N5289 Ni 亲和层析预装柱使用说明专业实验仪器耗材提供商

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2 N5289 Ni 亲和层析预装柱使用说明预装柱介绍 Ni 亲和预装柱是专为实验室蛋白质核酸及多肽的分离纯化, 尤其是组氨酸标记蛋白质的分离纯化而设计的亲和柱, 有 1ml 和 5ml 两种规格柱管采用生物耐受性的聚丙烯材料, 具有无毒不与生物分子结合及低溶解度的优点预装柱的 1/16 英寸接口, 可随实验条件不同与注射器蠕动泵或色谱系统配套使用 Ni 亲和预装柱是以 6% 琼脂糖凝胶为载体, 亚氨基二乙酸 (IDA) 为配基, 并螯合金属离子 Ni 2+ 而形成的一种亲和层析介质具有吸附容量大选择性好易于再生成本较低等优点预装 Ni50, 是 50um 聚甲基丙烯酸基质的 Ni 2+ 离子亲和介质, 具有载量高分辨率高流速高耐压性好等优势柱子规格柱体积 1 ml 5 ml 柱尺寸 I.D mm I.D mm 最大流速 4 ml/min ml/min 推荐流速 ml/min 1-5 ml/min 最大压力 3 bar 3 bar 注意 : 预装柱不可拆开或自行填装填料规格两端的堵头确保拧紧以免贮存液泄漏参数描述基材类型 6% 交联琼脂糖凝胶平均粒径 μm 90 功能基团离子密度动态载量 a 推荐流速 -N(CH 2 COOH) 2 (IDA) ~40 μmol Ni 2+ /ml wet gel >25 mg( 肌红蛋白 )/ml wet gel cm/h (MPa) M HCl 0.1 M NaOH(37, 7 天 );1 M NaOH 70% 乙酸 (12 h);30% 异化学稳定性 b 丙醇 (30 min);2% SDS(1 h) 避免使用的试剂螯合剂, 如 EDTA EGTA 柠檬酸等 ph 操作范围 b 2-14( 短期,2 h);3-12( 长期,7 天 ) 储存条件 20% 乙醇,4-30 动态载量 a 样品 : 平衡缓冲液中含 1 mg/ml 肌红蛋白 ;

3 平衡缓冲液 :20mM PB + 0.5M NaCl 咪唑, ph 7.4; 洗脱缓冲液 :20mM PB + 0.5M NaCl M 咪唑, ph 7.4; 流速 : 1 ml /min; 柱体积 :1 ml (7*25 mm I.D.) 计算方法 : 根据 10% 穿透点计算介质动态载量 (Q B, 10%) b: 未螯合 Ni 2+ 的介质操作说明螯合金属离子本介质可以根据需要, 螯合不同的金属离子, 如 Cu 2+ Ni 2+ 或 Zn 2+ 等 Cu 2+ 与蛋白质结合最强,Ni 2+ 与蛋白质结合适中,Zn 2+ 与蛋白质结合最弱, 可根据实际需要选择用户可选择购买螯合了相应金属离子的介质 ( 出厂时一般以螯合 Ni 2+ 的形式提供, 此时无需螯合金属离子步骤 ), 也可自行螯合具体的鳌合方法如下 : (1) 层析柱 ( 未螯合或再生后 ) 用 5CV 的纯水清洗 (5 ml/min, 下同 ); (2) 选择合适的金属离子 (Cu 2+ Zn 2+ Ni 2+ Co 2+ Fe 3+ 等 ), 溶解在中性或弱酸性溶液中, 浓度为用 0.2 mol/l, 过滤后使用, 其中 Fe 3+ 必须在低 ph(3.0) 下鳌合, 以防止 Fe 3+ 产生沉淀 ; (3) 用 5 CV 的金属离子溶液上柱, 鳌合金属离子 ; (4) 用 5 CV 以上的纯水清洗层析柱, 去除游离的金属离子此外, 也可以直接把清洗干净的介质和所要鳌合的金属离子溶液混合后在摇床上振荡过夜, 鳌合金属离子, 然后再装柱平衡用 5~10 个柱体积的起始缓冲液平衡柱床实际操作中, 一般选用中性 / 弱碱性 (ph 7-8) 的高盐 ( M NaCl 或其它中性盐 ) 缓冲液其中常用磷酸盐缓冲体系, 如 20 mm PB+0.5 M NaCl, ph 7.4 对于结合力较强的带组氨酸标记的蛋白质, 平衡缓冲液中可加入低浓度 (5-50 mm) 的咪唑 ( 具体浓度需要根据实验现象进行优化 ) 进样样品缓冲液应尽可能与平衡液一致固体样品可用平衡液溶解配制 ; 低浓度样品溶液可用平衡液透析 ; 高浓度样品溶液可用平衡液稀释为了避免堵塞层析柱, 样品应经离心或微滤处理为了减少杂蛋白在层析柱上的吸附, 可在确保目标蛋白吸附的情况下适当增加样品缓冲液中的咪唑 ( 具体浓度根据优化结果确定, 并与平衡缓冲液的咪唑浓度保持一致 ) 上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线洗脱一般采用竞争试剂咪唑进行洗脱, 并在洗脱缓冲液中加入一定浓度 ( M) 的 NaCl 以抑制离子交换作用洗脱缓冲液一般为 20 mm PB M NaCl M 咪唑,pH 7.4 可采用线性梯度或阶越式梯度洗脱 ( 洗脱时所需的咪唑浓度与所纯化蛋白的结合强度有关, 可通过洗

4 脱浓度优化得到 ) 对于包涵体蛋白, 相应地可在平衡上样和洗脱的缓冲液中加入 8 M Urea 或 6 M Gua-HCl 洗脱后再对变性蛋白进行复性 ( 备注 : 洗脱一般有两种方式 : 一是采用竞争试剂, 如咪唑 (0-0.5 M) 组氨酸( M) 氯化铵(0-2 M) 等将蛋白质从柱子上臵换下来 ; 二是减小 ph 值, 洗脱目标蛋白, 大多数蛋白质在 ph 4-6 的范围内可被洗下来用竞争试剂咪唑或减小 ph 值的方法洗脱蛋白质, 金属离子仍结合在柱子上 ; 若用竞争试剂组氨酸或氯化铵洗脱蛋白质, 会将金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来 ) 注意 : 配制缓冲液的水应为超纯水, 试剂至少为分析纯缓冲液及样品溶液使用前均需 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤在位清洗 (CIP: Clean-In-Place) 和再生清洗的目的是除去层析柱中残余的蛋白质细菌和其他污染物层析柱在使用过程中, 由于样品或杂蛋白的沉积脂类物质不可逆的吸附及其他污染引起色谱柱的堵塞柱压升高载量下降等现象, 因此为了避免上述污染的累积以延长色谱柱寿命, 需要对层析柱进行清洗和再生在位清洗 (CIP) 前, 需要预先去除介质上鳌合的金属离子 CIP 时, 可采用反向冲洗的方法 (1) 对于以离子键结合的蛋白, 可用 2-3 CV 以上的 2 M NaCl 清洗, 并用 3 CV 以上的纯水冲洗 (2) 对沉淀蛋白以疏水性结合的蛋白或脂蛋白, 可用 1M NaOH 清洗 (1-2 h), 并用 5-10 CV 平衡液和 3 CV 以上的纯水冲洗 (3) 对疏水性结合的蛋白脂蛋白和脂类物质, 可用 5-10 CV 的 70% 乙醇或 30% 异丙醇清洗 (15-20 min), 并用 5-10 CV 的纯水冲洗此外, 也可用 2 CV 含去污剂的碱性或酸性溶液清洗如用 % 的非离子去污剂 +0.1 M 乙酸冲洗 1-2 h, 并用 5-10 CV 的 70% 乙醇冲洗去除去污剂, 然后用 5-10 CV 的纯水冲洗介质使用数次 ( 约 3-20 次, 具体与原料来源样品体积等有关 ) 后, 或者螯合其它金属离子前, 需要进行再生处理首先用 2-3 CV 的纯水清洗层析柱, 然后用 5 CV 的 20 mm PB M NaCl +50 mm EDTA, ph 7.4 淋洗柱子, 再分别用 5 CV 的 20 mm PB M NaCl,pH 7.40 溶液和 5 CV 的纯水清洗柱子, 去除柱上残留的 EDTA 储存填装柱或散装填料均可保存于 20% 水溶液中, 柱两端堵头须拧紧, 臵于 4 ~30 下保存, 切勿冷冻!

5 问题及解决办法出现的问题引起原因及解决措施使用过程中柱压升高柱子堵塞引起, 清洗柱子使用黏度高的溶液时, 应降低流速上样过程中压力波动较大样品中的气泡引起, 洗脱峰变宽如果可能应对样品进行真空脱气洗脱缓冲液强度不够或污染物在柱子中积累所引起优化洗脱条件及清洗条件, 和 / 或提高清洗频率产率下降洗脱强度及清洗不够引起, 优化洗脱条件及清洗条件, 和 / 或提高清洗频率洗脱过程中出现沉淀洗脱条件及清洗不够理想引起, 清洗过程中压力过高柱效下降, 优化洗脱条件及清洗无效优化洗脱条件及清洗条件, 和 / 或提高清洗频率柱子中的蛋白沉淀引起优化洗脱条件和 / 或在清洗前用酸性溶液 (ph3 或更低 ) 进行再生, 采用低流速更换新柱子, 柱子的寿命主要取决于样品及样品预处理 Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. Suite 601,No.196 New Jinqiao Road, Shanghai,201206,China (tel) (fax)

A5284 Protein A40 Plus 亲和层析预装柱使用说明专业实验仪器耗材提供商

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