Uni Gel 离子交换层析介质生物大分子纯化使用说明书 Uni Gel CM Uni Gel SP Uni Gel DEAE Uni Gel Q 使用之前请认真阅读产品使用手册苏州纳微科技有限公司 Suzhou Nano-Micro Tech, Co., Ltd

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鉴懿扈
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1 Uni Gel 离子交换层析介质生物大分子纯化使用说明书 Uni Gel CM Uni Gel SP Uni Gel DEAE Uni Gel Q 使用之前请认真阅读产品使用手册苏州纳微科技有限公司 Suzhou Nano-Micro Tech, Co., Ltd

2 通用缩略术语 : IEC: 离子交换层析, 文献中也有被记为 IEX 280 nm: 在指定波长的紫外吸收 M: 物质的量的浓度单位,mol/l 的简写 mm: 物质的量的浓度单位,mmol/l 的简写 BV: 柱体积,bed volume 的简写 Mr: 相对分子量 MPa: 兆帕斯卡 Bar: 压强单位, 工程上公斤力的单位 psi: 压强单位, 磅每平方英寸压强单位之间换算 :1 MPa = 10 bar 145 psi 单分散离子交换产品命名规则 Uni Q-30S 含义 : 1 注册商标 -- 单分散填料 2 功能团 --(CM,SP,DEAE,Q) 3 粒径型号 4 孔径 --( 单位 :Å,XS: 300 Å, S: 500 Å, L: 1000 Å)

3 索引目录 1. 离子交换层析产品简介层析纯化操作步骤层析柱装填柱效评价清洗平衡上样洗脱再生在位清洗储存故障排除订购信息... 8

4 1. 离子交换层析产品简介离子交换是根据生物分子表面电荷 ( 种类数目和分布 ) 的差异实现对不同生物分子的分离, 是生物大分子分离纯化最常用的方法纳微科技提供的离子交换层析介质是以聚合物 ( 聚丙烯酸酯或聚苯乙烯 - 二乙烯基苯共聚物 ) 为基质, 该基质经过表面亲水改性后再键合离子交换基团, 同时具备了对生物活性大分子良好的相容性和优秀的物理及化学稳定性, 极大地提高了纯化效率纳微科技提供四种系列 (Uni, UniM, UniGel, Nano) 的离子交换产品, 涵盖了对抗体蛋白质多肽核酸抗生素天然产物等分子的捕获中度纯化精细纯化分析等纯化阶段的应用, 为客户提供生物样品纯化从实验室研发到工业化生产的整体解决方案表 1.1 纳微科技的离子交换层析介质分类产品系列 Uni 系列 Uni M 系列 Uni Gel 系列 Nano 系列分离原理离子交换疏水 + 离子交换离子交换离子交换基质聚丙烯酸酯聚丙烯酸酯聚丙烯酸酯聚苯乙烯 - 二乙烯基苯孔径 (Å) 粒径 (μm) 纯化阶段捕获中度纯化捕获中度纯化捕获中度纯化精细纯化主要特点典型应用小孔径, 对小分子载量高适合小分子蛋白质多肽核酸抗生素等分子量较小的生物分子的纯化在 Uni 系列基础上, 同时键合疏水基团具有不同于 Uni 系列的选择性, 可耐受较高盐浓度上样长间隔臂, 对生物大分子具有极高的载量适合抗体大分子蛋白质多肽等生物大分子的捕获和纯化分辨率较高, 寿命长, 可长时间耐酸碱, 机械强度高适合蛋白质多肽核酸等生物大分子的精细纯化表 1.2 离子交换功能团分类及用途类型化学结构缩写主要特点 Pka 值弱阳离子交换 -CH2COO - CM 酸性较弱, 适用于 ph>4 的流动相 4-6 强阳离子交换 -(CH2)3SO3- SP 酸性强,pH 1-14 均适用 <2 弱阴离子交换 -(CH2)2N(CH3)2 DEAE 碱性较弱, 适用于 ph<9 的流动相 >9 强阴离子交换 -CH2N + (CH3)3 Q 碱性很强,pH 1-14 均适用 >12 注 :1. 流动相 ph 必须介于 PI 和 PKa 值之间 2. 流动相 ph 与待分离样品等电点至少差 1.0 ph 3. ph<3.0 宜选用强阳,pH>10.0 宜选用强阴 2. 层析纯化操作步骤 2.1 层析柱装填匀浆液的浓度是指层析介质沉降至恒定体积时的体积与匀浆液的总体积的比值为了获取最佳的 UniGel 离子交换层析介质的装柱效果, 我们推荐 0.5 M NaCl 平衡过夜, 再用 0.5 M NaCl 溶液进行匀浆, 匀浆液浓度为 65~70% 具体装柱方法如下 :

5 1) 首先计算所装色谱柱的柱体积 Vc,Vc=Ac L,Ac=π r 2 * Vc: 色谱柱柱体积 ;Ac: 色谱柱横截面积 ;L: 色谱柱高度 ;r: 色谱柱半径 2) 在原容器中轻轻搅动离子交换层析介质, 使其完全分散在液体中形成匀浆液量取所需原液的质量或体积 * * 一般情况下, 离子交换层析介质在压力作用下都会被压紧导致体积收缩, 为了获得紧密的柱床, 推荐介质的体积过量一些, 一般为柱体积的 1.2 倍左右 3) 倾出介质中 20% 乙醇保存液, 用 0.5 M NaCl 溶液置换 20% 乙醇, 平衡过夜 4) 装柱之前, 用 0.5 M NaCl 溶液调整匀浆浓度为 65 ~ 70%; 将匀浆一次性倒入层析柱, 沉降平衡后标注高度 5) 将分配器装入, 调节高度使得压缩系数为 1.05 ~ 1.10; 然后启动输液泵, 用 1.5~2 倍工作流速使柱床稳定 (-2 柱体积 ) 6) 按照 SOP 进行柱效和对称性的测定, 须达到预定标准 2.2 柱效评价装好的色谱柱应使用 2 BV 0.5 M NaCl 溶液平衡, 再用 2.0 M NaCl 以 100 cm/h 流速进行柱效测试, 具体测试参数详见下表 : 表 2.2 离子交换层析柱的柱效测试方法样品 : 上样量 : 洗脱液 : 线性流速 : 检测 : 2 M NaCl 溶液 1~5 % 柱体积 0.5 M NaCl 溶液 100 cm/h 280 nm 2 M NaCl 上样 : 电导检测仪 2.3 清洗装好的色谱柱应使用至少使用 5 BV 的去离子水清洗 2.4 平衡用 5 BV 以上的平衡缓冲液平衡层析柱, 至流出液电导和 ph 不变 ( 与平衡液一致 ), 缓冲液如 Buffer A, 如 20 mm PBS, ph7.0, 具体的缓冲体系应根据目标蛋白的稳定性和等电点离子交换介质的种类进行筛选和优化

6 2.5 上样固体样品可用平衡液溶解配制 ; 低浓度样品溶液可用平衡液透析 ; 高浓度样品溶液可用平衡液稀释为了避免堵塞层析柱, 样品应经离心或膜过滤处理进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算, 上样前确保样品缓冲液应尽可能与平衡液一致 2.6 洗脱上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线稳定, 可以根据实际情况采取提高盐浓度或改变流动相 ph 的方法依次洗脱吸附于层析介质上的样品 3. 再生每次层析之后可用 M NaCl 清洗层析柱, 除去强结合于层析介质上的蛋白 4. 在位清洗为了保持层析柱的性能, 若有蛋白质或其他杂质在再生过程中未能有效去除, 可执行在位清洗步骤, 在位清洗时, 也可采用反向冲洗的方法, 具体操作步骤如下 : (1) 对于通过离子键结合过强的蛋白, 可用 3 BV 以上的 2 M NaCl 清洗, 并用 3 BV 以上的去离子水清洗 ; (2) 对沉淀蛋白以疏水性结合的蛋白或脂蛋白, 可用 0.2~0.5 M NaOH 清洗 ( 与层析介质接触时间 1~2 小时 ), 并用 5 BV 以上平衡液和 3 BV 以上的去离子水清洗 ; (3) 对强疏水性结合的蛋白脂蛋白和脂类物质, 可用 5 BV 以上的 50% 乙醇或 30% 异丙醇清洗 ( 与层析介质接触时间小时 ), 并用 5 BV 以上的去离子水清洗也可用含非离子表面活性剂的碱性或酸性溶液清洗, 如用 0.1~0.5% 的 Triton X M 乙酸清洗 1-2 小时, 并用 5 BV 以上的 50% 乙醇冲洗去除去污剂, 然后用 5 BV 以上的纯水冲洗 ( 使用高浓度的有机溶剂时, 为了避免产生气泡, 应采用逐步增加有机溶剂浓度的方法 ) 5. 储存暂时不使用的层析介质需保存在 4~35 o C 的 20% 乙醇中, 并盖紧瓶盖, 已经装好层析柱应保存在含 20% 乙醇的缓冲液 (ph 7.0) 中

7 6. 故障排除如果您在使用离子交换层析介质中遇到任何问题, 请参考下表进行解决或联系苏州纳微科技有限公司表 6.1 离子交换层析常见问题及故障排除可能遇到的情况原因分析建议措施柱压升高流速过高降低流速样品吸附不够充分泵和收集器之间的阀门未打开仪器的滤膜堵塞柱前堵塞样品在柱子上发生沉淀样品较脏, 或一些吸附作用较强的物质留在填料上柱床被压缩色谱柱使用时间过长样品溶液中离子强度太高样品的 ph 不合适打开出口去除杂质并清洗, 或者替换, 在使用前对样品和洗脱液用 0.45μm 或 0.2μm 进行过滤使用 20BV 流动相反冲色谱柱遵循清洗步骤, 调节洗脱液来维持样品溶剂度执行在位清洗操作 ( 参考再生条件 ) 重新填装柱子更换色谱柱或更换色谱填料降低样品溶液中的离子强度, 如可采用稀释或脱盐等手段调节 ph 增加结合样品在洗脱过程中不被洗脱洗脱液的离子强度过低增加洗脱液的浓度洗脱液的洗脱能力过低洗脱液的 ph 不合适更换洗脱能力更强的洗脱液调整洗脱液的 ph 使用中柱床出现裂痕色谱柱有残留疏水性较强的杂质执行在位清洗操作 ( 参考再生条件 ) 溶胀未充分消除用 0.5 M NaCl 混合均匀, 充分平衡分辨率降低进样若干次后对样品的吸附能力降低基线漂移溶液中有气泡外部空气进入系统不合适的洗脱条件, 如梯度过陡或流速过高柱子未装填好在柱子顶端或柱后有大部分的混合空间柱子过载粒径较大选择性差样品中的杂质结合在填料上, 干扰了正常的结合色谱柱未平衡好洗脱液 A,B 在同一紫外波长下吸收系数不同减压过滤除气加入更多缓冲液, 将气体充分赶出改变洗脱条件, 采用较缓的梯度洗脱或等度洗脱, 降低流速重新装柱加高填料的上表面或减少柱子后体积清洗并重新平衡色谱柱, 降低上样量更换同种类型粒径更小的填料更换其他类型填料执行在位清洗操作 ( 参考再生条件 ) 增加平衡时间使用不同的波长或走没有样品的空白梯度

可能遇到的情况原因分析建议措施出现不明杂峰洗脱液不纯前一个样品的不完全洗脱洗脱液不纯痕量离子性杂质结合在色谱柱上, 在平衡和上样过程中被浓缩, 洗脱时出峰不稳定的非重现性的不明杂峰使用高纯度的 HPLC 级试剂洗脱色谱柱运行没有样品的空白梯度对照, 或使用高纯度的 HPLC 级别试剂清洗色谱柱 ( 参考再生条件 ) 或采取适当方法将结合在色谱柱上的杂质洗脱下来

8 可能遇到的情况原因分析建议措施出现不明杂峰洗脱液不纯前一个样品的不完全洗脱洗脱液不纯痕量离子性杂质结合在色谱柱上, 在平衡和上样过程中被浓缩, 洗脱时出峰不稳定的非重现性的不明杂峰使用高纯度的 HPLC 级试剂洗脱色谱柱运行没有样品的空白梯度对照, 或使用高纯度的 HPLC 级别试剂清洗色谱柱 ( 参考再生条件 ) 或采取适当方法将结合在色谱柱上的杂质洗脱下来与仪器的稳定性有关 7. 订购信息产品型号官能基团 UniGel 系列 : 高载量, 蛋白质和抗体纯化首选粒径孔径最大耐压建议线性流速 1 ph 稳定范围动态 2 全交换量吸附载量 μm Å MPa cm/h mg/mlgel meq/ml gel Uni Gel-30CM -CH2COO Uni Gel-30SP - -(CH2)3SO Uni Gel-30DEAE -CH2CH2N(C2H5) Uni Gel-30Q -CH2N + (CH3) Uni Gel-80CM -CH2COO Uni Gel-80SP -(CH2)3SO Uni Gel-80DEAE -CH2CH2N(C2H5) Uni Gel-80Q -CH2N + (CH3) ph 稳定范围指使用再生在位清洗的 ph 区间 2. 动态吸附载量测试条件 : 阳离子是用 Lysozyme 样品, 阴离子是用 BSA 样品注 : 其他规格的产品可特殊定制全国服务热线 : 苏州纳微科技有限公司 (Suzhou Nanomicro Technology, Co., Ltd) 地址 : 苏州工业园区百川街 2 号江苏中国售后邮箱 :info@nanomicrotech.com 中文官网 : English Website:

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