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1 Protein A Focurose 4FF 为确保产品的性能和无忧的操作, 使用前请仔细阅读本手册, 有任何疑问请咨询本公司售后技术支持或当地的销售人员 ( 联系方式见附录 ) 1. 产品介绍 Protein A Focurose 4FF 适用于分离纯化腹水 细胞培养上清 血清来源的单抗 多抗及 Fc 标签蛋白等 特点如下 : a. 快速 简单 ( 一步纯化 ) b. 载量高 流速快 易于放大 c. 与 Protein G Focurose 4FF 相比, 结合力相对较弱, 更容易洗脱, 也能更好的维持抗体的滴度 ( 见表 2) 表 1: 介质性能参数 基质 粒径范围 高度交联 4% 的琼脂糖 µm 平均粒径 90µm 结合载量 20mg( 人 IgG)/ml( 介质 ) ph 稳定性 3-9( 长期 ) 2-10( 短期 ) 化学稳定性 流速 操作压力 贮存溶液 所有常用缓冲溶液中稳定 70% 乙醇 6M 盐酸胍 (8 天 ) 300cm/h 0.3MPa 20% 乙醇 贮存温度 4-8 备注 : 1. 介质的结合载量会因样本的来源和亚型的变化而变化 2. 介质如果长时间浸泡在洗脱液中, 会导致配基水解, 最终影响介质载量 第 1 页共 5 页

2 表 2:Protein A 和 Protein G 与不同种属 IgG 的结合强度种类亚类 Protein A Protein G 人 IgA 可变 - IgD - - IgE - - IgG IgG IgG IgG IgM 可变 - IgG 豚鼠 IgG 仓鼠 / + ++ IgG IgG 2a 小鼠 IgG 2b IgG IgM 可变 - IgG 大鼠 IgG 2a IgG 2b - ++ IgG 兔 / 禽蛋黄 IgY - - 狗 / ++ + 猪 / 马 / 牛 / 绵羊 / -/+ ++ 山羊 / - ++ 猴子 / 骆驼 / - + 熊 / : 不结合 + : 弱结合 ++ : 结合 +++ : 中等结合 ++++ : 强结合 第 2 页共 5 页

3 2. 使用 ( 以 HT 1ml 和 HT 5ml 为例 ) a. 水洗用 5-10CV 纯化水以 0.5ml/min(HT 1ml) 或 2.0ml/min(HT 5ml) 清洗介质 备注 : 此步骤用于去除介质中 20% 乙醇 b. 平衡用 5-10CV 平衡液以 0.5ml/min(HT 1ml) 或 2.0ml/min(HT 5ml) 平衡介质, 直至基线平稳后调零 备注 : 此步骤用于平衡介质, 保证介质中的溶液的组分和 ph 与样本一致 c. 上样样品经过离心 过滤 (0.45um) 后以 0.5ml/min(1ml) 或 2.0ml/min(5ml) 进行上样, 上样完成后用平衡液清洗直至基线为零 备注 : 蛋白的结合能力随着 IgG 物种来源 亚型 样品浓度 流速 ph 变化而变化, 低流速常常能增加样本的结合效率 腹水必须要经过高速离心 ( 至少 11500rpm*30min, 去除大量脂类 ) 稀释 ( 至少 3 倍, 推荐 5-10 倍 - 洗脱样本纯度会更高 ) 过滤后上样 ; 血清必须要经过稀释 ( 至少 2 倍, 推荐 5-10 倍 - 洗脱样本纯度会更高 ) 过滤后上样 d. 洗脱用 5-10CV 洗脱液以 0.5ml/min(1ml) 或 2.0ml/min(5ml) 进行洗脱, 收集洗脱液, 洗脱完成后用中和液 (50-200ul 中和液 /ml 洗脱液 ) 将洗脱液 ph 调节至中性 ( 也可以预先加在收集管中 ) 备注 : 低流速常常能增加洗脱液中目标蛋白的浓度 e. 水洗用 5-10CV 纯化水以 0.5ml/min(1ml) 或 2.0ml/min(5ml) 清洗介质 备注 : 此步骤用于去除介质中洗脱液 f. 保存用 5-10CV 20% 乙醇以 0.5ml/min(1ml) 或 2.0ml/min(5ml) 清洗介质后 4-8 保存 备注 :20% 乙醇可以防止微生物的生长 g. 溶液配制平衡液 :0.02M PB, 调节 ph ,4-8 保存 备注 : 平衡液配制完成后务必确保 ph 为 7.0, 当样本所在溶液的 ph 较低时, 一些来源的样本与介质作用较弱甚至是无效的 ( 见表 2); 若洗脱液中有杂质蛋白时, 建议在平衡液中添加 0.3M NaCl; 一般来说, 此平衡液可以适用绝大数的目标物的分离纯化 ( 如有特殊情况, 可以根据样本的来源和亚型, 可以有争对性的调整平衡液的 ph 和盐浓度 ) 洗脱液 :0.1M 柠檬酸缓冲液,pH 3.0,4-8 保存 备注 : 洗脱液极易滋生微生物, 最好现配现用,4-8 保存 中和液 :1.0M Tris-HCl,pH 9.0 备注 : 中和液用于调节 ph, 避免抗体在过酸环境中失活, 室温保存 第 3 页共 5 页

4 3. 清洗 清洗后可以去除一些强结合性物质 ( 例如极少量强结合的抗体 变性蛋白 脂类等 ), 从而达到恢复介质的优良性能 ( 例如载量 流动性 柱效等 ) 建议每使用 次后进行清洗 ( 常规清洗流程 :a b e; 剧烈清洗流程 :a b c d e), 具体清洗频率需根据纯化的初始样品的洁净度进行调整 a. 用 倍柱体积的酸清洗液 (O.05M 甘氨酸 0.5M NaCl,pH 2.5) 冲洗后, 立即用 5-10 倍柱体积纯化水冲洗 备注 : 用于去除强结合的抗体 变性蛋白等 b. 用 倍柱体积的碱清洗液 (0.1M Tris-HCl 0.5M NaCl,pH 9.0) 冲洗后, 立即用 5-10 倍柱体积纯化水冲洗 备注 : 用于去除聚集在介质中的沉淀 变性蛋白 c. 用 5-10 倍柱体积的 6M 盐酸胍冲洗后, 立即用 5-10 倍柱体积纯化水冲洗 d. 用 5-10 倍柱体积的 70% 乙醇冲洗后, 立即用 5-10 倍柱体积纯化水冲洗 e. 用 5-10 倍柱体积的 20% 乙醇冲洗后 4-8 保存 备注 :20% 乙醇可以防止微生物的生长 4. 常见问题 表 3: 常见问题及解决方案 问题 可能原因 解决方案 纯化时目标物不与介质结合或结合量较低 洗脱时没有收集到目标物或只收集到少量目标物 目标物纯度较低 1. 上样量过载降低上样量 2. 上样速度过快降低上样流速 3. 蛋白或脂类在介质中聚集及时有效地清洗介质或更换新的介质 4. 目标物和介质结合力弱确认 IgG 来源及亚型, 选择正确的介质确认样本中的 ph, 结合力弱的目标物可以通过调高 ph(8-9) 和增加盐浓度 5. 纯化时选择的缓冲液不合适 (1-3M NaCl) 来提高样本和介质的结合力 1. 目标物没有与介质结合或结合量较少先确认目标物是否与介质结合 2. 洗脱条件不合适降低洗脱液 ph 至 洗脱时间不够降低流速, 延长洗脱液的保留时间 4. 洗脱体积过小 加大洗脱体积 1. 样品没有经过前处理 根据样品的来源, 上柱前必须要经过离心 过滤或稀释 2. 样品粘度过高 3. 洗杂不彻底 第 4 页共 5 页 用平衡液适当的稀释样品, 降低样品粘度和浓度 加大洗杂体积直至基线平稳并与平衡液一致 4. 杂质蛋白或脂类在介质中聚集沉淀 及时有效地清洗介质 5. 目标物出现降解 注意样本纯化前后的保存条件, 不得在高温 过酸 过碱条件长时间放置 6. 柱料装填效果不佳 重新装填或购买 7. 分离柱顶部有较大储样体积重新装柱或降低储样体积 8. 介质中有微生物生长介质使用完后, 请及时正确保存介质

5 介质载量下降 1. 上样速度过快降低上样流速 2. 蛋白或脂类在介质中聚集, 导致载量下降 及时清洗介质 3. 使用次数过多, 配基逐渐脱落更换新介质 色谱峰上升缓慢介质装填过紧重新装柱 色谱峰拖尾 介质装填太松 重新装柱 柱床有裂缝或干涸 出现泄露或大体积气泡引入 检查管路是否有泄露或气泡, 重新装柱 1. 蛋白或脂类聚集 及时清洗介质或滤膜 液流较慢所用试剂必须经过过滤和脱气 ; 2. 分离柱中微生物生长样品上柱前必须离心或过滤 5. 订购信息 表 4: 订购信息表产品 规格 (ml) 货号 Protein A Focurose 4FF 5 HZ Protein A Focurose 4FF 25 HZ Protein A Focurose 4FF 100 HZ Protein A Focurose 4FF 500 HZ Protein A Focurose 4FF 1000 HZ 备注 : 大规格包装产品或其它产品购买, 请咨询本公司当地销售或售前技术支持 6. 联系方式 武汉汇研生物科技股份有限公司地址 : 武汉市东湖新技术开发区流芳园南路 18 号新特工业园电话 : 网址 : 邮箱 :Huiyanbio@126.com 第 5 页共 5 页

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