 储存暂时不使用的层析介质需保存在 4~35 的 20% 乙醇中, 并盖紧瓶盖, 已经装好层析柱应保存在含 20% 乙醇的缓冲液 (ph 7.0) 中 4. 故障排除如果您在使用金属螯合亲和层析介质中遇到任何问题, 请参考下表进行解决或联系苏州纳微科技有限公司表 4.1 金属螯合亲和层析柱常见问题及故障排除情况原因措施柱压升高流速过高减小流速泵和收集器之间的阀门未打开仪器的滤膜堵塞柱前堵塞样品在柱子上发生沉淀打开出口除去并清洗, 可能的话替换在使用前过滤样品和洗脱液使用 20BV 流动相反冲色谱柱遵循清洗步骤, 调节洗脱液来维持样品溶解度样品较脏, 或一些吸附作用较强的物质留在填料上执行在位清洗操作 ( 参考再生条件 ) 柱床被压缩重新装填柱子色谱柱使用时间过长更换色谱柱或更换色谱填料样品吸附不够充分平衡液中咪唑浓度过高调整平衡液中咪唑浓度样品溶液的 ph 不合适调节 ph 增加结合样品在洗脱过程中不被洗脱洗脱液的咪唑浓度过低增加洗脱液中咪唑的浓度洗脱液的 ph 不合适调整洗脱液的 ph 洗脱液中离子强度过低产生离子交换作用提高洗脱液的盐浓度抑制离子交换作用分辨率降低洗脱液的咪唑浓度过低不合适的洗脱条件, 如梯度过陡或流速过高柱子未装填好在柱子顶端或柱后有大部分的混合空间增加洗脱液中咪唑的浓度改变洗脱条件, 采用较缓的梯度洗脱或等度洗脱, 降低流速重新装柱加高填料的上表面或减少柱子后体积柱子过载清洗并重新平衡色谱柱, 降低上样量进样若干次后对样品的吸附能力降低样品中的杂质结合在填料上, 干扰了正常的结合执行在位清洗操作 ( 参考再生条件 ) 基线漂移色谱柱未平衡好增加平衡时间

8 情况原因措施洗脱液 A,B 在同一紫外波长下吸收系数不同使用不同的波长或走没有样品的空白梯度洗脱液不纯使用高纯度的 HPLC 级试剂出现不明杂峰前一个样品的不完全洗脱洗脱色谱柱洗脱液不纯运行没有样品的空白梯度对照, 或使用高纯度的 HPLC 级别试剂痕量杂质结合在色谱柱上, 在平衡和上样过程中被浓缩, 洗脱时出峰不稳定的非重现性的鬼峰清洗色谱柱 ( 参考再生条件 ) 或采取适当方法将结合在色谱柱上的杂质洗脱下来与仪器的不稳定有关 5. 订购信息产品名称官能基团粒径孔径最大耐压 μm Å MPa cm/h 建议线性流速 ph 稳定范围 1 每毫升介质结合量标签蛋白纯化亲和层析介质 His 标签蛋白的纯化, 高载量 Uni IDA-80Ni Ni > 20 mg His 蛋白 His 标签蛋白的纯化, 低配基脱落 Uni NTA-80Ni Ni > 10 mg His 蛋白用于螯合或固定金属离子, 高载量 Uni IDA-80L -N(CH2COOH) μmol Ni 2+ /ml gel 用于螯合或固定金属离子, 低配基脱落 Uni NTA-80L -N(CH2COOH) μmol Ni 2+ /ml gel 1. ph 稳定范围指使用再生在位清洗的 ph 区间注 : 其他规格的产品可特殊定制, 层析柱或分析柱产品请咨询纳微科技业务代表全国咨询热线 : 苏州纳微科技有限公司中文网站 : English Website: info@nanomicrotech.com 公司总部地址 : 苏州工业园区百川街 2 号苏州中国

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