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HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF His 标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂产品信息产品名称产品编号规格储存 HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF (His 标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂 ) 20503ES10 10ml 4 HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF (His 标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂 )

1 HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF His 标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂产品信息产品名称产品编号规格储存 HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF (His 标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂 ) 20503ES10 10ml 4 HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF (His 标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂 ) 20503ES50 50ml 4 HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF (His 标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂 ) 20503ES60 100ml 4 产品描述 HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF 以高度交联的 6% 琼脂糖凝胶为基质, 通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸 (NTA) 为配体, 螯合镍离子 (Ni 2+ ) 后, 形成非常稳定的八面体结构, 镍离子处于八面体的中心, 这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻, 更加稳定, 可以耐受一定浓度的还原剂变性剂或耦合剂等苛刻条件此外, 因其基质的耐压性 ( 可耐受最高 0.3 MPa 的压力 ), 该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化, 可在相对较高的流速下, 实现对目的蛋白的纯化产品性质基质 (Matrix) 粒径 (Bead size) 载量 (Capacity) 耐压 (Tolerance Pressure max ) 储存缓冲液 (Buffer) 高度交联的 6% 琼脂糖凝胶 µm >40mg 6 His-tagged protein/ml 基质 0.3MPa, 3bar 含 20% 乙醇的 1 PBS 运输和保存方法冰袋运输 4 保存有效期 2 年注意事项为了您的安全和健康, 请穿实验服并戴一次性手套操作使用方法 ( 一 ) 纯化流程 1 缓冲液的准备缓冲液使用原理 : 低咪唑上样, 高咪唑洗脱, 或者高 ph 上样, 低 ph 洗脱 Buffer 在使用前最好用 0.22µm 或 0.45µm 滤膜过滤除菌可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表 2 包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表 3 2 样品准备 2.1 细菌表达的蛋白 ( 本说明以细菌表达的蛋白纯化为例 ) 1) 挑取单菌落到含有适合抗性的 LB 培养基中, 根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间 2) 表达结束后, 将培养液转至离心瓶,7000rpm, 离心 15min, 收集菌体, 然后加入 1/10 体积的裂解液 (Lysis buffer) 和 PMSF(PMSF 在破碎前加入, 其终浓度为 1mM), 同时也可加入其他蛋白酶抑制剂, 但不能影响目的蛋白与树脂的结合 3) 之后加入溶菌酶, 使其工作浓度为 1mg/ml 注 : 如果表达的宿主细胞内含 plyss 或 plyse, 可以不加入溶菌酶 4) 将菌体沉淀悬浮起来 ( 如果菌液浓度高, 可考虑加入 10µg/ml RNase A 和 5µg/ml DNase I), 混匀, 置于冰上超声破碎细胞, 至菌液基本保持澄清 5) 收集上述澄清蛋白液至离心管中,10000rpm,4 离心 20-30min 取上清, 置于冰上备用或 -20 保存第 1 页, 第 5 页

2 2.2 酵母昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白将细胞培养液转移至离心瓶,5000rpm 离心 10min, 收集上清如上清中不含 EDTA 组氨酸和还原剂等, 即可直接上柱纯化 ; 如含有 EDTA 组氨酸和还原剂等物质, 则需用 1 PBS 4 下透析后方可上柱注 : 对于大量体积的上清, 需加入硫酸铵进行沉淀浓缩, 之后经 1 PBS 4 下透析后上柱 2.3 包涵体蛋白纯化 ( 以细菌为例 ) 1) 将培养液转移至离心瓶,7000rpm, 离心 15min, 收集菌体去上清 2) 按照菌体 : 裂解液 =1:10(w/v) 的比例将菌体充分悬浮, 混匀, 冰浴超声破碎 3) 将破碎液转移至离心管,10000rpm,4 离心 20-30min, 去上清可重复步骤 2) 和 3) 一次 4) 按照菌体 : 裂解液 ( 含 8M 尿素 )=1:10(w/v) 的比例将包涵体充分悬浮 5) 变性条件下纯化 His 标签蛋白纯化 3 装柱 1) 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头, 确保柱底筛板上无气泡, 关闭柱底出口, 并在柱底部留出 1-2cm 的去离子水 2) 将树脂悬浮, 小心地将浆液连续地倒入层析柱中用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生 3) 如果使用储液器, 应立即在层析柱和储液器中加满水, 将进样分配器放置于浆液表面, 连接至泵上, 避免在分配器或进样管中产生气泡 4) 打开层析柱底部出口, 开启泵, 使其在设定的流速下进行最初应让缓冲液缓慢流过层析柱, 然后缓慢增加至最终流速, 这样可避免液压对所形成柱床的冲击, 也可以避免柱床形成的不均匀如达不到推荐的压力或流速, 可以用所用泵的最大流速, 这样也可以达到一个较好的装填效果当柱床高度稳定后, 在最后的装柱流速下至少再上 3 倍柱体积的去离子水标上柱床高度注 : 在随后的色谱程序中, 不要超过最大装柱流速的 75% 5) 关闭泵, 关闭层析柱出口 6) 如使用储液器, 去除储液器, 将分配器置于层析柱中 7) 将分配器推向柱子至标记的柱床高度处允许装柱液进入分配器, 锁紧分配器接头 8) 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中, 开始平衡如需要可重新调整分配器 4 样品纯化装柱后, 可用各种常规的中压色谱系统, 以 AKTA 使用为例进行说明 : 1) 将泵管道注满去离子水去掉产品上塞, 连接至色谱系统中, 打开下出口, 将纯化柱连接到色谱系统中, 注意旋紧 2)3-5 倍柱体积去离子水冲洗纯化柱 3) 至少 5 倍柱体积的 Lysis Buffer 平衡色谱柱 1ml 规格预装柱推荐流速为 1ml/min,5ml 预装柱推荐流速为 5ml/min 4) 利用泵或注射器上样, 收集流出液, 以便 SDS-PAGE 检测蛋白结合情况注 : 若样品粘度增加, 即使上样体积很少也会导致层析柱很大反压 ; 上样量不要超过柱子的结合能力 ; 大量样品体积也可能造成很大的反压, 使得进样器更难使用 5)Wash Buffer 平衡柱子, 直到紫外吸收达到一个稳定的基线 ( 一般至少个柱体积 ) 注 : 在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度 6)Elution Buffer 一步法或梯度法进行洗脱一步法洗脱中一般 5 倍柱体积洗脱液即可梯度洗脱可以用一个小的梯度, 例如 20 倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质 7) 建议用更高浓度咪唑 ( 如 500mM) 彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白随后依次用 3 倍柱体积的 Lysis Buffer 和 5 倍柱体积的去离子水清洗树脂 5 倍柱体积的 20% 乙醇平衡树脂, 最后将树脂保存在 20% 乙醇的 1 PBS 中, 置于 4 保存 5 SDS-PAGE 检测将纯化过程中得到的样品 ( 包括原始样品流出组分洗杂及洗脱组分等 ) 利用 SDS-PAGE 进行检测, 判定其纯化效果 ( 二 ) 在位清洗当填料使用过程中发现反压过高 (>0.5Mpa) 或者填料上面出现明显的污染时, 需对其进行在位清洗 (Cleaning-in-Place, CIP) 在位清洗时, 先把 Ni 2+ 脱掉, 清洗结束后, 将填料保存在 20% 乙醇中, 后者重新挂 Ni 后再保存在 20% 乙醇中建议按照下面操作去除填料上残留的污染物, 如沉淀蛋白疏水蛋白和脂蛋白等 1 去除强疏水结合的蛋白, 脂蛋白和脂类使用 30% 异丙醇清洗 5-10 个柱体积, 接触时间为 15-20min 可以去除此类污染物之后再用去离子水清洗 10 倍柱体积也第 2 页, 第 5 页

3 可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料 2 倍柱体积例如含有 % 非离子去污剂的 0.1M 醋酸溶液, 接触时间为 1-2h 去污剂处理后, 需用 70% 的乙醇清洗 5 倍柱体积, 彻底去除去污剂最后利用去离子水清洗 10 倍柱体积 2 去除离子作用结合的蛋白使用 1.5M NaCl 溶液接触 10-15min, 之后用去离子水清洗 10 倍柱体积 ( 三 ) 填料再生当填料使用过程中发现反压过高 (>0.5Mpa), 填料上面出现明显的污染, 或填料载量明显变低时, 需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理, 即填料再生按照下面操作流程进行 : 1) 使用 0.2M 醋酸溶液 ( 含 6M GuHCl) 清洗 2 倍柱体积 ; 2) 去离子水清洗 5 倍柱体积 ; 3)2%SDS 清洗 3 倍柱体积 ; 4) 去离子水清洗 5 倍柱体积 ; 5) 乙醇清洗 5 倍柱体积 ; 6) 去离子水清洗 5 倍柱体积 ; 7)100mM EDTA(pH 8.0) 清洗 5 倍柱体积 ; 8) 去离子水清洗 5 倍柱体积 ; 9)100mM NiSO 4 清洗 5 倍柱体积 ; 10) 去离子水清洗 10 倍柱体积填料再生后, 可立即使用, 也可保存在 20% 乙醇中, 置于 4 备用附表 1 HisSep Ni-NTA Agarose Resin 试剂耐受情况试剂种类还原剂变性剂去污剂其他类浓度 5mM DTE mm DTT 20mM β-mercaptoethanol 5mM TCEP 10mM reduced glutathione 8M urea 6M Gua-HCl 2% Triton TM X-100(nonionic) 2% Tween TM 20(nonionic) 2% NP-40(nonionic) 2% Cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic) 500mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 缓冲液 100mM Na 2 SO 4 1.5M NaCl 1mM EDTA 60mM citrate 50mM sodium phosphate, ph mM Tris-HCl, ph mM Tris-acetate, ph mM HEPES, ph mM MOPS, ph mM sodium acetate, ph7.4 第 3 页, 共 5 页

4 附表 2 可溶性 His 标签蛋白纯化所需缓冲液及配方缓冲液名称配方配制 1L 溶液所需各种试剂量 Lysis Buffer (ph8.0) 50mM NaH 2 PO 4 10 mm imidazole Wash Buffer (ph8.0) 50mM NaH 2 PO 4 20 mm imidazole Elution Buffer(pH8.0) 50mM NaH 2 PO mm imidazole Imidazole 0.68g Imidazole 1.36g Imidazole 17.0g 附表 3 包涵体 His 标签蛋白纯化所需缓冲液及配方缓冲液名称配方配制 1L 溶液所需各种试剂量 Lysis Buffer (ph8.0) 8M Urea 盐酸溶液调 ph 至 8.0, 0.22µm 或 0.45µm 过滤除菌 Wash Buffer (ph6.3) 8M Urea 盐酸溶液调 ph 至 6.3, 0.22µm 或 0.45µm 过滤除菌 Elution Buffer(pH4.50) 8M Urea 盐酸溶液调 ph 至 4.5, 0.22µm 或 0.45µm 过滤除菌第 4 页, 第 5 页

5 附表 4 问题及解决方案问题可能原因推荐解决方案柱子反压过高填料被堵塞裂解液中可能含微小的固体颗粒, 建议上柱前使用滤膜样品太黏稠 (0.22µm 或 0.45µm) 过滤, 或离心去除样品中含高浓度的核酸, 延长破碎时间直至粘度降低, 或添加 DNaseI ( 终浓度为 5µg/ml), Mg 2+ ( 终浓度 1mM), 冰上孵育 10-15min 有机试剂或蛋白稳定试剂 ( 如甘油等 ) 可能会引起反压增高, 降低操作流速洗脱组分中无目的蛋白蛋白可能是包涵体可通过电泳检测裂解液, 分析上清中是否有目的蛋白, 包表达量太低目的蛋白结合比较弱, 在洗杂步骤中已被洗下来目的蛋白结合过强, 不容易洗脱下来蛋白降解涵体蛋白需按照包涵体蛋白的纯化方式优化表达条件, 使用包涵体纯化缓冲体系提高 Wash Buffer 的 ph 值, 或者降低咪唑浓度降低 Elution Buffer 的 ph, 或者增加 Elution Buffer 中的咪唑浓度使用 mM EDTA 溶液剥离镍离子, 同时得到蛋白菌体破碎时需添加一些蛋白酶抑制剂在 4 下进行纯化操作洗脱组分不纯 ( 含多种蛋白 ) 洗杂不彻底增加 Wash Buffer 体积样品中含有其他 His 标签蛋白通过调节 ph 值或咪唑浓度来优化洗杂条件再使用其他纯化手段 ( 如去离子交换, 疏水等 ) 进一步纯化洗脱组分填料颜色变浅或变成白色镍离子脱落或者剥离按照填料再生的操作重新挂镍离子填料呈现褐色缓冲液中含有 DTT 等还原剂参考附 3 适当降低还原剂 DTT 的浓度, 或改用巯基乙醇上样过程中蛋白发生沉淀操作温度太低室温下进行上样蛋白发生聚集在样品和所有缓冲液中添加稳定剂, 如 0.1%Triton X-100 或 Tween-20 相关产品 20502ES10 HisSep Ni-NTA Agarose Resin (His 标签蛋白琼脂糖纯化树脂 ) 10ml 20502ES50 HisSep Ni-NTA Agarose Resin (His 标签蛋白琼脂糖纯化树脂 ) 50ml 20502ES60 HisSep Ni-NTA Agarose Resin (His 标签蛋白琼脂糖纯化树脂 ) 100ml 20504ES08 HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5ML(His 标签蛋白纯化预装柱,5ML) 5ml 20504ES25 HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5ML(His 标签蛋白纯化预装柱,5ML) 5 5ml 20505ES03 HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 1ML(His 标签蛋白纯化预装柱,1ML) 1ml 20505ES08 HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 1ML(His 标签蛋白纯化预装柱,1ML) 5 1ml 本产品仅作科研用途! 第 5 页, 第 5 页

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