Glutathione Beads 4FF 1022.doc

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悟尤
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1 Glutathione Beads 4FF 目录 1. 产品介绍纯化流程填料清洗问题及解决方案.3 5. 订购信息及相关产品 4 1. 产品介绍 Glutathione Beads 4FF 可以纯化各种表达系统融合表达的谷胱甘肽 -S- 转移酶的目的蛋白谷胱甘肽依赖性蛋白和谷胱甘肽转移酶的重组衍生物 Glutathione Beads 4FF 是以高度交联的 4% 琼脂糖凝胶为基质, 因其耐压的基质, 该产品更适合用于工业大规模蛋白的纯化, 可以在相对较高的流速下, 实现对目的蛋白的纯化 Glutathione Beads 4FF 可以耐受最高 0.3 MPa 的压力, 更稳定具体性能见表 1 表 1. Glutathione Beads 4FF 产品性能性能指标基质配体载量 (/ml 介质 ) 高度交联的 4% 琼脂糖微球通过 12 原子间隔臂偶联的谷胱甘肽 >10 mg GST 蛋白 (40 kda) 粒径 (μm) 最大流速 0.3 MPa, 3bar ph 稳定范围 3-12 储存缓冲液 20% 乙醇储存温度 2 C -8 C 2. 纯化流程 2.1 Buffer 的准备所用水和 Buffer 在使用之前建议用 0.22μm 或 0.45 μm 滤膜过滤结合 / 洗杂 Buffer: PBS, ph 7.4 (140 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 10 mm Na 2 HPO 4,1.8 mm KH 2 PO 4,pH 7.4) 洗脱 Buffer: 50 mm Tris-HCl, 10 mm 还原型谷胱甘肽,pH 8.0 注意 : 结合液和洗脱液中可加入 1 10 mm DTT 2.2 样品准备样品在上样前建议离心或用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤, 减少杂质, 提高蛋白纯化效率 1 / 5 常州天地人和生物科技有限公

2 和防止堵塞柱子 2.3 Glutathione Beads 4FF 装填 Glutathione Beads 4FF 被广泛应用于工业纯化, 因此, 涉及到各种中压色谱层析柱的填装, 下面介绍使用 Glutathione Beads 4FF 填装层析柱的方法层析柱的装填 ( 使用储液器装填 ) 1. 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头, 确保柱底筛板上无气泡, 关闭柱底出口, 并在柱底部留出 1-2cm 的去离子水 2. 将树脂悬浮起来, 小心的将浆液连续地倒入层析柱中用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生 3. 如果使用储液器, 应立即在层析柱和储液器中加满水, 将进样分配器放置于浆液表面, 连接至泵上, 避免在分配器或进样管中产生气泡 4. 打开层析柱底部出口, 开起泵, 使其在设定的流速下进行最初应让缓冲液缓慢流过层析柱, 然后缓慢增加至最终流速, 这样可避免液压对所形成柱床的冲击, 也可以避免柱床形成的不均匀如果达不到推荐的压力或流速, 可以用你所使用泵的最大流速, 这样也可以得到一个很好的装填效果 ( 注意 : 在随后的色谱程序中, 不要超过最大装柱流速的 75%) 当柱床高度稳定后, 在最后的装柱流速下至少再上 3 倍柱床体积的去离子水标上柱床高度 5. 关闭泵, 关闭层析柱出口 6. 如果使用储液器, 去除储液器, 将分配器至于层析柱中 7. 将分配器推向柱子至标记的柱床高度处允许装柱液进入分配器, 锁紧分配器接头 8. 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中, 开始平衡如果需要可以重新调整分配器 2.4 样品纯化 1. 将 Glutathione Beads 4FF 装入合适的层析柱, 层析用 5 倍柱体积的结合 Buffer 进行平衡, 使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下, 起到保护蛋白的作用 2. 将样品加到平衡好的 Glutathione Beads 4FF 中 ( 保证目的蛋白与 Glutathione Beads 4FF 充分接触, 提高目的蛋白的回收率 ), 收集流出液 3. 用倍柱体积的洗杂 Buffer 进行清洗, 去除非特异性吸附的杂蛋白, 收集洗杂液 4. 使用 5-10 倍柱体积的洗脱 Buffer, 收集洗脱液, 即目的蛋白组分 5. 依次使用 3 倍柱体积的结合 Buffer 和 5 倍柱体积的去离子水平衡填料, 最后再用 5 倍柱体积的 20% 的乙醇平衡, 然后保存在等体积的 20% 的乙醇中, 置于 4 度保存, 防止填料被细菌污染 2.4 SDS-PAGE 检测将使用纯化产品得到的样品 ( 包括流出组分洗杂组分和洗脱组分 ) 以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果 2 / 5 常州天地人和生物科技有限公

3 3. 填料清洗 GST 标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生, 但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集, 往往造成流速和结合载量都下降, 这时需要对树脂进行清洗去除一些沉淀或变性物质用 2 倍柱体积的 6M 盐酸胍溶液进行清洗, 然后立即用 5 倍柱体积的 PBS, ph 7.4 清洗去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质用 3-4 倍柱体积的 70% 乙醇或 2 倍柱体积的 1% Triton X-100 清洗, 然后然后立即用 5 倍柱体积的 PBS, ph 7.4 清洗 4. 问题及解决方案问题原因分析推荐解决方案柱子反压过高填料被堵塞按照第 3 部分进行树脂清洗洗脱组分中没有目的蛋白目的蛋白没有完全洗脱下来 3 / 5 常州天地人和生物科技有限公样品太粘稠缓冲液太粘稠 GST 标签蛋白变性了过度的裂解使目的蛋白变性目的蛋白聚集产生了沉淀融合蛋白改变了 GST 的构象, 影响了目的蛋白的结合力柱子平衡时间太短, 目的蛋白不是在 ph6.5-ph8 范围内结合的洗脱体积太少洗脱液中谷胱甘肽浓度太低低 ph 影响洗脱裂解液中含有微小的固体颗粒, 建议上柱前使用滤膜 (0.22 或 0.45 μm) 过滤, 或者离心去除样品中含有高浓度的核酸, 加长破碎时间直至粘度降低, 或者添加 DNase I ( 终浓度 5 μg/ml),mg 2+ ( 终浓度 1mM), 冰上孵育分钟有机溶剂或者蛋白稳定试剂 ( 如甘油等 ) 可能会引起反压增高, 降低操作流速使用温和的裂解条件, 实验条件以经验为准在细胞裂解前溶液中加入 DTT, 终浓度为 1 20 mm 测定 pgex 中 GST 的结合力, 对载体进行超声处理, 检测其结合力如果载体中 GST 有很高的亲和力, 有可能改变融合蛋白的构象从而降低了 GST 标签蛋白的亲和力降低结合温度至 +4 C, 充分地清洗用 ph 6.5 ph 8.0 的 Buffer 进行充分的平衡 ( 例如 PBS) 增加洗脱液体积, 减小洗脱流速增加洗脱液中谷胱甘肽浓度, 可尝试用 50 mm Tris-HCl, mm 还原型谷胱甘肽, ph 8.0 洗脱在不增加洗脱液中的谷胱甘肽量时, 提高洗脱液中 ph 至 ph 8 9 会有改善增加洗脱液中离子强度, 如 M

4 电泳或 western blot 检测中发现多条带 4 / 5 常州天地人和生物科技有限公洗脱液中的谷胱甘肽被氧化非特异性疏水作用影响目的蛋白的溶解与洗脱 Mr 蛋白与目的蛋白一起被纯化出来 GST 融合蛋白已经发生降解细胞破碎过度共价共纯化 5. 订购信息及相关产品抗体与 E. coli 的各种蛋白反应 NaCl 使用新鲜配制的洗脱液加入 DTT 洗脱液中加入非离子型洗涤剂, 如 0.1% 的 Triton X-100 或者 2% 正辛基 -β-d- 吡喃葡糖苷 Tween-20 Mr 的蛋白有可能是大肠杆菌基因 dnak 的产物, 可以通过在目的蛋白中加入 50 mm Tris-HCl, 2mM ATP,10 mm MgSO 4,pH 7.4 在 37 C 加热 10 分钟去除可以通过 ATP- 琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的 DnaK 蛋白在裂解液中加入蛋白酶抑制剂, 如加入 1 mm PMSF 有可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的, 可以使用蛋白酶缺陷型宿主菌 ( 如 lon- 或 ompt) 减少细胞破碎时间, 超声前加入溶菌酶 ( 菌液体积的 0.1 倍的 10 mg/ml 溶菌酶,25 mm Tris-HCl, ph8.0), 避免发泡导致蛋白变性, 过度超声破碎增加宿主内源蛋白与 GST 融合目的蛋白的共纯化包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化, 如 :DnaK (Mr ~70 000), DnaJ (Mr ~37 000), GrpE (Mr ~40 000),GroEL (Mr ~57 000) 和 GroES (Mr ~10 000) 可再进行一次纯化可以改善抗体吸附 E. coli 蛋白 :GST- 抗体超声处理去除 GST 抗体, 可以用 Western Blots 检测名称货号规格 Glutathione Beads SA mL SA SA mL 100mL SA008C 定制 * GSTPur Glutathione Kit SA008K 3 次 Glutathione Beads 4FF SA mL SA SA mL 100mL SA010C 定制 * GSTCap 4FF SA010C11 1X1mL SA010C51 5x1mL

5 SA010C15 SA010C55 SA010CS 1X5mL 5X5mL 3X1mL+1X5mL * 定制是指向客户提供同一系列的非常规产品 ( 包括不同的基质, 不同载量或者大包装产品等 ) 5 / 5 常州天地人和生物科技有限公

Polyclonal Goat Anti-Rabbit IgG *HRP

Polyclonal Goat Anti-Rabbit IgG *HRP 亲硫层析介质 (6FF) Thiophilic Adsorbent Beads 6FF 货号 BDTL0025-5 BDTL0025-10 BDTL0025-50 BDTL0025-250 规格 50ml 250ml 1. 产品介绍本品可以快速有效地从血清腹水或组织培养液中纯化抗体本品的配体主要通过与抗体形成电子供体 - 受体复合物, 从而达到对抗体的选择性吸附本品使用耐压的基质, 可以耐受最高