Uni HR 疏水层析介质生物大分子纯化使用说明书 Uni HR Phenyl Uni HR Butyl NanoHR Phenyl NanoHR Butyl 使用之前请认真阅读产品使用手册苏州纳微科技有限公司 Suzhou Nano-Micro Tech,Co.,Ltd

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铺孟
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1 Uni HR 疏水层析介质生物大分子纯化使用说明书 Uni HR Phenyl Uni HR Butyl NanoHR Phenyl NanoHR Butyl 使用之前请认真阅读产品使用手册苏州纳微科技有限公司 Suzhou Nano-Micro Tech,Co.,Ltd

2 通用缩略术语 : HIC: 疏水层析 280 nm: 在指定波长的紫外吸收 M: 物质的量的浓度单位,mol/l 的简写 mm: 物质的量的浓度单位,mmol/l 的简写 BV: 柱体积,bed volume 的简写 Mr: 相对分子量 MPa: 兆帕斯卡 Bar: 压强单位, 工程上公斤力的单位 psi: 压强单位, 磅每平方英寸压强单位之间换算 :1 MPa = 10 bar 145 psi 单分散疏水层析介质产品命名规则 Uni HR Phenyl-80L 含义 : 1 注册商标 -- 单分散填料 2 功能团 --( Phenyl, Butyl) 3 粒径型号 4 孔径 --( 单位 :Å,S: 500 Å, L: 1000 Å)

3 索引目录 1. 疏水层析产品简介层析纯化操作步骤层析柱装填柱效评价清洗平衡上样洗脱再生在位清洗储存故障排除... 6 订购信息... 8

4 1. 疏水层析产品简介疏水层析是利用生物分子表面的疏水性能差异实现分离在高盐条件下生物分子吸附在疏水层析介质的疏水基团上, 降低盐浓度时, 不同蛋白按疏水性从弱到强依次被洗脱, 从而达到分离纯化的目的疏水层析操作条件温和分辨率高, 是生物大分子分离纯化常用的方法之一纳微科技提供的疏水层析介质是以聚合物 ( 聚丙烯酸酯或聚苯乙烯 - 二乙烯基苯共聚物 ) 为基质, 该基质经过表面亲水改性后再键合疏水基团, 比如苯基和丁基等, 同时具备对生物活性大分子良好的相容性和优秀的物理及化学稳定性, 极大地提高了纯化效率纳微科技提供两种系列 (UniHR 和 NanoHR) 的疏水层析介质产品, 涵盖了对抗体蛋白质多肽核酸等大分子的捕获中度纯化精细纯化等纯化阶段的应用表 1.1 纳微科技疏水层析介质简介产品系列 Uni HR 系列 NanoHR 系列基质聚丙烯酸酯聚苯乙烯 - 二乙烯基苯基团 Phenyl( 苯基 ) 或 Butyl( 丁基 ) Phenyl( 苯基 ) 或 Butyl( 丁基 ) 孔径 (Å) 粒径 (μm) 纯化阶段捕获中度纯化精细纯化主要特点主要应用 * 疏水性由强到弱 : 苯基 > 丁基骨架亲水性好, 生物相容性好, 耐碱性, 样品高回收率适合抗体蛋白质多肽核酸抗生素等生物分子的捕获和纯化分辨率较高耐压性好寿命长可长时间耐强酸强碱适合抗体蛋白质多肽核酸等生物分子的精细纯化 2. 层析纯化操作步骤 2.1 层析柱装填匀浆液的浓度是指层析介质沉降至恒定体积时的体积与匀浆液的总体积的比值为了获取最佳的 UniHR 疏水层析介质的装柱效果, 我们推荐 0.5 M NaCl 平衡过夜, 再用 0.5 M NaCl 溶液进行匀浆, 匀浆液浓度为 65~70% 具体装柱方法如下 : 1) 首先计算所装色谱柱的柱体积 Vc,Vc=Ac L,Ac=π r 2 * Vc: 色谱柱柱体积 ;Ac: 色谱柱横截面积 ;L: 色谱柱高度 ;r: 色谱柱半径 2) 在原容器中轻轻搅动疏水层析介质, 使其完全分散在液体中形成匀浆液量取所需原液的质量或体积 * * 一般情况下, 疏水层析介质在压力作用下都会被压紧导致体积收缩, 为了获得紧密的柱床, 推荐介质的体积过量一些, 一般为柱体积的 1.2 倍左右 3) 倾出介质中 20% 乙醇保存液, 用 0.5 M NaCl 溶液置换 20% 乙醇, 平衡过夜 4) 装柱之前, 用 0.5 M NaCl 溶液调整匀浆浓度为 65 ~ 70%; 将匀浆一次性倒入层析柱,

5 沉降平衡后标注高度 5) 将分配器装入, 调节高度使得压缩系数为 1.05 ~ 1.10; 然后启动输液泵, 用 1.5~2 倍工作流速使柱床稳定 (-2 柱体积 ) 6) 按照 SOP 进行柱效和对称性的测定, 须达到预定标准 2.2 柱效评价装好的色谱柱应使用 2 BV 0.5 M NaCl 溶液平衡, 再用 2.0 M NaCl 以 100 cm/h 流速进行柱效测试, 具体测试参数详见下表 : 表 2.2 疏水层析色谱柱的柱效测试样品 : 上样量 : 洗脱液 : 线性流速 : 检测 : 2 M NaCl 溶液 1~5 % 柱体积 0.5 M NaCl 溶液 100 cm/h 280 nm 2 M NaCl 上样 : 电导检测仪 2.3 清洗装好的色谱柱应使用至少使用 5 BV 的去离子水清洗 2.4 平衡在进行柱层析前, 使用 3 到 5 倍柱体积的流动相一般为缓冲液, 如 :20 mm PBS M NaCl, ph 7.0 平衡 2.5 上样固体样品可用平衡液溶解配制 ; 低浓度样品溶液可用平衡液透析 ; 高浓度样品溶液可用平衡液稀释为了避免堵塞层析柱, 样品应经离心或膜过滤处理进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算, 上样前确保样品缓冲液应尽可能与平衡液一致

6 2.7 洗脱上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线稳定, 可以根据实际情况采取降低盐浓度或改变流动相 ph 的方法依次洗脱吸附于层析介质上的样品 2.8 再生每次层析之后可用 3~5 BV 低离子强度的缓冲液流速再生层析柱, 除去疏水结合较强 ( 可逆结合 ) 的蛋白, 然后用 5 BV 的去离子水清洗, 最后 5 BV 平衡缓冲液平衡层析柱 2.9 在位清洗为了保持层析柱的性能, 若有蛋白质或其他杂质在再生过程中未能有效去除, 可执行在位清洗步骤, 在位清洗时, 也可采用反向冲洗的方法, 具体操作步骤如下 : (1) 对沉淀蛋白以疏水性结合的蛋白或脂蛋白, 可用 0.2~0.5 M NaOH 清洗 ( 与层析介质接触时间 1 ~ 2 小时 ), 并用 5 BV 以上平衡液和 3 BV 以上的去离子水清洗 ; (2) 对强疏水性结合的蛋白脂蛋白和脂类物质, 可用 5 BV 以上的 50% 乙醇或 30% 异丙醇清洗 ( 与层析介质接触时间 0.5~1 小时 ), 并用 5 BV 以上的去离子水清洗也可以用含非离子表面活性剂的碱性或酸性溶液清洗, 如用 0.1~0.5% 的 Triton X M 乙酸清洗 1 ~ 2 小时, 并用 5 BV 以上的 50% 乙醇冲洗去除去污剂, 然后用 5 BV 以上的纯水冲洗 ( 使用高浓度的有机溶剂时, 为了避免产生气泡, 应采用逐步增加有机溶剂浓度的方法 ) 3. 储存暂时不使用的层析介质需保存在 4~35 o C 的 20% 乙醇中, 并盖紧瓶盖, 已经装好层析柱应保存在含 20% 乙醇的缓冲液 (ph 7.0) 中 4. 故障排除如果您在使用疏水亲和层析介质中遇到任何问题, 请参考下表进行解决或联系苏州纳微科技有限公司表 4.1 疏水层析柱常见问题及故障排除情况原因措施柱压升高流速过高减小流速泵和收集器之间的阀门未打开打开出口仪器的滤膜堵塞除去并清洗, 可能的话替换在使用前过滤样品和洗脱液柱前堵塞使用 20BV 流动相反冲色谱柱

7 情况原因措施样品在柱子上发生沉淀遵循清洗步骤, 调节洗脱液来维持样品溶解度样品较脏, 或一些吸附作用较强的物质留在填执行在位清洗操作 ( 参考再生条件 ) 料上柱床被压缩重新装填柱子色谱柱使用时间过长更换色谱柱或更换色谱填料样品吸附不够充分样品溶液中离子强度太低可采用在上样液中加入盐提高上样液的离子强度样品在洗脱过程中不被洗脱样品溶液的 ph 不合适洗脱液的离子强度过高洗脱液的洗脱能力过低调节 ph 增加结合降低洗脱液的浓度更换洗脱能力更强的洗脱液洗脱液的 ph 不合适调整洗脱液的 ph 色谱柱有残留疏水性较强的杂质执行在位清洗操作 ( 参考再生条件 ) 分辨率降低不合适的洗脱条件, 如梯度过陡或流速过高柱子未装填好改变洗脱条件, 采用较缓的梯度洗脱或等度洗脱, 降低流速重新装柱在柱子顶端或柱后有大部分的混合空间加高填料的上表面或减少柱子后体积柱子过载清洗并重新平衡色谱柱, 降低上样量粒径较大更换同种类型粒径更小的填料选择性差更换其他功能基团的层析介质进样若干次后对样品的吸附能力样品中的杂质结合在填料上, 干扰了正常的结降低合执行在位清洗操作 ( 参考再生条件 ) 使用中柱床出现裂痕溶胀未充分消除用 0.5 M NaCl 混合均匀, 充分平衡溶液中有气泡减压过滤除气外部空气进入系统加入更多缓冲液, 将气体充分赶出色谱柱未平衡好增加平衡时间基线漂移洗脱液 A,B 在同一紫外波长下吸收系数不同使用不同的波长或走没有样品的空白梯度洗脱液不纯使用高纯度的 HPLC 级试剂出现不明杂峰前一个样品的不完全洗脱洗脱色谱柱洗脱液不纯运行没有样品的空白梯度对照, 或使用高纯度的 HPLC 级别试剂痕量杂质结合在色谱柱上, 在平衡和上样过程中被浓缩, 洗脱时出峰不稳定的非重现性的鬼峰清洗色谱柱 ( 参考再生条件 ) 或采取适当方法将结合在色谱柱上的杂质洗脱下来与仪器的不稳定有关

订购信息产品名称 UniHR 系列 : 捕获和中度纯化官能基团粒径孔径最大耐压建议线性流速 ph 稳定范围动态吸附载量 1 2 μm Å MPa cm/h mg/mlgel Uni HR Butyl-30S Butyl 35 500 1.0 50-300 2-12 20 Uni HR Phenyl-30S Phenyl 35 500 1.

8 订购信息产品名称 UniHR 系列 : 捕获和中度纯化官能基团粒径孔径最大耐压建议线性流速 ph 稳定范围动态吸附载量 1 2 μm Å MPa cm/h mg/mlgel Uni HR Butyl-30S Butyl Uni HR Phenyl-30S Phenyl Uni HR Butyl-30L Butyl Uni HR Phenyl-30L Phenyl Uni HR Butyl-60S Butyl Uni HR Phenyl-60S Phenyl Uni HR Butyl-80L Butyl Uni HR Phenyl-80L Phenyl NanoHR 系列 : 高分辨率, 精细纯化首选 NanoHR Butyl-15L Butyl NanoHR Phenyl-15L Phenyl ph 稳定范围指使用再生在位清洗的 ph 区间 2. 动态吸附载量使用 Lysozyme 测试注 : 其他规格的产品可特殊定制全国服务热线 : 苏州纳微科技有限公司 (Suzhou Nanomicro Technology, Co. LTD) 地址 : 苏州工业园区百川街 2 号江苏中国售后邮箱 :info@nanomicrotech.com 中文官网 : English Website:

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